黃麗蕓 陳小兵

齒瓣石豆蘭為蘭科石豆蘭屬植物，分布在江西、廣西、福建、廣東、浙江等地，文獻(xiàn)[1-4]記載具有滋陰降火、清熱消腫之功效，可用于急性咽炎、扁桃體炎等，野生品種較少，具有較高的藥用價(jià)值。本研究以簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)從遺傳多樣性方面對其分析研究，探究不同產(chǎn)地齒瓣石豆蘭遺傳多樣性及親緣關(guān)系，為各地齒瓣石豆蘭的資源開發(fā)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥

采集江西省贛州市、江西省遂川縣、廣東省羅浮山等地的野生齒瓣石豆蘭，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)國家二級技師顏干明鑒定為齒瓣石豆蘭。見表1。

表1 采集信息

1.2 試劑與儀器

試劑：Taq Plus DNA 聚合酶（翌圣生物科技（上海）股份有限公司，批號：10101ES80）、DNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，批號：DP321-03）、滅菌用水等。

儀器：PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（BBI，型號：PCR-96）、凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCP-31E）、凝膠成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司，型號：FR980）、潔凈工作臺（江蘇蘇州凈化設(shè)備廠，型號：SW-CJ-1D）、冷凍高速離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司，型號：JW-2018H）等。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取與檢測 取采摘的齒瓣石豆蘭樣品，用試劑盒提取出其基因DNA。將所得的DNA溶液裝入滅菌離心管，用凝膠電泳檢測成像，記錄結(jié)果。

1.3.2 PCR的引物篩選、擴(kuò)增與檢測 參考蘭科植物研究文獻(xiàn)[5-7]中出現(xiàn)的引物，以及哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條引物序列，隨機(jī)選取3個(gè)齒瓣石豆蘭模板DNA，從中篩選出10條反應(yīng)體系穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶較清晰、多態(tài)性比例較好的引物，最優(yōu)引物序列見表2。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，最終確定本實(shí)驗(yàn)的ISSR-PCR 反應(yīng)體系為：DNA樣品1 μl，引物1 μl，2×Es Taq MasterMix（Dye）10 μl，最后滅菌水加至20 μl。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃總延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。最后在2%瓊脂糖凝膠、150 V電壓下電泳30 min，置于凝膠成像系統(tǒng)上分析成像[8-10]，拍照保存。

表2 最優(yōu)引物序列

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析 根據(jù)樣品擴(kuò)增譜帶信息，對于不同產(chǎn)地的齒瓣石豆蘭DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳統(tǒng)計(jì)時(shí)按照有條帶為1，無條帶為0的原則，用Quantity One軟件對圖譜上的條帶進(jìn)行標(biāo)記，導(dǎo)出為0-1矩陣數(shù)據(jù)[11-13]，通過Popgene v1.32軟件進(jìn)行遺傳學(xué)分析，得出其遺傳特征系數(shù)[14-17]，對不同產(chǎn)地齒瓣石豆蘭進(jìn)行遺傳一致度與遺傳距離分析[18-19]。

2 結(jié)果

2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用篩選出的10個(gè)引物對29個(gè)齒瓣石豆蘭樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出243條清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶223條，有效條帶數(shù)占總條帶數(shù)91.77%。優(yōu)選10條引物擴(kuò)增出的有效條帶數(shù)范圍為8～16條。引物UBC806擴(kuò)增出的條帶最多，為30條；引物UBC819擴(kuò)增條帶最少，為13條。

2.2 齒瓣石豆蘭遺傳多樣性分析

由多態(tài)性位點(diǎn)可知，齒瓣石豆蘭的遺傳變異情況由低到高為FS＜YY＜SC＜LFS＜JLS，變化范圍是20.50%～40.18%；由等位基因數(shù)（Na）可知，齒瓣石豆蘭的遺傳變異情況由低到高為FS＜YY＜SC＜LFS＜JLS，變化范圍是1.365 6～1.437 4；由有效等位基因數(shù)（Ne）可知，齒瓣石豆蘭的變異情況由低到高依次為FS＜YY＜SC＜JLS＜LFS，變化范圍是1.211 8～1.329 0；由Nei’s基因多樣性指數(shù)（h）得出，齒瓣石豆蘭變異情況由低到高依次是FS＜YY＜SC＜JLS＜LFS，變化范圍是0.089 8～0.201 3；依據(jù)Shannon’s信息指數(shù)（I），齒瓣石豆蘭的變異情況由低到高依次是FS＜YY＜SC＜JLS＜LFS，變化范圍是0.149 8～0.259 3。見表3。

表3 遺傳多樣性分析

2.3 遺傳距離與遺傳一致度

不同產(chǎn)地齒瓣石豆蘭之間遺傳一致度為0.789 2～0.908 9，遺傳距離為0.098 5～0.240 1。見表4。

表4 遺傳一致度和遺傳距離

2.4 聚類分析

按照地理緯度，本次采集的緯度差異相對較小，聚類分析結(jié)果見圖1，遺傳一致度為0.79～0.90，由聚類分析可知，贛州峰山、贛縣楊雅村、龍南九連山、遂川縣的親緣關(guān)系較近。

圖1 齒瓣石豆蘭種群間的聚類分析

3 討論

本研究利用ISSR方法對江西中南部地區(qū)及廣東羅浮山地區(qū)齒瓣石豆蘭進(jìn)行遺傳多樣性分析，以其遺傳距離進(jìn)行親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地齒瓣石豆蘭之間遺傳一致度為0.789 2～0.908 9，遺傳距離為0.098 5～0.240 1，表明此地區(qū)內(nèi)齒瓣石豆蘭遺傳多樣性小，親緣關(guān)系較近。

齒瓣石豆蘭的遺傳多樣性與生長的地理位置距離具有一定的關(guān)聯(lián)，本次摘取的齒瓣石豆蘭生長地域位置相差不大，其間的遺傳多樣性較小，所屬親緣關(guān)系較近，植物資源的遺傳多樣性越豐富越有利于新品種選育，資源的親緣關(guān)系越近越有利于植物間育種。本研究首次以分子標(biāo)記技術(shù)為蘭科植物齒瓣石豆蘭進(jìn)行遺傳多樣性分析，對其后期的規(guī)范種植及資源開發(fā)等提供了科學(xué)依據(jù)。