高 垚 郭向群 潘立文 飛志紅

金龍膽草又名矮腳金龍膽草、金蒿枝、魚膽草等，是菊科白酒草屬兩年生草本植物，分布于攀西、云南及貴州部分地區(qū)，常生長(zhǎng)于海拔600～2 800 m的山坡草地[1-2]?！吨袊?guó)彝族藥學(xué)》記載，金龍膽草味苦，性寒，具有清熱解毒，止血，止痛等功效。云南楚雄民間采集此藥，內(nèi)服外用，用于治療扁桃體炎、中耳炎、肝炎、遺尿癥等[3]。目前研究報(bào)道主要關(guān)注于對(duì)其化學(xué)成分及藥理活性的研究?；瘜W(xué)成分研究方面，金龍膽草主要含有萜類物質(zhì)，包括三萜、二萜及其糖苷，此外還含有黃酮類、揮發(fā)油、有機(jī)酸、無機(jī)元素等有效成分，其中二萜化合物金龍膽草素為金龍膽草中的特征化合物[4]。藥理作用方面，已有研究表明金龍膽草具有抗炎、抗?jié)?、抗菌、抗腫瘤作用[5-6]。王寅生等[7]的研究表明，金龍膽草乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抗菌活性，但目前為止，仍未有金龍膽草體內(nèi)抗菌作用研究。水煎液為民間慣用的金龍膽草藥用劑型，因此，本研究就金龍膽草水煎液體外抗菌活性進(jìn)行分析，并探索其對(duì)感染金黃色葡萄球菌小鼠模型皮膚膿腫的治療作用。

1 材料與方法

1.1 體外抑菌作用

1.1.1 材料 金龍膽草野生樣本采集于云南省楚雄市東華鎮(zhèn)；實(shí)驗(yàn)菌株購(gòu)買于廣東省微生物研究所；小白鼠購(gòu)買于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

1.1.2 金龍膽草水煎液的提取 取已切割至約1 cm小段的干燥金龍膽草50 g于煎煮鍋內(nèi)，少量多次加入蒸餾水并不斷攪拌，致干燥藥物充分吸濕且鍋底水量不多于5 ml，充分吸濕后，加入蒸餾水500 ml煮沸30 min，將第一次煮沸的藥液倒出，繼續(xù)加入500 ml水煎煮30 min后充分倒出煎煮液，將兩次的煎煮液合并，過濾后將藥液濃縮至100 ml，即最終的藥物濃度為0.5 g/ml。

1.1.3 體外抑菌實(shí)驗(yàn)方法 體外抑菌實(shí)驗(yàn)采用方法為紙片擴(kuò)散法，抑菌圈的大小可反映測(cè)試菌對(duì)檢測(cè)藥物的敏感程度。將抑菌實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)菌分別傳代3次備用；選擇優(yōu)質(zhì)新華1號(hào)濾紙，用打孔器制成直徑6 mm的圓形濾紙片，經(jīng)高壓滅菌后，將濾紙片放置于滅菌的濃度為0.5 g/ml金龍膽草水煎劑中浸泡2～3 h，同法制備0.9%氯化鈉注射液濾紙片作為陰性對(duì)照。將傳代3次后的細(xì)菌（大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌）挑取單菌落于牛肉湯液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、130 r/min培養(yǎng)12 h，之后將菌液進(jìn)行稀釋，將稀釋菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上。將制備好的濾紙片放置于固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2 載體抗感染

1.2.1 材料 金龍膽草水煎液，濃度為0.2 g/ml；頭孢克洛混懸液0.125 g/包；0.9%氯化鈉注射液。小白鼠來源于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部的昆明鼠，體重在30～40 g。

1.2.2 動(dòng)物準(zhǔn)備 在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)一周，讓小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)條件及環(huán)境。一周后對(duì)小鼠右側(cè)腹部剃毛，暴露皮膚，備皮做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，并繼續(xù)飼養(yǎng)2 d，觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)正常。

1.2.3 菌液制備 金黃色葡萄球菌在固體培養(yǎng)基穩(wěn)定傳代3次后，挑取單菌落于37 ℃、130 r/min的牛肉湯培養(yǎng)基（牛肉膏3～5 g，蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 ml，調(diào)pH 7.4～7.6）中培養(yǎng)42 h，然后用滅菌0.9%氯化鈉注射液清洗細(xì)菌，離心后用稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度，再用滅菌0.9%氯化鈉注射液調(diào)整其菌液濃度為（1.0～1.25）×109CFU/ml。

1.2.4 膿腫模型建立 將小鼠分為兩組，膿腫建模陰性對(duì)照組（10只），向備皮后的小鼠皮下注射0.9%氯化鈉注射液；膿腫建模組（30只），向備皮后的昆明小白鼠腹部皮下注射0.1～0.12 ml上述菌液，使注射菌液量達(dá)108CFU。將皮下注射菌液的小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，24 h后，見陰性建模組無膿腫發(fā)生，而菌液建模組小鼠注射部位出現(xiàn)明顯腫塊，觸之有明顯扭體反應(yīng)，膿腫模型建立成功并測(cè)量膿腫體積。本研究成功地建立了金黃色葡萄球菌皮膚膿腫小鼠模型，建模的30只小白鼠，全部形成膿腫包塊，建模成功率高，而陰性對(duì)照組沒有小鼠形成包塊。

1.2.5 載體抗感染 將建模成功的30只小鼠分為3組，分別為陽性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組，每組10只，給藥前各組小鼠膿腫體積無顯著差異。陽性對(duì)照組給予藥物頭孢克洛灌胃，陰性對(duì)照組用0.9%氯化鈉注射液灌胃，實(shí)驗(yàn)組用金龍膽草水煎液灌胃。

陽性對(duì)照組：按照金龍膽草水煎液濃度為0.2 g/ml，成人用藥量20 g/次計(jì)算，根據(jù)公式（D鼠=D人×K鼠/K人×W人/W鼠；K鼠=9.1；K人=1.6；W鼠=0.04 kg；W人=50 kg計(jì)算。注：D代表劑量；K代表人/鼠的等效劑量比值；W代表體重）計(jì)算得小鼠給藥劑量為0.091 g/次，即給藥量為450 μl/次，3次/d。考慮給藥的方便性及準(zhǔn)確性，每次取0.125 g/包的頭孢克洛混懸液溶解于50 ml蒸餾水中，算得每只小鼠的灌胃藥量為400 μl/次。

陰性對(duì)照組：0.9%氯化鈉注射液450 μl/次，3次/d。

實(shí)驗(yàn)組：取已切割至約1 cm小段的干燥金龍膽草40 g于煎煮鍋內(nèi)，少量多次加入蒸餾水并不斷攪拌，致干燥的藥物充分吸濕且鍋底余水量不多于5 ml，充分吸濕后，加入蒸餾水200 ml煮沸30 min，將第一次煮沸的藥液倒出，繼續(xù)加入200 ml水煎煮30 min后充分倒出煎煮液，將兩次的煎煮液合并，過濾后將藥液濃縮至200 ml，即最終的藥物濃度為0.2 g/ml。采用濃度為0.2 g/ml的金龍膽草水煎劑，每次給藥量為450 μl，3次/d。

建模成功后，每日記錄小鼠體重及膿腫體積變化（膿腫體積計(jì)算方法：膿腫體積=π/6×長(zhǎng)徑距離×短徑距離），灌胃6 d。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，體外抑菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行給藥前后體重差異性檢驗(yàn)，采用重復(fù)檢測(cè)方差分析對(duì)不同組間膿腫變化差異進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)用傳代3次的菌株（金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌）進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，每個(gè)菌株6個(gè)平行孔，為防止實(shí)驗(yàn)誤差，以0.9%氯化鈉注射液作為陰性對(duì)照。金龍膽草水煎液濃度為0.5 g/ml時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑為（28.37±4.92）mm；對(duì)枯草桿菌中度敏感，抑菌圈直徑（13.89±0.71）mm；對(duì)大腸桿菌不敏感，抑菌圈直徑為0。見圖1、表1。

圖1 金龍膽草體外抑菌效果

表1 體外抑菌實(shí)驗(yàn)抑菌圈直徑(mm)

2.2 金黃色葡萄球菌皮膚膿腫小鼠模型研究結(jié)果

給藥前，3組小鼠膿腫體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后，實(shí)驗(yàn)組膿腫體積最小，陽性對(duì)照組次之，而陰性對(duì)照組膿腫體積最大，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。3組小鼠給藥前后體重、活動(dòng)情況、進(jìn)水、進(jìn)食量無明顯變化。

表2 3組大鼠給藥前后膿腫體積比較(mm2,±s)

表2 3組大鼠給藥前后膿腫體積比較(mm2,±s)

組別 只數(shù) 給藥前 給藥后陽性對(duì)照組 10 323.70±149.53 762.00±328.69陰性對(duì)照組 10 321.84±201.11 1 076.90±182.64實(shí)驗(yàn)組 10 276.43±136.82 406.40±375.04

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種重要的人類病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，是革蘭陽性菌的代表。金黃色葡萄球菌可通過多種途徑侵入機(jī)體，形成以膿腫為主的各種化膿性炎癥，常見的皮膚化膿性感染如癤、癰、甲溝炎、傷口化膿等，主要臨床表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛，且金黃色葡萄球菌在醫(yī)院感染以及社區(qū)獲得性感染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)皮膚軟組織感染、呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染以及敗血癥等。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告指出，由金黃色葡萄球菌引起的感染僅次于大腸桿菌，其是人類化膿感染中最常見的病原菌[8-11]。近年來，隨著臨床上抗菌藥物的濫用，金黃色葡萄球菌對(duì)相關(guān)抗菌藥物的耐藥性顯著增加，其產(chǎn)生的一種酶可以水解β-內(nèi)酰胺環(huán)進(jìn)而對(duì)青霉素產(chǎn)生耐藥性[12]。甲氧西林研發(fā)出來后替代了青霉素用于金黃色葡萄球菌感染的治療，而耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）也越來越多地被國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)，甚至萬古霉素中介金黃色葡萄球菌（VISA）和萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌（VRSA）的報(bào)道也逐漸增多[13-14]。目前，臨床將MRSA感染、艾滋病和乙型病毒性肝炎稱為當(dāng)今世界三大感染性疾病，對(duì)患者的生命健康安全造成了極大的威脅，臨床急需尋找能對(duì)抗金黃色葡萄球菌的新型抗感染藥物。

中草藥為傳承千年的傳統(tǒng)藥物，現(xiàn)研究證明，大多數(shù)寒涼類藥物具有抗感染作用，如金銀花、連翹、大青葉、板藍(lán)根[15-16]。金龍膽草味苦、性寒，記載其水煎液對(duì)很多炎癥性疾病有治療作用，而導(dǎo)致炎癥發(fā)生的最主要因素為感染[4]。因此，本研究在成功建立金黃色葡萄球菌小鼠皮膚感染模型的基礎(chǔ)上，用有體外抗金黃色葡萄球菌作用的金龍膽草水煎液進(jìn)行體內(nèi)抗菌作用研究，觀察其對(duì)金黃色葡萄球菌所致膿腫的治療作用。

本研究中，體外抑菌作用研究表明0.5 g/ml金龍膽草水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌抑菌作用不同，其中對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用，對(duì)枯草桿菌中度敏感，對(duì)大腸桿菌不敏感。采用濃度為0.2 g/ml的金龍膽草水煎液進(jìn)行金黃色葡萄球菌皮膚感染小白鼠模型研究，金龍膽草組膿腫體積明顯縮小，且體積縮小程度較頭孢克洛顯著，說明金龍膽草水煎液灌胃對(duì)金黃色葡萄球菌感染小白鼠模型的膿腫消除作用強(qiáng)于頭孢克洛。濃度為0.2 g/ml的金龍膽草水煎液灌胃對(duì)小鼠體重?zé)o影響。

本研究先證明金龍膽草水煎液有非常強(qiáng)的體外抗菌活性，在此基礎(chǔ)上，成功建立金黃色葡萄球菌皮膚感染小鼠模型，用具有抗金黃色葡萄球菌作用的頭孢克洛為陽性對(duì)照，采用金龍膽草水煎液進(jìn)行載體抗感染研究，以灌胃給藥的方式給藥，結(jié)果表明金龍膽草水煎液在體內(nèi)同樣具有治療小鼠金黃色葡萄球菌感染皮膚膿腫的作用。金龍膽草為稀缺中藥材，隨著其人工栽培技術(shù)、內(nèi)生真菌發(fā)酵、創(chuàng)愈組織誘導(dǎo)培養(yǎng)等技術(shù)的不斷研究探索，將可以有效解決野生金龍膽草來源不足的問題[16-18]，而其對(duì)金黃色葡萄球菌極強(qiáng)的抑制作用，有利于為金黃色葡萄球菌抗菌藥物的中藥成分篩選及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，以期發(fā)現(xiàn)新的抗菌活性成分，解決臨床金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)狀。