方冰倩,王亞楠,劉琰,王嚇長(zhǎng),康迪,胡立宏

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省中藥功效物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物,具有祛風(fēng)除濕,通絡(luò)止痛的功效[1]?；诶坠俑崛∥镏瞥傻睦坠俣嘬掌谥嗅t(yī)藥臨床實(shí)踐中應(yīng)用廣泛,可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎[2-3]、慢性腎炎[4-6]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[7-8]等自身免疫性疾病的治療。近年來(lái)其適應(yīng)癥不斷擴(kuò)大,研究發(fā)現(xiàn)雷公藤制劑具有廣譜的抗腫瘤活性,可以抑制多種不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞增殖,在抗腫瘤領(lǐng)域顯示了獨(dú)特的療效[9-10]。然而,高劑量的雷公藤誘發(fā)多組織器官的毒副作用制約了其在臨床中的應(yīng)用與相關(guān)制劑的研發(fā)[11-12]。

雷公藤中的化學(xué)成分復(fù)雜多樣,迄今為止,已經(jīng)報(bào)道的該屬化合物單體達(dá)400多種,主要成分有生物堿類、二萜類、三萜類等[13-14]。目前有100多種單體化合物被證實(shí)具有生物活性,以二萜類雷公藤甲素(Triptolide,TP)與三萜類雷公藤紅素(Celastrol,Cel)為代表[14-15]。其中,Cel是最早被分離出來(lái)的活性成分,可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等多種途徑發(fā)揮抗炎與抗腫瘤等多種藥理作用[16-18]。TP是從雷公藤中提取出的最具代表性的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物。自1972年首次分離以來(lái),TP在近60株不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出良好的抗增殖活性[9,19]。然而,TP既是藥效成分,又是毒性成分,其對(duì)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(Transcription factor IIH,TFIIH)中人著色性干皮病B(Xeroderma pigmentosum group B,XPB)的ATP酶活性的抑制導(dǎo)致其毒副作用不可避免[20]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系對(duì)TP敏感性不同。其中,單核細(xì)胞來(lái)源的急性髓系白血病細(xì)胞對(duì)TP較敏感,TP作用48 h的半數(shù)抑制濃度(The half maximal inhibitory concentration,IC50)可達(dá)到10 nmol·L-1以下;體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明TP在25 μg·kg-1·d-1的腹腔注射劑量下可以有效抑制異種移植瘤的生長(zhǎng)[19]。目前全球科研機(jī)構(gòu)正在積極開(kāi)展TP前藥治療白血病的臨床研究[21-22]。

雷公藤多苷片是目前使用較廣泛的雷公藤制劑,主要應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的治療,臨床上尚未能應(yīng)用于抗腫瘤,同時(shí)針對(duì)抗白血病的作用鮮有報(bào)道[8,23-24]。本研究通過(guò)尋找雷公藤多苷片敏感的血液腫瘤細(xì)胞株,在敏感瘤株的異種移植瘤模型上進(jìn)行雷公藤多苷片體內(nèi)活性驗(yàn)證;進(jìn)一步對(duì)自制雷公藤多苷片提取物中的化合物進(jìn)行系統(tǒng)分離,然后對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞水平上的活性評(píng)價(jià);最后通過(guò)制備液相定向敲除雷公藤多苷片以及自制雷公藤多苷片提取物中的TP,考察其細(xì)胞毒活性的變化。旨在發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷片的敏感瘤株并驗(yàn)證雷公藤多苷片發(fā)揮抗人急性單核細(xì)胞白血病(Acute monocytic leukemia,AMOL)作用的物質(zhì)基礎(chǔ),為擴(kuò)大雷公藤多苷片的臨床適應(yīng)癥和提升質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 藥物

雷公藤藥材,產(chǎn)地云南(批號(hào):20210125)，楚雄千草藥王谷農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;TP(批號(hào):ST02050120)和Cel(批號(hào):ST07880120),上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司;柔紅霉素鹽酸鹽(Daunorubicin Hydrochloride,DNR,批號(hào):HY-13062),南京邁博生物科技有限公司;雷公藤多苷片(不同廠家雷公藤多苷片均購(gòu)自于南京市各大藥店);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,貨號(hào):C104984),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 細(xì)胞株

AMOL細(xì)胞MV-4-11(貨號(hào):CRL-9591),人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL-10(貨號(hào):CBP60560),購(gòu)自ATCC;AMOL細(xì)胞SHI-1、人急性原粒細(xì)胞白血病細(xì)胞Kasumi-1、人慢性髓原白血病細(xì)胞K562,江蘇省中醫(yī)院贈(zèng);人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞系HK2、人正常肝細(xì)胞系L02,中國(guó)藥科大學(xué)贈(zèng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c裸鼠,雌雄各半,4～6周齡,18～22 g,購(gòu)于南京集萃藥康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0008。將其飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無(wú)病原體的屏障環(huán)境內(nèi),12 h/12 h光暗照明,自由飲食飲水,環(huán)境溫度在20～26 ℃,濕度在40%～70%,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)執(zhí)行并批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批準(zhǔn)編號(hào):202111A008。

1.4 試劑與儀器

細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(CCK-8,貨號(hào):A311-02),購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;胎牛血清(FBS,貨號(hào):10091148)、RPMI1640培養(yǎng)基(貨號(hào):C11875500BT)、青霉素/鏈霉素(P/S,貨號(hào):15140112),購(gòu)自Gibco;IMDM培養(yǎng)基(貨號(hào):lw-SH30228.01),購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;巰基還原劑(β-巰基乙醇,貨號(hào):M8210),購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

電子分析天平(Mettler Toledo,型號(hào):MS105);酶標(biāo)儀(Tecan,型號(hào):Infinite 200 pro);純水儀(Merck millipore,型號(hào):Milli-Q Direct8);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi,型號(hào):Buchi R-100);冷卻水循環(huán)裝置(EYELA,型號(hào):CA-1116A);核磁共振波譜儀(Bruker,型號(hào):BrukerAV500);液相色譜儀(Waters,型號(hào):e2695-2998);制備液相色譜儀(Waters,型號(hào):1525);液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(Agilent,型號(hào):Agilent1290-6120)。

2 方法

2.1 雷公藤的提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 藥材提取 為保證實(shí)驗(yàn)用樣品的一致性,本研究按照制備雷公藤多苷片提取物的制備工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用樣品制備,簡(jiǎn)稱雷公藤多苷片提取物[25]:取云南產(chǎn)雷公藤藥材10 kg,粉碎后加95%乙醇超聲提取3次(40 ℃、40 min,物料比為1∶7、1∶6、1∶6),過(guò)濾,收集濾液,將濾液濃縮至無(wú)醇味,將濃縮液倒入5 L分液漏斗中,每次加入1 L乙酸乙酯進(jìn)行萃取,直至乙酸乙酯萃取液接近無(wú)色,濃縮并干燥得到浸膏208 g。

2.1.2 化合物分離和結(jié)構(gòu)鑒定 將浸膏(208 g)進(jìn)行硅膠柱層析,石油醚∶乙酸乙酯(10∶1～0∶1)梯度洗脫,得到8個(gè)流分X1～X8。對(duì)活性較好的組分X4、X6、X7和X8進(jìn)行系統(tǒng)分離，綜合運(yùn)用質(zhì)譜和核磁共振波譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合文獻(xiàn)鑒定了15個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，分別為雷酚內(nèi)酯(Triptophnolide，1)、異雷酚新內(nèi)酯(Isoneotriptophenolide,2)、雷酚萜醇(Triptonoterpenol，3)、Triptobenzene J(4)、TP(5)、雷公藤晉堿(Wilforgine，6)、雷公藤定堿(Wilfordine，7)、雷公藤次堿(Wilforine，8)、雷公藤春堿(Wilfortrine，9)、雷公藤新堿(Euonine，10)、Peritassine A(11)、Cel(12)、雷公藤酚A(Wilforol A，13)、雷公藤三萜酸A(Triptotriterpenic acid A，14)和23-Nor-6-oxodemethylpristimerol(15),具體分離過(guò)程如下。

流分X4(13.3 g)經(jīng)MCI柱色譜分離,甲醇/水梯度洗脫,得到3個(gè)亞組分X4-1～3,亞組分X4-1(1.2 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜和制備液相(45%乙腈/水)得到化合物1(24 mg)、化合物2(10 mg)、化合物3(2 mg)。

流分X6(4.3 g)經(jīng)MCI柱色譜分離,甲醇/水梯度洗脫,得到7個(gè)亞組分X6-1～7,亞組分X6-2(215 mg)經(jīng)制備液相(20%乙腈/水)得到化合物5(5 mg),亞組分X6-4(726 mg)經(jīng)硅膠柱色譜分離,石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫,得到化合物4(5 mg)。

流分X7(49.0 g)采用硅膠柱分離,經(jīng)石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫得到4個(gè)亞組分X7-1～4。亞組分X7-1(28.6 g)經(jīng)MCI柱色譜分離,甲醇/水梯度洗脫,得到4個(gè)亞組分X7-1-1～4,亞組分X7-1-3(5.1 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)洗脫,得到亞組分X7-1-3-1～7,亞組分X7-1-3-1(479 mg)經(jīng)制備液相(50%乙腈/水等度洗脫)得到化合物14(8 mg),亞組分X7-1-3-2(51 mg)經(jīng)制備液相(60%乙腈/水)得到化合物15(8 mg)和化合物13(2 mg)。亞組分X7-1-4(217 mg)經(jīng)硅膠柱色譜和Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)洗脫,得到化合物12(4 mg)。亞組分X7-2(9.8 g)經(jīng)MCI柱色譜分離,甲醇/水梯度洗脫,得到2個(gè)亞組分X7-2-1～2,亞組分X7-2-2(2.1 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)和中性氧化鋁柱色譜(石油醚/乙酸乙酯梯度)洗脫得到亞組分X7-2-2-1-1(818 mg),再經(jīng)制備液相(43%乙腈/水)得到化合物8(3 mg)。

流分X8(21.0 g)經(jīng)MCI柱色譜分離,甲醇/水梯度洗脫,經(jīng)高效液相合并得到3個(gè)組分X8-1～3,組分X8-1(7.9 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)洗脫,得到亞組分X8-1-1～3,亞組分X8-1-1(1.3 g)經(jīng)制備液相(38%乙腈/水)得到化合物9(22 mg)、化合物10(12 mg);亞組分X8-1-2(3.8 g)經(jīng)MCI柱色譜和制備液相得到化合物11(25 mg)。亞組分X8-2(3.1 g)經(jīng)中性氧化鋁柱色譜,石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫,得到亞組分X8-2-1～3,亞組分X8-2-1(216 mg)經(jīng)制備液相(43%乙腈/水)得到化合物6(14 mg);亞組分X8-2-2(140 mg)經(jīng)制備液相(40%乙腈/水)得到化合物7(4 mg)。

2.2 CCK8法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性

2.2.1 樣品溶液的制備 雷公藤多苷片測(cè)試溶液的制備:每個(gè)廠家取雷公藤多苷片20片,研成粉末,稱定質(zhì)量,稱取1.0 g,置100 mL具塞錐形瓶中,加入50 mL乙酸乙酯,40 ℃超聲處理(功率400 W,頻率40 kHz)30 min,過(guò)濾,濾液蒸干,稱定質(zhì)量,加二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)后振蕩10 s溶解,配成雷公藤多苷片測(cè)試溶液。

單體化合物溶液的制備:稱取一定量的化合物,加DMSO后振蕩10 s溶解,配成25 mg·mL-1母液。將母液稀釋1 000倍使其為25 μg·mL-1,再依次5倍稀釋使其分別為5 μg·mL-1和1 μg·mL-1,振蕩10 s使其溶解,置于-20 ℃冰箱低溫保存。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) MV-4-11細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中,并添加有1%P/S及0.05 mmol·L-1β-巰基乙醇;SU-DHL-10、K562、Kasumi-1及SHI-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640培養(yǎng)基中;HK2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中;L02細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中。

2.2.3 細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù),根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果從培養(yǎng)皿中取出所需體積的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管里,1 200 r·min-1離心3 min,用真空泵吸走上清,并以培養(yǎng)基重懸。將不同濃度的藥物和細(xì)胞按照1∶1體積比混勻后加入100 μL于96孔板中。96孔板置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)48 h,并提前2 h在每孔加入10 μL CCK8,利用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)。細(xì)胞增殖抑制率=100%-(A給藥-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。

2.3 雷公藤多苷片對(duì)異種移植瘤裸鼠的抗腫瘤活性

2.3.1 異種移植瘤裸鼠的模型構(gòu)建 將BALB/c裸鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MV-4-11細(xì)胞重懸于IMDM和Matrigel(1∶1)混合液中,計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×107mL-1,以每只100 μL注射于小鼠右側(cè)腋窩皮下,待腫瘤長(zhǎng)至100～300 mm3用于試驗(yàn)。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥 采用隨機(jī)區(qū)組法把荷瘤小鼠分成4組,每組5只,分別為:①溶劑對(duì)照(0.5%CMC-Na)組;②雷公藤多苷片10 mg·kg-1組;③雷公藤多苷片20 mg·kg-1組;④雷公藤多苷片30 mg·kg-1組。配藥方法:將雷公藤多苷片研磨粉碎后,加入0.5%CMC-Na混懸,并稀釋到所需濃度。試驗(yàn)期間,每天灌胃給藥,給藥體積為10 mL·kg-1,連續(xù)給藥15 d,每天記錄小鼠腫瘤體積和體質(zhì)量。

2.4 TP定向敲除實(shí)驗(yàn)

2.4.1 對(duì)照樣品溶液的制備 精密稱取TP或Cel對(duì)照品適量,加甲醇制成50 μg·L-1的溶液,濾過(guò),即得。

2.4.2 色譜條件 Poroshell 120 C18色譜柱(3 mm×150 mm,2.7 μm);以水為流動(dòng)相A,乙腈為流動(dòng)相B,柱溫為30 ℃;流速為0.2 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm;進(jìn)樣量:20 μL。梯度條件見(jiàn)表1。TP的保留時(shí)間為8.5 min。

表1 TP定向敲除色譜條件

2.4.3 TP的定向敲除 取雷公藤多苷片提取物溶液和雷公藤多苷片溶液,進(jìn)樣液相色譜,接收TP的出峰位置溶液,其余流分合并,蒸干,即得TP敲除樣品。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 雷公藤多苷片提取物對(duì)不同來(lái)源腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

體外CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雷公藤多苷片提取物可以顯著抑制血液腫瘤細(xì)胞的增殖。其中,雷公藤多苷片提取物在單核細(xì)胞來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系SHI-1及MV-4-11中作用48 h的IC50小于3 μg·mL-1,抑制活性強(qiáng)于其在非單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株中的作用(表2)。

表2 雷公藤多苷片提取物作用于不同腫瘤細(xì)胞系48 h的IC50值

3.2 雷公藤多苷片體外和體內(nèi)抗急性單核細(xì)胞白血病的活性

進(jìn)一步考察不同廠家的雷公藤多苷片對(duì)腫瘤細(xì)胞MV-4-11的增殖影響。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雷公藤多苷片與雷公藤多苷片提取物的活性相當(dāng),可顯著抑制血液腫瘤細(xì)胞的增殖;其中,廠家1(浙江得恩德制藥股份有限公司)與廠家2(江蘇美通制藥有限公司)雷公藤多苷片活性較強(qiáng),作用48 h的IC50分別為(3.33±0.01)μg·mL-1和(3.57±0.10)μg·mL-1(表3)。

表3 不同廠家雷公藤多苷片作用MV-4-11細(xì)胞48 h的IC50值

選取廠家1的雷公藤多苷片考察其對(duì)體內(nèi)皮下異種移植瘤的抑制作用。與對(duì)照組相比,雷公藤多苷片各劑量組均可使皮下移植瘤的體積顯著減小(P<0.05，P<0.001),小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化。終末給藥結(jié)束后,對(duì)腫瘤進(jìn)行稱質(zhì)量,雷公藤多苷片各劑量組可使瘤質(zhì)量顯著下降(P<0.01，P<0.001),抑瘤率分別為35.79%、96.93%、97.56%(圖3)。其中,雷公藤多苷片中、高劑量組對(duì)腫瘤抑制作用的劑量依賴性不高,原因可能與雷公藤多苷片的溶解性較差有關(guān)。體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雷公藤多苷片具有顯著的抗AMOL作用(圖1)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。

3.3 雷公藤多苷片提取物中單體化合物的活性跟蹤

3.3.1 雷公藤多苷片提取物不同流分的活性篩選 考慮各廠家雷公藤多苷片的制備方法不同,活性成分的含量存在差異,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,本研究將自制的雷公藤多苷片提取物進(jìn)行系統(tǒng)成分分離,并在細(xì)胞水平上對(duì)得到的單體化合物進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。首先我們通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)對(duì)雷公藤多苷片提取物的8個(gè)流分進(jìn)行活性篩選,其中X1與X2兩個(gè)流分因極性較小,溶解性差,無(wú)法得到有效的活性篩選數(shù)據(jù)。X3～X8的活性篩選結(jié)果表明流分X6及X7的活性較強(qiáng),在1 μg·mL-1的濃度下抑制率可達(dá)到90.23%及89.37%(表4)。

表4 雷公藤多苷片提取物的不同流分對(duì)MV-4-11細(xì)胞的增殖抑制率

3.3.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定 采用色譜分離技術(shù),從活性較強(qiáng)的流分X4、X6、X7與X8中分離鑒定了15個(gè)化合物,包括5個(gè)二萜類(1～5)、6個(gè)倍半萜大環(huán)內(nèi)酯生物堿類(6～11)和4個(gè)三萜類(12～15),具體如下:

化合物1：白色固體，C20H24O3，(+)-ESI-MSm/z：313.2[M+H]+;(-)-ESI-MSm/z:311.2[M-H]-。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：1.72(1H，m，H-1a)，2.52(1H，m，H-1b)，2.41(1H，m，H-2a)，2.56(1H，m，H-2b)，2.73(1H，m，H-5)，1.96(1H，m，H-6a)，2.03(1H，m，H-6b)，2.84(1H，m，H-7a)，2.94(1H，m，H-7b)，6.98(1H，d，J=8.0 Hz，H-11)，7.10(1H，d，J=8.0 Hz，H-12)，3.13(1H，m，H-15)，1.28，1.29(各3H，d，J=7.0 Hz，H-16，17)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：32.6(C-1)，18.2(C-2)，162.9(C-3)，125.2(C-4)，40.9(C-5)，19.6(C-6)，22.7(C-7)，120.5(C-8)，143.9(C-9)，36.2(C-10)，116.3(C-11)，123.4(C-12)，131.0(C-13)，150.8(C-14)，27.0(C-15)，22.5(C-16)，22.5(C-17)，174.2(C-18)，70.5(C-19)，22.4(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]一致，故確定化合物為雷酚內(nèi)酯(Triptophnolide)。

化合物2：黃色固體，C21H26O4，(+)-ESI-MSm/z：343.2[M+H]+;(-)-ESI-MSm/z:341.2[M-H]-。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：6.45(1H，s，H-11)，3.70(3H，s，CH3O-14)，3.27(1H，m，H-15)，1.21(6H，d，J=7.0 Hz，H-16，H-17)，4.78(2H，m，H-19)，1.18(3H，s，H-20)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：18.6(C-1)，31.1(C-2)，125.2(C-3)，163.3(C-4)，44.0(C-5)，19.5(C-6)，26.1(C-7)，129.9(C-8)，130.8(C-9)，37.3(C-10)，111.9(C-11)，150.8(C-12)，139.9(C-13)，149.2(C-14)，25.5(C-15)，23.8(C-15)，23.8(C-16)，60.7(C-17)，174.5(C-18)，70.6(C-19)，17.3(C-20)，60.7(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]一致，故確定化合物為異雷酚新內(nèi)酯(Isoneotriptophenolide)

化合物3：無(wú)定型粉末，C21H26O4，(+)-ESI-MSm/z：347.2[M+H]+;(-)-ESI-MSm/z:345.4[M-H]-。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：2.07(1H，m，H-1a)，3.08(1H，m，H-1b)，2.39(1H，m，H-2a)，2.76(1H，dd，J=10.6，4.1 Hz，H-2b)，2.21(1H，brd，H-5)，1.46(1H，dd，J=12.8，4.8 Hz，H-6a)，1.85(1H，m，H-6b)，2.55(1H，m，H-7a)，3.10(1H，m，H-7b)，6.38(1H，s，H-12)，3.67(3H，s，CH3O-14)，3.24(1H，m，H-15)，1.17(6H，d，J=6.8 Hz，H-16，H-17)，1.42(3H，s，H-18)，4.18(1H，d，J=11.4 Hz，H-19)，1.30(3H，s，H-20)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：35.4(C-1)，34.7(C-2)，223.8(C-3)，50.1(C-4)，52.7(C-5)，19.2(C-6)，26.6(C-7)，130.5(C-8)，130.7(C-9)，37.7(C-10)，150.4(C-11)，112.1(C-12)，139.7(C-13)，148.8(C-14)，26.2(C-15)，23.7(C-16)，23.8(C-17)，22.9(C-18)，66.1(C-19)，21.1(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]一致，故確定化合物為雷酚萜醇(Triptonoterpenol)。

化合物4：白色固體，C20H30O3，(+)-ESI-MSm/z：319.2[M+H]+;(-)-ESI-MSm/z:317.2[M-H]-。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：1.55(1H，m，H-1a)，2.35(1H，m，H-1b)，1.91(1H，m，H-2a)，2.02(1H，m，H-2b)，3.52(1H，dd，J=11.8，4.3 Hz，H-3)，1.43(1H，dd，J=12.7，1.9 Hz，H-5)，2.08(1H，m，H-6a)，2.62(1H，m，H-7a)，2.87(1H，m，H-7b)，6.84(1H，d，J=8.0 Hz，H-11)，7.03(1H，d，J=8.0 Hz，H-12)，3.14(1H，sqt，H-15)，1.25(6H，d，J=7.0 Hz，H-16，H-17)，1.34(3H，s，H-18)，3.45(1H，d，J=11.2 Hz，H-19a)，4.34(1H，d，J=11.2 Hz，H-19b)，1.18(3H，s，H-20)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：36.9(C-1)，28.5(C-2)，80.6(C-3)，42.8(C-4)，50.0(C-5)，18.3(C-6)，25.0(C-7)，120.4(C-8)，147.7(C-9)，37.1(C-10)，116.6(C-11)，123.5(C-12)，130.3(C-13)，150.2(C-14)，26.9(C-15)，22.5(C-16)，22.5(C-17)，22.7(C-18)，64.1(C-19)，25.8(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]一致，故確定化合物為Triptobenzene J。

化合物5：白色固體，C20H24O6，(+)-ESI-MSm/z：361.2[M+H]+;(-)-ESI-MSm/z:359.2[M-H]-。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：1.24(1H，m，H-1a)，1.59(1H，m，H-1b)，1.99(1H，t，J=12.8 Hz，H-2a)，2.22(1H，m，H-2b)，2.75(1H，brd，J=13.2 Hz，H-5)，2.35(1H，m，H-6a)，2.14(1H，m，H-6b)，3.40(1H，d，J=5.2 Hz，H-7)，3.93(1H，d，J=3.2 Hz，H-11)，3.54(1H，d，J=2.8 Hz，H-12)，3.44(1H，d，J=6.4 Hz，H-14)，0.91(1H，d，J=7.2 Hz，H-16)，1.03(1H，d，J=6.8 Hz，H-17)，4.70(2H，m，H-19)，1.14(1H，s，H-20)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：17.0(C-1)，29.7(C-2)，125.4(C-3)，160.0(C-4)，40.4(C-5)，23.6(C-6)，55.7(C-7)，54.5(C-8)，60.7(C-9)，35.8(C-10)，60.1(C-11)，65.7(C-12)，66.2(C-13)，73.4(C-14)，25.2(C-15)，17.7(C-16)，16.8(C-17)，173.8(C-18)，70.0(C-19)，13.6(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]一致，故確定化合物為TP。

化合物6：無(wú)色片晶，C41H47NO19，(+)-ESI-MSm/z：858.2[M+H]+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：5.73(1H，d，J=3.7 Hz，H-1)，5.39(1H，dd，J=3.7，2.6 Hz，H-2)，5.05(1H，d，J=2.6 Hz，H-3)，6.98(1H，brs，H-5)，2.37(1H，d，J=4.0 Hz，H-6)，5.56(1H，m，H-7)，5.43(1H，d，J=6.7 Hz，H-8)，4.31(1H，d，J=13.4 Hz，H-11a)，5.53(1H，d，J=13.4 Hz，H-11b)，1.58(1H，s，H-12)，1.70(1H，s，H-14)，3.79(1H，d，J=11.7 Hz，H-15a)，5.79(1H，d，J=11.7 Hz，H-15b)，2.95(1H，m，H-16a)，4.00(1H，m，H-16b)，2.24(1H，m，H-17a)，2.37(1H，m，H-17b)，1.22(1H，d，J=6.9 Hz，H-19)，8.78(1H，dd，J=4.6，1.8 Hz，H-2')，7.31(1H，dd，J=7.9，4.6 Hz，H-3')，8.36(1H，dd，J=7.9，1.8 Hz，H-4')，7.51(1H，t，J=1.8 Hz，H-2'')，6.86(1H，dd，J=0.7，1.8 Hz，H-3'')，8.29(1H，dd，J=0.7，1.4 Hz，H-5'')，1.87(3H，s，1-OAc)，2.31(3H，s，5-OAc)，2.20(6H，s，7-OAc，11-OAc)，2.00(3H，s，8-OAc)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：73.4(C-1)，68.9(C-2)，75.8(C-3)，69.7(C-4)，73.6(C-5)，51.2(C-6)，69.2(C-7)，70.8(C-8)，52.1(C-9)，93.8(C-10)，60.5(C-11)，22.8(C-12)，84.5(C-13)，18.0(C-14)，70.3(C-15)，33.3(C-16)，33.5(C-17)，38.4(C-18)，21.1(C-19)，175.1(C-20)，166.8(C-21)，164.3(C-2')，124.3(C-3')，138.7(C-4')，121.2(C-5')，153.3(C-6')，144.3(C-2'')，109.7(C-3'')，118.3(C-4'')，148.7(C-5'')，20.5，169.1(1-OAc)，21.1，169.9(5-OAc)，20.5，170.1(7-OAc)，18.9，169.3(8-OAc)，21.6，170.7(11-OAc)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[30]一致，故確定化合物為雷公藤晉堿(Wilforgine)。

化合物7：無(wú)色片晶，C43H49NO19，(+)-ESI-MSm/z：884.2[M+H]+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：5.77(1H，d，J=3.2 Hz，H-1)，5.48(1H，t，J=3.0 Hz，H-2)，5.10(1H，d，J=2.9 Hz，H-3)，6.87(1H，brs，H-5)，2.41(1H，d，J=3.8 Hz，H-6)，5.56(1H，dd，J=4.0，5.9 Hz，H-7)，5.41(1H，d，J=5.7 Hz，H-8)，4.42(1H，d，J=13.0 Hz，H-11a)，5.60(1H，d，J=13.0 Hz，H-11b)，1.74(1H，s，H-12)，1.67(1H，s，H-14)，3.77(1H，d，J=12.1 Hz，H-15a)，5.84(1H，d，J=12.1 Hz，H-15b)，2.88(1H，m，H-16a)，4.09(1H，m，H-16b)，2.49(1H，m，H-17)，1.52(1H，s，H-19)，8.72(1H，dd，J=4.8，1.7 Hz，H-2')，7.24(1H，dd，J=7.9，4.9 Hz，H-3')，8.16(1H，dd，J=7.9，1.7 Hz，H-4')，8.09(1H，d，J=8.0 Hz，H-2'')，7.54(1H，t，J=7.3 Hz，H-3'')，7.66(1H，t，J=7.3 Hz，H-4'')，7.54(1H，t，J=7.3 Hz，H-5'')，8.09(1H，d，J=8.0 Hz，H-6'')，1.90(3H，s，1-OAc)，2.22(6H，s，5-OAc，11-OAc)，2.12(3H，s，7-OAc)，1.97(3H，s，8-Ac)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：73.2(C-1)，69.3(C-2)，76.9(C-3)，69.8(C-4)，73.6(C-5)，51.0(C-6)，68.9(C-7)，70.8(C-8)，51.9(C-9)，94.0(C-10)，60.6(C-11)，23.0(C-12)，84.8C-13)，17.9(C-14)，69.8(C-15)，31.4(C-16)，38.4(C-17)，77.7(C-18)，28.0(C-19)，172.5(C-20)，168.0(C-21)，164.9(C-22)，152.2(C-2')，120.6(C-3')，137.8(C-4')，125.5(C-5')，164.8(C-6')，128.7(C-1'')，129.9(C-2'')，128.8(C-3'')，133.9(C-4'')，128.8(C-5'')，129.9(C-6'')，20.5，169.8(1-OAc)，21.6，169.8(5-OAc)，21.0，170.1(7-OAc)，20.45，169.0(8-OAc)，21.0，170.1(11-OAc)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[30]一致，故確定化合物為雷公藤定堿(Wilfordine)。

化合物8：無(wú)色片晶，C43H49NO18，(+)-ESI-MSm/z：868.2[M+H]+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：5.78(1H，d，J=3.8 Hz，H-1)，5.37(1H，dd，J=2.6，3.7 Hz，H-2)，5.10(1H，d，J=2.6 Hz，H-3)，6.93(1H，brs，H-5)，2.39(1H，d，J=4.0 Hz，H-6)，5.57(1H，m，H-7)，5.40(1H，d，J=6.0 Hz，H-8)，4.41(1H，d，J=13.2 Hz，H-11a)，5.50(1H，d，J=13.2 Hz，H-11b)，1.70(3H，s，H-12)，1.68(1H，s，H-14)，3.81(1H，d，J=12.0 Hz，H-15a)，5.80(1H，d，J=12 Hz，H-15b)，2.97(1H，m，H-16a)，3.98(1H，m，H-16b)，2.24(1H，m，H-17a)，2.41(1H，m，H-17b)，1.24(3H，d，J=7.0 Hz，H-19)，8.78(1H，dd，J=1.8，4.7 Hz，H-2')，7.31(1H，dd，J=4.7，7.9 Hz，H-3')，8.36(1H，dd，J=1.8，7.9 Hz，H-4')，8.10(1H，d，J=7.1 Hz，H-2'')，7.53(1H，t，J=7.9 Hz，H-3'')，7.64(1H，t，J=7.4 Hz，H-4'')，7.53(1H，t，J=7.9 Hz，H-5'')，8.10(1H，d，J=7.1 Hz，H-6'')，1.85(3H，s，1-OAc)，2.20(9H，s，5-OAc，7-OAc，11-OAc)，1.97(3H，s，8-OAc)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：73.5(C-1)，69.1(C-2)，76.0(C-3)，69.7(C-4)，73.8(C-5)，51.2(C-6)，69.9(C-7)，71.0(C-8)，52.2(C-9)，93.8(C-10)，60.6(C-11)，22.9(C-12)，84.5(C-13)，20.5(C-14)，70.3(C-15)，33.3(C-16)，33.5(C-17)，38.5(C-18)，23.2(C-19)，175.1(C-20)，165.0(C-21)，161.1(C-22)，153.2(C-2')，121.1(C-3')，138.7(C-4')，124.5(C-5')，164.1(C-6')，128.9(C-1'')，129.9(C-2'')，128.8(C-3'')，133.8(C-4'')，128.8(C-5'')，129.9(C-6'')，21.0，169.0(1-OAc)，21.6，169.9(5-OAc)，21.1，170.1(7-OAc)，20.5，169.3(8-OAc)，21.6，170.3(11-OAc)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[30]一致，故確定化合物為雷公藤次堿(Wilforine)。

化合物9：無(wú)色片晶，C41H47NO20，(+)-ESI-MSm/z：874.2[M+H]+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：5.70(1H，d，J=3.6 Hz，H-1)，5.35(1H，dd，J=3.0，3.5 Hz，H-2)，5.05(1H，d，J=2.7 Hz，H-3)，6.96(1H，s，H-5)，2.39(1H，d，J=3.9 Hz，H-6)，5.42(1H，d，J=6.0 Hz，H-8)，4.32(1H，d，J=13.5 Hz，H-11a)，5.56(1H，d，J=13.5 Hz，H-11b)，1.64(1H，s，H-12)，1.66(3H，s，H-14)，3.73(1H，d，J=12.0 Hz，H-15a)，5.87(1H，d，J=12.0 Hz，H-15b)，2.88(1H，m，H-16a)，4.10(1H，m，H-16b)，2.18(1H，m，H-17a)，2.52(1H，m，H-17b)，1.49(3H，s，H-19)，8.72(1H，dd，J=1.8，4.8 Hz，H-2')，7.25(1H，dd，J=4.8，7.9 Hz，H-3')，8.17(1H，dd，J=1.8，7.9 Hz，H-4')，7.52(1H，t，J=1.8 Hz，H-2'')，6.85(1H，dd，J=0.7，1.8 Hz，H-3'')，8.28(1H，dd，J=0.7，1.4 Hz，H-5'')，1.88(3H，s，1-OAc)，2.28(3H，s，5-OAc)，2.20(3H，s，7-OAc)，2.00(3H，s，8-OAc)，2.21(3H，s，11-OAc)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：73.1(C-1)，68.8(C-2)，76.8(C-3)，69.8(C-4)，73.6(C-5)，51.2(C-6)，68.9(C-7)，70.7(C-8)，52.1(C-9)，94.1(C-10)，60.5(C-11)，22.7(C-12)，84.8(C-13)，17.9(C-14)，69.8(C-15)，31.4(C-16)，38.4(C-17)，77.8(C-18)，28.2(C-19)，172.5(C-20)，168.0(C-21)，161.1(C-22)，152.3(C-2')，120.6(C-3')，137.8(C-4')，125.6(C-5')，165.0(C-6')，144.4(C-2'')，109.7(C-3'')，118.2(C-4'')，148.8(C-5'')，20.5，169.8(1-OAc)，21.2，169.6(5-OAc)，20.5，170.0(7-OAc)，18.8，169.3(8-OAc)，21.0，170.6(11-OAc)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[30]一致，故確定化合物為雷公藤春堿(Wilfortrine)。

化合物10：無(wú)色片晶，C38H47NO18，(+)-ESI-MSm/z：806.2[M+H]+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：5.63(1H，d，J=4.0 Hz，H-1)，5.24(1H，dd，J=3.5，4.0 Hz，H-2)，4.96(1H，d，J=3.5 Hz，H-3)，6.94(1H，s，H-5)，2.34(1H，d，J=3.8 Hz，H-6)，5.38(1H，d，J=5.8 Hz，H-8)，4.47(1H，d，J=13.4 Hz，H-11a)，5.24(1H，d，J=13.4 Hz，H-11b)，1.57(1H，s，H-12)，1.67(3H，s，H-14)，3.78(1H，d，J=11.7 Hz，H-15a)，5.77(1H，d，J=11.7 Hz，H-15b)，3.97(2H，m，H-16)，2.36(1H，m，H-17a)，2.95(1H，m，H-17b)，2.50(1H，m，H-18)，1.19(1H，d，J=6.9 Hz，H-19)，8.77(1H，dd，J=1.7，4.8 Hz，H-2')，7.25(1H，dd，J=4.8，7.9 Hz，H-3')，8.17(1H，dd，J=1.7，7.9 Hz，H-4')，1.67(3H，s，1-OAc)，1.88(3H，s，2-OAc)，2.01(3H，s，5-OAc)，2.16(3H，s，7-OAc)，2.20(3H，s，8-OAc)，2.31(3H，s，11-OAc)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：73.4(C-1)，68.8(C-2)，75.4(C-3)，71.6(C-4)，73.2(C-5)，51.0(C-6)，69.6(C-7)，70.2(C-8)，52.9(C-9)，98.7(C-10)，60.5(C-11)，23.1(C-12)，84.4(C-13)，21.6(C-14)，70.3(C-15)，33.5(C-16)，33.5(C-17)，38.1(C-18)，20.2(C-19)，175.5(C-20)，166.2(C-21)，153.1(C-2')，121.7(C-3')，138.6(C-4')，124.5(C-5')，164.8(C-6')，20.3，166.9(1-OAc)，21.2，169.2(2-OAc)，21.2，169.9(5-OAc)，21.5，170.3(7-OAc)，21.5，170.3(8-OAc)，21.9，170.2(11-OAc)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[31]一致，故確定化合物為雷公藤新堿(Euonine)。

化合物11：無(wú)色片晶，C38H47NO18，(+)-ESI-MSm/z:806.2[M+H]+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)：5.56(1H，d，J=4.0 Hz，H-1)，5.24(1H，dd，J=2.8，4.0 Hz，H-2)，4.74(1H，d，J=2.8 Hz，H-3)，7.06(1H，s，H-5)，2.37(1H，d，J=3.8 Hz，H-6)，5.53(1H，dd，J=3.8，5.8 Hz，H-7)，5.38(1H，d，J=5.8 Hz，H-8)，4.50(1H，d，J=13.5 Hz，H-11a)，5.14(1H，d，J=13.5 Hz，H-11b)，1.73(1H，s，H-12)，1.56(3H，s，H-14)，3.71(1H，d，J=11.7 Hz，H-15a)，6.06(1H，d，J=11.7 Hz，H-15b)，4.71(2H，m，H-16)，2.47(1H，m，H-17)，1.38(1H，m，H-18)，1.10(1H，d，J=6.9 Hz，H-19)，9.02(1H，s，H-2')，7.39(1H，dd，J=4.8，7.9 Hz，H-5')，8.73(1H，dd，J=1.7，7.9 Hz，H-6')，1.56(3H，s，1-OAc)，1.86(3H，s，2-OAc)，2.02(3H，s，5-OAc)，2.18(3H，s，7-OAc)，2.22(3H，s，8-OAc)，2.35(3H，s，11-OAc)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)：73.2(C-1)，68.8(C-2)，75.8(C-3)，70.2(C-4)，73.5(C-5)，50.6(C-6)，69.0(C-7)，70.9(C-8)，52.5(C-9)，94.1(C-10)，60.1(C-11)，22.3(C-12)，84.6(C-13)，18.5(C-14)，70.4(C-15)，33.5(C-16)，45.9(C-17)，11.6(C-18)，10.1(C-19)，173.5(C-20)，168.2(C-21)，150.8(C-2')，125.8(C-3')，156.6(C-4')，121.4(C-5')，152.7(C-6')，20.3，168.9(1-OAc)，21.1，168.7(2-OAc)，21.6，170.8(5-OAc)，21.2，170.3(7-OAc)，20.4，169.1(8-OAc)，21.6，170.1(11-OAc)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[31]一致，故確定化合物為Peritassine A。

化合物12：紅色片狀晶，C29H38O4，(+)-ESI-MSm/z：451.2[M+H]+;(-)-ESI-MSm/z:449.2[M-H]-。1H NMR(MeOD，500 MHz)：6.50(1H，s，H-1)，7.24(1H，brd，H-7)，2.24(3H，s，H-23)，1.49(3H，s，H-24)，1.33(3H，s，H-25)，0.76(3H，s，H-26)，1.15(3H，s，H-27)，1.21(3H，s，H-29)；13C NMR(MeOD，125 MHz)：119.0(C-1)，178.7(C-2)，146.5(C-3)，118.7(C-4)，127.2(C-5)，135.0(C-6)，118.3(C-7)，170.8(C-8)，42.8(C-9)，165.1(C-10)，33.2(C-11)，29.4(C-12)，39.3(C-13)，44.9(C-14)，28.4(C-15)，36.2(C-16)，30.5(C-17)，44.3(C-18)，30.2(C-19)，39.8(C-20)，29.2(C-21)，34.6(C-22)，8.9(C-23)，37.5(C-25)，20.8(C-26)，18.2(C-27)，30.6(C-28)，31.8(C-29)，181.1(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[32]一致，故確定化合物為Cel。

化合物13：白色固體，C29H38O5，(+)-ESI-MSm/z：467.3[M+H]+;(-)-ESI-MSm/z:465.3[M-H]-。1H NMR(MeOD，500 MHz)：6.87(1H，s，H-1)，6.19(1H，s，H-7)，2.57(3H，s，H-23)，1.56(3H，s，H-24)，1.37(3H，s，H-25)，0.78(3H，s，H-26)，1.16(3H，s，H-27)，1.20(3H，s，H-29)；13C NMR(MeOD，125 MHz)：108.4(C-1)，141.8(C-2)，149.1(C-3)，124.8(C-4)，121.0(C-5)，170.2(C-8)，149.3(C-10)，33.6(C-11)，29.3(C-12)，38.5(C-13)，44.0(C-14)，28.0(C-15)，36.0(C-16)，30.0(C-17)，43.6(C-18)，30.0(C-19)，39.3(C-20)，29.3(C-21)，34.5(C-22)，13.5(C-23)，37.4(C-24)，20.7(C-25)，18.0(C-26)，31.3(C-27)，179.3(C-28)，32.2(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]一致，故確定化合物為雷公藤酚A(Wilforol A)。

化合物14：白色結(jié)晶，C30H48O4，(+)-ESI-MSm/z：473.3[M+H]+;(-)-ESI-MSm/z:471.4[M-H]-。1H NMR(MeOD，500 MHz)：3.54(1H，m，H-3)，5.28(1H，brd，H-12)，1.01(9H，s，H-21，H-22，H-24)，0.81(3H，s，H-23)，1.04(3H，s，H-25)，1.21(3H，s，H-26)，1.27(3H，s，H-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[33]一致，故確定化合物為雷公藤三萜酸A(Triptotriterpenic acid A)。

化合物15：白色結(jié)晶，C28H36O5，(+)-ESI-MSm/z：453.3[M+H]+;(-)-ESI-MSm/z:451.3[M-H]-。1H NMR(MeOD，500 MHz)：6.87(1H，s，H-1)，7.82(1H，s，H-4)，6.30(3H，s，H-7)，1.50(3H，s，H-23)，0.51(3H，s，H-24)，1.28(6H，s，H-25，H-27)，1.16(3H，s，H-26)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[34]一致，故確定化合物為23-Nor-6-oxodemethylpristimerol。

3.3.3 單體化合物的細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià) 細(xì)胞活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明,TP(5)和Cel(12)的活性較強(qiáng)(表5,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2),通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)得IC50值(圖2),其中TP抗AMOL活性最強(qiáng)[IC50值為(3.35±0.03)ng·mL-1],優(yōu)于DNR陽(yáng)性對(duì)照組[IC50值為(55.41±0.28)ng·mL-1],Cel的活性比TP弱[IC50值為(1.19±0.01)μg·mL-1]。相同摩爾劑量下的TP比Cel活性強(qiáng)約300倍,雷公藤多苷片提取物中的Cel的含量(約5.5%)是TP(約0.5%)的10倍，由此我們推斷TP可能是雷公藤抗急性白血病單核細(xì)胞的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

表5 化合物1～15對(duì)MV-4-11細(xì)胞的增殖抑制率

圖2 TP和Cel的化學(xué)結(jié)構(gòu)及對(duì)MV-4-11細(xì)胞的增殖抑制作用

3.4 TP抑制AMOL活性具有選擇性

為驗(yàn)證TP是否與雷公藤多苷片提取物有著相同的血液腫瘤敏感瘤譜,我們考察了TP對(duì)不同血液腫瘤細(xì)胞系的抑制作用,結(jié)果表明與雷公藤多苷片提取物的結(jié)果一致,TP對(duì)單核細(xì)胞來(lái)源的白血病細(xì)胞SHI-1及MV-4-11增殖抑制作用最強(qiáng),IC50小于3.5 ng·mL-1,優(yōu)于其在Kasumi-1、SU-DHL-10和K562等非單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系中的抑制活性(表6),進(jìn)一步說(shuō)明TP是雷公藤多苷片抗AMOL的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)的前期工作發(fā)現(xiàn)TP通過(guò)阻滯MV-4-11細(xì)胞的周期于G1期引起細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤活性[35]。同時(shí),我們考察發(fā)現(xiàn)TP對(duì)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞系HK2與人正常肝細(xì)胞系L02有一定的抑制作用,其活性弱于AMOL細(xì)胞系(圖3)。

表6 TP作用于不同腫瘤細(xì)胞系48 h的IC50值

圖3 TP對(duì)HK2和L02細(xì)胞的抑制作用

3.5 TP定向敲除前后雷公藤多苷片及其提取物對(duì)MV-4-11細(xì)胞增殖抑制活性變化

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TP是否為雷公藤多苷片的抗白血病的物質(zhì)基礎(chǔ),本文通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)得雷公藤多苷片及雷公藤多苷片提取物定向敲除TP前后的IC50值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雷公藤多苷片及雷公藤多苷片提取物定向敲除TP后的IC50值分別升高了8及13倍(表7),進(jìn)一步驗(yàn)證了TP是其發(fā)揮抗AMOL細(xì)胞增殖活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表7 雷公藤多苷片及其提取物定向敲除TP前后作用MV-4-11細(xì)胞48 h的IC50值

4 討論

本研究通過(guò)考察雷公藤多苷片提取物以及TP的敏感瘤株,發(fā)現(xiàn)AMOL細(xì)胞對(duì)其敏感;進(jìn)一步采用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了雷公藤多苷片的抗腫瘤作用;最后通過(guò)色譜分離技術(shù)定向敲除TP,結(jié)果表明TP敲除后的雷公藤多苷片及雷公藤多苷片提取物的IC50值分別升高了8倍和13倍。上述研究提示TP是雷公藤發(fā)揮抗AMOL的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而,敲除TP后的雷公藤活性并沒(méi)有完全消失,推測(cè)存在2種可能性:①另有尚未分離出的強(qiáng)效微量抗腫瘤活性成分;②含量相對(duì)較高的Cel發(fā)揮一定的抗腫瘤作用。

中藥是中華傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的主要醫(yī)治手段,如何從傳統(tǒng)中藥中獲得確證藥效的化學(xué)成分一直是國(guó)際醫(yī)藥界的關(guān)注焦點(diǎn)。青蒿素治療瘧疾[36-37]、砒霜治療白血病[38-39]——這些中藥上的突破與現(xiàn)代科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯糠椒芮邢嚓P(guān)。有著“中草藥激素”之稱的雷公藤在臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中療效確證,但毒副作用常使臨床醫(yī)生不敢貿(mào)然使用[40-41],這與其物質(zhì)基礎(chǔ)不明確有著一定的關(guān)系。雷公藤的化學(xué)成分復(fù)雜,被認(rèn)可的有效成分TP在不同產(chǎn)地藥材以及藥材不同部位中的含量變化很大,應(yīng)用粗藥材入藥存在中毒風(fēng)險(xiǎn)[42]。國(guó)內(nèi)上市制劑雷公藤多苷片的質(zhì)量參差不齊,TP含量差異較大,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一[43]。所以,在不同疾病類型中明確雷公藤發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),并在此基礎(chǔ)上研發(fā)新藥或許可以克服其臨床轉(zhuǎn)化等難題。

TP既是中藥雷公藤的活性成分,又是毒性成分,在雷公藤制劑中的含量低微。與XPB共價(jià)結(jié)合對(duì)整體轉(zhuǎn)錄水平的抑制可能是TP發(fā)揮廣譜抗腫瘤作用與毒性作用的共同分子基礎(chǔ)。因此,尋找雷公藤的敏感瘤株及適應(yīng)癥或許可以提高其臨床治療窗口。此外,雷公藤敏感疾病譜的作用靶標(biāo)有哪些?是否與XPB關(guān)系密切,這些終將為雷公藤在臨床應(yīng)用上的突破做出重大貢獻(xiàn)。