阮朝列，陳洪波，張澤珩，雍國(guó)勝，劉伯川，趙紅玲，陳 瑜，劉雙芹，廖國(guó)陽，李衛(wèi)東，周 健

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118)

基于細(xì)胞培養(yǎng)的生命科學(xué)與生物制品行業(yè)在當(dāng)今已經(jīng)得到了廣泛的發(fā)展與應(yīng)用[1].通過大量的細(xì)胞培養(yǎng)，可以有針對(duì)性、大規(guī)模、快速地生產(chǎn)各類生物制品[2].細(xì)胞傳代是細(xì)胞培養(yǎng)中必不可缺的環(huán)節(jié)，對(duì)于貼壁細(xì)胞而言，根據(jù)每種細(xì)胞的類型和其生長(zhǎng)特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?dāng)細(xì)胞密度達(dá)到傳代要求時(shí)就要進(jìn)行傳代操作.細(xì)胞傳代一般使用胰蛋白酶消化細(xì)胞使得細(xì)胞間的粘附蛋白（如膠原蛋白、鈣粘蛋白、纖連蛋白、整連蛋白等）降解，從而使細(xì)胞分開.胰蛋白酶一般分離于動(dòng)物的胰腺組織，目前最常用的胰蛋白酶大多來源于豬胰腺.一方面，不同來源的胰蛋白酶對(duì)于不同的細(xì)胞作用效果是不一樣的，且胰蛋白酶的活性與其種類、濃度、作用時(shí)間、溫度等都有關(guān).Vero 細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）和KMB-17 細(xì)胞（人二倍體細(xì)胞）作為生物制品行業(yè)長(zhǎng)期以來的“明星”細(xì)胞，特別對(duì)于疫苗行業(yè)來說，它們用于狂犬疫苗、新冠疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、腸道病毒疫苗等疫苗的生產(chǎn)[3].因此，研究胰蛋白酶對(duì)Vero 細(xì)胞和KMB-17 細(xì)胞的消化效果很有必要.另一方面，出于對(duì)伊斯蘭國(guó)家及人群信仰的尊重，生產(chǎn)出滿足Halal（清真）驗(yàn)證的疫苗是生物制品中不可忽視的一個(gè)環(huán)節(jié)，這就使得傳統(tǒng)來源于豬的胰蛋白酶將不得使用[4-5].來源于牛胰腺組織的胰蛋白酶和非動(dòng)物源的合成消化酶TrypLE 在市場(chǎng)上也得到了充分的應(yīng)用[6]，這就為我們尋求豬源胰蛋白酶的替代品提供了可能.

本研究比較了市面上常用的4 種消化酶消化Vero 細(xì)胞和KMB-17 細(xì)胞的效果.選擇1 種傳統(tǒng)的來源于豬的胰蛋白酶、2 種來源于牛的胰蛋白酶和合成的消化酶TrypLE，試圖探尋培養(yǎng)細(xì)胞的最佳消化工藝和Halal（清真）驗(yàn)證中關(guān)于豬源胰蛋白酶的替代問題，以期為以細(xì)胞傳代培養(yǎng)為基礎(chǔ)的生物制品行業(yè)的發(fā)展提供借鑒.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞Vero 細(xì)胞購(gòu)自歐洲動(dòng)物細(xì)胞收藏中心（ECACC，編號(hào)03129010），傳至141 代制成工作種子庫，由本實(shí)驗(yàn)室保存.KMB-17 細(xì)胞（人胚肺二倍體細(xì)胞），中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，工作代數(shù)30 代.

1.2 主要試劑及儀器MEM 培養(yǎng)基（KMB-17 細(xì)胞用）、DMEM 培養(yǎng)基（Vero 細(xì)胞用）、0.01 mol/L PBS 溶液和豬源胰酶（配制后活力為1 451.25 U/mL）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供.新生牛血清購(gòu)于蘭州民海生物工程有限公司.牛源胰酶-1干粉（貨號(hào)T9935，批號(hào)SLBZ0316，活力13 164 U/mg）、牛源胰酶-2 干粉（貨號(hào)T9935，批號(hào)SLBR5744V，活力4 508 U/mg）購(gòu)于SIGMA 公司.兩種牛源胰酶溶解后，牛源胰酶-1 活力為1 462.67 U/mL，牛源胰酶-2 活力為1 502 U/mL，3 種動(dòng)物源胰酶溶液均添加EDTA-Na2至終質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL，pH 均為7.6.全合成胰蛋白酶TrypLE 試劑（貨號(hào)12605010）購(gòu)于Thermo Fisher Scientific 公司；Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自上海睿玨生物科技有限公司.CCK-8 試劑盒購(gòu)自碧云天公司，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和毒性.96 孔板；6 孔板；T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶；酶標(biāo)儀；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱.

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及消化細(xì)胞復(fù)蘇后傳代至12 個(gè)T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞生長(zhǎng)成致密單層后，隨機(jī)每3 瓶（n=3）為一個(gè)實(shí)驗(yàn)組，共4 組.每組用0.01 mol/L 的PBS 洗去殘留培養(yǎng)基后分別加入5 mL 的豬源胰酶、牛源胰酶-1、牛源胰酶-2 和全合成胰蛋白酶TrypLE 浸潤(rùn)30 s 后棄去，置37 ℃溫箱繼續(xù)消化，直至顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓脫落并出現(xiàn)細(xì)胞斷裂現(xiàn)象時(shí)，加入5 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，統(tǒng)計(jì)消化時(shí)間.反復(fù)吹吸使細(xì)胞分散，混勻后吸取稀釋后的細(xì)胞懸液用Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞密度及細(xì)胞活率.

1.4 細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)與生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分別將每組消化下來的細(xì)胞稀釋至2×105mL?1，接種至96孔板和6 孔板繼續(xù)培養(yǎng).96 孔板每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，共接種5 塊板，每塊板含4 種不同酶消化的細(xì)胞，每種酶消化的細(xì)胞共8 個(gè)孔（n=8），培養(yǎng)至12、24、48、72、96 h 后取出加入CCK-8 試劑孵育1 h，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（450 nm）用于評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖和毒性.6 孔板每孔接種2.5 mL 細(xì)胞懸液，共接種10 塊板，每種酶消化的細(xì)胞各3 個(gè)孔（n=3），培養(yǎng)至24、48、96、120、144 h 后取出用0.125%豬源胰酶消化細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞密度和活率.

1.5 重復(fù)性驗(yàn)證采用篩選出的最優(yōu)消化條件對(duì)T25 瓶培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，傳代培養(yǎng)96 h 后統(tǒng)一用豬源胰酶消化細(xì)胞后檢測(cè)活細(xì)胞密度，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行10 次(n=10)，計(jì)算10 次實(shí)驗(yàn)活細(xì)胞密度的變異系數(shù)CV（coefficient of variation，%），用于評(píng)價(jià)消化酶在多次實(shí)驗(yàn)中的重復(fù)性和穩(wěn)定性，CV=（標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值）×100%.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Prism 8 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同胰蛋白酶組間采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析（F檢驗(yàn)），以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 標(biāo)*，P<0.01 標(biāo)**，P<0.001 標(biāo)***，P<0.000 1 標(biāo)****）.

2 結(jié)果

2.1 消化酶種類和細(xì)胞類型對(duì)消化效果的影響細(xì)胞的消化差異以細(xì)胞活率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo).組間t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，消化酶的種類對(duì)消化作用存在影響.在Vero 細(xì)胞消化實(shí)驗(yàn)中，豬源胰酶與牛源胰酶-1、牛源胰酶-2、TrypLE 的消化能力存在顯著差異；牛源胰酶-1 與牛源胰酶-2 消化能力無顯著差異；牛源胰酶-1 與TrypLE 消化能力有顯著差異，牛源胰酶-2 與TrypLE 消化能力有顯著差異（圖1（a））.TrypLE 消化Vero 細(xì)胞活率為88.85%(表1).在KMB-17 細(xì)胞消化實(shí)驗(yàn)中，消化酶的種類對(duì)KMB-17 細(xì)胞消化能力均無顯著差異（圖1（b）），消化后平均細(xì)胞活率均大于98%(表1).值得注意的是，4種胰蛋白酶消化Vero 細(xì)胞和KMB-17 細(xì)胞的平均消化時(shí)間存在顯著差異（圖1（c）、（d）），但消化時(shí)間與細(xì)胞活率之間并不直接相關(guān)，說明相同的活力單位下不同來源的消化酶對(duì)不同的細(xì)胞的消化能力和對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制是不一樣的.

表1 不同種類消化酶消化Vero 細(xì)胞和KMB-17 細(xì)胞效果(n=3)Tab.1 Effect of different digestive enzymes on Vero cells and KMB-17 cells (n=3)

圖1 不同種類消化酶消化Vero 細(xì)胞和KMB-17 細(xì)胞效果對(duì)比Fig.1 Comparison of digestion effects of different digestive enzymes on Vero cells and KMB-17 cells

2.2 胰蛋白酶的種類對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響細(xì)胞經(jīng)不同的胰蛋白酶消化后接種至96 孔板中，采用相同條件培養(yǎng)至不同時(shí)間后用CCK-8 試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖和毒性.單因素方差分析（F檢驗(yàn)）結(jié)果表明胰蛋白酶的種類對(duì)于細(xì)胞增殖和毒性有影響.Vero 細(xì)胞在4 種胰蛋白酶消化后培養(yǎng)12 h 表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖和毒性差異（圖2（a））.隨著時(shí)間的延長(zhǎng)差異越明顯，其中牛源胰酶-2 在24 h 后即表現(xiàn)出與其他3 種胰酶明顯的差異，說明牛源胰酶-2 對(duì)于Vero 細(xì)胞的增殖和毒性影響最大；豬源胰酶和牛源胰酶-1 在各階段未表現(xiàn)出顯著差異.全合成胰酶TrypLE 雖然在消化Vero 細(xì)胞后細(xì)胞活率小于90%（88.4%），但其對(duì)Vero 細(xì)胞的增殖和毒性影響卻最小.說明牛源胰酶-1 和TrypLE 均可作為候選胰酶用于Vero 細(xì)胞的消化.KMB-17 細(xì)胞在24 h 內(nèi)均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖活力差異（圖3）.48 h 之后牛源胰酶-2 相對(duì)于其他3 種胰酶來說對(duì)細(xì)胞增殖和毒性的影響最小，說明牛源胰酶-2 消化的KMB-17 細(xì)胞的效果好.

2.3 不同胰蛋白酶消化傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)細(xì)胞經(jīng)不同的胰蛋白酶消化后傳代至6 孔板中按相同的條件進(jìn)行培養(yǎng)，并繪制生長(zhǎng)曲線.從Vero 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖4）可見，相較于TrypTE，使用豬源胰酶、牛源胰酶-1 和牛源胰酶-2 消化Vero 細(xì)胞在一定程度上延長(zhǎng)了細(xì)胞生長(zhǎng)的潛伏期，這與細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)結(jié)果一致（圖2）.與Vero 不同的是，KMB-17 細(xì)胞經(jīng)牛源胰酶-1 和TrypTE 消化后細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)達(dá)72 h（圖5），這與細(xì)胞增殖活力檢測(cè)結(jié)果一致（圖3）.細(xì)胞培養(yǎng)至144 h 后，經(jīng)豬源胰酶、牛源胰酶-1 和TrypLE 消化后的Vero 細(xì)胞密度相對(duì)牛源胰酶-2 高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6（a））.豬源胰酶和牛源胰酶-2 消化后的KMB-17 細(xì)胞活細(xì)胞密度最高，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與豬源胰酶和牛源胰酶-2 相比較TrypLE 消化KMB-17 細(xì)胞活細(xì)胞密度最低，其次是牛源胰酶-2（圖6（b）），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

圖2 不同種類消化酶消化Vero 細(xì)胞各階段增殖活力對(duì)比（n=8）Fig.2 Comparison of the proliferation activity of Vero cells in different stages of digestion with different digestive enzymes (n=8)

圖3 不同種類消化酶消化KMB-17 細(xì)胞各階段增殖活力對(duì)比（n=8）Fig.3 Comparison of the proliferation activity of KMB-17 cells in different stages of digestion with different digestive enzymes (n=8)

圖4 不同胰蛋白酶消化傳代后Vero 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)（n=3）Fig.4 Growth dynamics of Vero cells after different trypsin digestion and passage（n=3）

圖5 不同胰蛋白酶消化傳代后KMB-17 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)（n=3）Fig.5 Growth dynamics of KMB-17 cells after different trypsin digestion and passage（n=3）

圖6 不同胰蛋白酶消化Vero 細(xì)胞和KMB-17 細(xì)胞傳代后144 h 活細(xì)胞密度對(duì)比Fig.6 Comparison of live cell density at 144 h after passage of Vero cells and KMB-17 cells digested by different trypsin

此外，如圖7 和8 所示，細(xì)胞經(jīng)不同的胰蛋白酶消化后不同時(shí)間進(jìn)行顯微鏡拍照記錄，肉眼沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞形態(tài)差異.

圖7 Vero 細(xì)胞消化后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)Fig.7 The morphology of Vero cells at different time points after digestion

2.4 重復(fù)性驗(yàn)證綜上，對(duì)于Vero 細(xì)胞的消化可選擇牛源胰酶-1、TrypLE；KMB-17 細(xì)胞可選擇牛源胰酶-2 作為豬源胰酶的替代.10 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，Vero 細(xì)胞經(jīng)豬源胰酶、牛源胰酶-1 和TrypLE消化培養(yǎng)96 h 后所獲活細(xì)胞密度的CV 分別為1.08%、1.12%、1.22%（表2），表明使用豬源胰酶、牛源胰酶-1 和TrypLE 消化Vero 細(xì)胞重復(fù)性好.KMB-17 細(xì)胞經(jīng)豬源胰酶和牛源胰酶-2 消化培養(yǎng)96 h 后所獲活細(xì)胞密度的CV 分別為1.15%、1.04%（表2），表明使用豬源胰酶和牛源胰酶-2 消化KMB-17 細(xì)胞重復(fù)性較好.

表2 消化傳代Vero 細(xì)胞和KMB-17 細(xì)胞細(xì)胞密度重復(fù)性驗(yàn)證Tab.2 Validation of cell density repeatability of digestive passage Vero cells and KMB-17 cells

3 討論

本研究比較了在相同活力單位下豬源胰酶、牛源胰酶-1、牛源胰酶-2 和TrypLE 消化Vero 細(xì)胞和KMB-17 細(xì)胞的差異.通過消化后傳代培養(yǎng)，利用CCK-8 試劑檢測(cè)細(xì)胞在不同階段的增殖和毒性，并且利用Countstar 自動(dòng)細(xì)胞熒光計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量和活率的檢測(cè)，保證了數(shù)據(jù)的可靠性.

結(jié)果顯示，在幾乎相同的胰酶活力下（豬源胰酶活力為1 451.25 U/mL、牛源胰酶-1 活力為1 462.67 U/mL，牛源胰酶-2 活力為1 502 U/mL），4 種消化酶對(duì)Vero 細(xì)胞消化效果有顯著差異，對(duì)KMB-17細(xì)胞無顯著差異.Vero 細(xì)胞消化實(shí)驗(yàn)中，豬源胰酶對(duì)其他3 種消化酶的消化能力有顯著差異.另外，4 種消化酶消化Vero 細(xì)胞和KMB-17 細(xì)胞的平均消化時(shí)間均存在顯著差異，但消化時(shí)間與細(xì)胞活率之間并不直接相關(guān),與不同胰酶作用位點(diǎn)的差異有關(guān).經(jīng)TrypLE 消化后的Vero 細(xì)胞活率較低,有研究顯示，殘留的TrypLE 損害了細(xì)胞附著與生長(zhǎng)[7].同樣地，Umegaki 等[8]研究了胰蛋白酶對(duì)人類角蛋白細(xì)胞生長(zhǎng)的影響表明TrypLE 會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞密度下降，但不影響細(xì)胞活性，這與我們的結(jié)果一致.

其次，消化酶的種類對(duì)Vero 細(xì)胞和KMB-17細(xì)胞的增殖活力和細(xì)胞毒性是有影響的，且不同時(shí)間對(duì)不同細(xì)胞影響不同.4 種胰蛋白酶在消化后12 h對(duì)Vero 細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖和毒性差異，這種差異隨著時(shí)間的延長(zhǎng)越明顯，說明胰蛋白酶會(huì)損害細(xì)胞的生長(zhǎng)，與Rourou 等[7]研究結(jié)果一致.有意思的是，全合成胰酶TrypLE 雖然在消化Vero 細(xì)胞后細(xì)胞活率小于90%（88.4%），從10 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)來看TrypLE 的確會(huì)降低細(xì)胞密度，但對(duì)Vero 細(xì)胞的增殖和毒性影響最小，與Umegaki 等[8]的研究結(jié)果一致.總的來說，牛源胰酶-2 對(duì)于Vero 細(xì)胞的增殖和毒性影響最大，TrypLE 影響最小.對(duì)于KMB-17細(xì)胞來說，4 種胰酶消化后24 h 內(nèi)均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖和毒性差異，48 h 之后就表現(xiàn)出了明顯的差異，其中牛源胰酶-2 在48 h 之后相對(duì)于其他3 種胰酶來說對(duì)細(xì)胞增殖和毒性的影響最小.另外，不同胰蛋白酶消化傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)結(jié)果也與增殖和毒性的結(jié)果相吻合.值得注意的是，使用不同胰酶消化細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的影響表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞潛伏期的延長(zhǎng)，推測(cè)是消化酶損傷了細(xì)胞表面的蛋白或其他，因此細(xì)胞需要更長(zhǎng)的潛伏期來修復(fù)和進(jìn)行復(fù)制物質(zhì)的準(zhǔn)備.

最后，經(jīng)過10 次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們確定Vero細(xì)胞經(jīng)豬源胰酶、牛源胰酶-1 和TrypLE 消化培養(yǎng)96 h 后所獲活細(xì)胞密度的CV 分別為1.08%、1.12%、1.22%，重復(fù)性好；KMB-17 細(xì)胞經(jīng)豬源胰酶和牛源胰酶-2 消化培養(yǎng)96 h 后所獲活細(xì)胞密度的CV 分別為1.12%、1.14%，重復(fù)性好.為尊重全球伊斯蘭國(guó)家及人群的信仰，藥物的Halal（清真）狀態(tài)可確保該產(chǎn)品不含豬肉或其他禁止的成分[9].與此類似的還有猶太教，也禁止食用豬肉和其他衍生物[10-11].因此，在以常規(guī)豬源胰蛋白酶消化細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的生物制品行業(yè)中，來源于豬的胰蛋白酶將不得使用[4-5].一方面，全球1/4 且不斷增長(zhǎng)的穆斯林人群對(duì)生物制品尤其是疫苗的需求量是極其巨大[5].另一方面，在生物制品行業(yè)潛在的利潤(rùn)豐厚的驅(qū)動(dòng)下，許多制藥公司和國(guó)家都試圖提出清真疫苗和建立清真藥品標(biāo)準(zhǔn)，例如諾華公司和馬來西亞等.我們的結(jié)果表明，Halal（清真）驗(yàn)證中可使用牛源胰酶-1 和TrypLE 替代豬源胰酶消化Vero 細(xì)胞，消化KMB-17 可使用牛源胰酶-2 替代豬源胰酶.

圖8 KMB-17 細(xì)胞消化后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)Fig.8 The morphology of KMB-17 cells at different time points after digestion