百里香酚微膠囊的反溶劑法制備工藝

李曉宇，李瑞紅，張悅，郭鵬，董爽

(山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

百里香酚(5-甲基-2-異丙基酚，thymol)又稱麝香草酚，是一類從百里香中分離得到的芳香族化合物。百里香酚具有殺菌抑菌，防腐，抗酸敗等作用[1-2]，已經(jīng)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)為食品添加劑。百里香酚添加到食品之中以后可以起到增香、除臭、防腐等方面的作用[3]；其次，百里香酚的次生代謝產(chǎn)物是黃酮類化合物[4]，可以通過(guò)清除DPPH等自由基以及一些超氧化物，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生來(lái)達(dá)到抗氧化的目的，是一種天然的抗氧化劑[5-6]；但是，百里香酚在水中的溶解度很低，限制其在食品水相中的應(yīng)用[7]，且易揮發(fā)，生物利用度比較低[8-9]；因此，提出通過(guò)大分子物質(zhì)將其進(jìn)行包埋，提高其在水相體系中溶解度以及生物利用度。

玉米醇溶蛋白(zein)是玉米精深加工所產(chǎn)生的副產(chǎn)物中提取的一種醇溶蛋白，其疏水性氨基酸含量比較高[10]，具有兩親性，并且有獨(dú)特的自組裝特性[11]，玉米醇溶蛋白的這種性質(zhì)適合于作為壁材對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行包埋。近些年對(duì)玉米醇溶蛋白獨(dú)特性質(zhì)的研究逐漸增多[12-14]，研究表明，用其對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行包埋，一方面可以保持包埋物質(zhì)的生物活性，另一方面可以提高其溶解性以及生物利用度[15-16]。

本研究主要是基于玉米醇溶蛋白的自組裝功能，采用反溶劑的方法對(duì)百里香酚進(jìn)行包埋。以包封率為指標(biāo)選取芯壁比、混合溶液與去離子水混合溶液體積比、混合溶液向去離子水滴加速率三個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳制備工藝，并對(duì)最佳條件制備的微膠囊進(jìn)行表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米醇溶蛋白(純度92.8%)，江蘇高郵日星藥用輔料有限公司；百里香酚，上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HL-2型恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；FD-1D型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司；Mastersizer 2000激光粒度儀：英國(guó)馬爾文儀器有限公司；Nicolet5700型傅里葉變換紅外光譜儀：美國(guó)Thermo Electron公司；D8-02型X-射線衍射儀：德國(guó)Brucker AXS公司；Q2000型差示掃描量熱儀：美國(guó)TA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白-百里香酚微膠囊的制備

根據(jù)Yang等[17]方法稍做修改，采用反溶劑法制備玉米醇溶蛋白-百里香酚微膠囊，將1 g玉米醇溶蛋白溶解于50 mL 80%無(wú)水乙醇，配成玉米醇溶蛋白溶液。稱取不同質(zhì)量的百里香酚加入到玉米醇溶蛋白溶液中，配制成不同芯壁比的混合溶液，磁力攪拌30 min，按照一定的流速緩慢注入去離子水中，并磁力攪拌30 min使其混合均勻。將制備的膠體溶液在40 ℃下真空旋蒸15 min，隨后在3000 r/min下離心5 min得到上清液，即制得所需的復(fù)合粒子膠體溶液，膠體溶液進(jìn)行冷凍干燥48 h，得到分散的玉米醇溶蛋白-百里香酚微膠囊顆粒(ZT)。

1.3.2 包封率的測(cè)定

將梯度濃度的百里香酚制成標(biāo)準(zhǔn)液，在最大吸收波長(zhǎng)283 nm處測(cè)量其吸光度，以百里香酚濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取10 mg的凍干復(fù)合顆粒于試管中，加入10 mL無(wú)水乙醇輕輕震蕩1 min后靜置30 min。取上清液在百里香酚最大波長(zhǎng)283 nm處測(cè)量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)曲計(jì)算百里香酚含量，記為W1。

稱取10 mg的凍干復(fù)合顆粒于試管中，加入10 mL無(wú)水乙醇，在室溫下超聲30 min以充分提取百里香酚。將提取液在3 000 r/min下離心10 min，取上清液在百里香酚最大波長(zhǎng)283 nm處測(cè)量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算百里香酚含量，記為W2。百里香酚復(fù)合顆粒的包封率按照如下公式計(jì)算[18]：

(1)

式中：W1為游離的百里香酚的含量，μg；W2為總的百里香酚的含量，μg。

1.4 單因素及響應(yīng)面優(yōu)化

以芯壁比(百里香酚：玉米醇溶蛋白=1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)，溶劑反溶劑體積比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)，溶劑反溶劑滴加速率(0.2、0.7、1.2、1.7、2.2 mL/min)，包封率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以包封率(%)為優(yōu)化指標(biāo)，以芯壁比(X1)、溶劑反溶劑體積比(X2)、溶劑反溶劑混流速 (X3)為試驗(yàn)因素，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)ZT微膠囊粒子的制備條件進(jìn)行優(yōu)化,因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Response surface test factor level table

1.5 理化特性及結(jié)構(gòu)表征

1.5.1 粒徑

使用激光粒度儀可以測(cè)定每份樣品的粒徑分布和粒徑大小。使用1 000 mL燒杯加入600 mL去離子水，調(diào)節(jié)粒度儀轉(zhuǎn)速為2 000 d/min，測(cè)定背景，背景測(cè)定完成后向燒杯中加入一定濃度的ZT膠體溶液，等遮光度達(dá)到80%以上開(kāi)始測(cè)定。

1.5.2 熱力學(xué)特性

稱取5 mg凍干后的樣品放入鋁盤(pán)里，加蓋后壓緊，置于差示掃描量熱儀中，以空白鋁盒為對(duì)照。溫度掃描范圍20～200 ℃，掃描速率10 ℃/min。

1.5.3 傅里葉紅外光譜

將干燥的微膠囊顆粒研磨后與KBr按照一定的比例混合，研磨均勻，經(jīng)壓片后對(duì)樣品進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析。掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次。

1.5.4 X-射線衍射光譜

采用X-射線衍射儀對(duì)凍干的樣品進(jìn)行掃描，X-射線發(fā)射器電壓為40 kV，電流為40 mA，采用Cu靶，掃描范圍2θ為3°～70°，掃描速率為2°/min。得到的數(shù)據(jù)繪制XRD圖譜。

1.5.5 ZT樣品抗氧化性分析

DPPH溶液的配置：稱取5 mg DPPH溶于95%的乙醇溶液中，超聲使其溶解并定容到100 mL，避光冷藏。

樣品溶液的配置：將ZT樣品溶于95%的乙醇配成1mg/mL的溶液。

自由基清除率的測(cè)定：加入DPPH測(cè)試液2 mL于10mL具塞試管中，分別加入ZT樣液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，再加入95%的乙醇溶液，使具塞試管中溶液的總體積為6 mL，混合搖勻，避光反應(yīng)30 min，然后測(cè)其在517 nm 處的吸光度A1，以不加樣品液為空白組，其吸光度為A0。

(2)

式中：A0為空白樣品的吸光度；A1為ZT樣品溶液的吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，利用 Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與分析，采用SPSS進(jìn)行單因素方差分析，通過(guò)Duncan′s多重比較檢驗(yàn)(P<0.05)進(jìn)行顯著性分析，所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 芯壁比對(duì)包封率的影響

由1.2.2測(cè)定的百里香酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.005 5X+0.076 5，R2=0.998 9，n=6。在溶劑反溶劑體積比為1∶4，溶劑反溶劑滴加速率為1.2 mL/min，百里香酚與玉米醇溶蛋白的質(zhì)量比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的條件下，玉米醇溶蛋白-百里香酚微膠囊的包封率如圖1所示。

圖1 芯壁比對(duì)包封率的影響Fig.1 Effect of core-wall ratio on encapsulation efficiency

由圖1可知，隨著芯壁比的減小，玉米醇溶蛋白對(duì)百里香酚的包封率逐漸增大，當(dāng)芯壁比為1∶20時(shí)包封率達(dá)到最大為52.56%±3.75%，隨著芯壁比的進(jìn)一步減小，包封率開(kāi)始逐漸下降。其原因是在芯壁比較大的制備條件下，百里香酚的質(zhì)量過(guò)大，百里香酚與玉米醇溶蛋白的結(jié)合過(guò)飽和，大量的百里香酚游離，致使包封率不高。隨著玉米醇溶蛋白比例的增加，百里香酚與玉米醇溶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)增多，包封率隨之上升。當(dāng)?shù)竭_(dá)最佳芯壁比后，芯壁比繼續(xù)減少，就會(huì)由于芯材百里香酚含量不足，而致使包封率的降低，這與李曉輝等[19]的研究結(jié)果一致，因此選擇芯壁比為1∶20。

2.1.2 溶劑反溶劑混合體積比對(duì)包封率的影響

在芯壁比1∶15，溶劑反溶劑滴加速率為1.2 mL/min，溶劑反溶劑混合體積比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6的條件下，對(duì)包封率的影響如圖2所示。

圖2 溶劑反溶劑混合體積比對(duì)包封率的影響Fig.2 Effect of mixing volume ratio of solvent and anti-solvent on encapsulation efficiency

由圖2可知隨著溶劑反溶劑的混合體積比的減少，ZT微膠囊的包封率逐漸上升，在溶劑反溶劑體積比為1∶5時(shí)，包封率達(dá)到最大，這主要是由于反溶劑蒸餾水的體積較少時(shí)，混合溶液溶度過(guò)高，玉米醇溶蛋白分子之間會(huì)通過(guò)相互作用發(fā)生沉淀聚集而析出，壁材含量下降，導(dǎo)致包封率降低；而隨著體積比的進(jìn)一步減小，反溶劑體積過(guò)多，混合溶液滴加到反溶劑中被稀釋，玉米醇溶蛋白和百里香酚的粒子碰撞減少，導(dǎo)致包封不足，包封率降低，綜上溶劑反溶劑體積比應(yīng)選擇1∶5。

2.1.3 溶劑反溶劑滴加速率對(duì)包封率的影響

在芯壁比為1∶15，溶劑反溶劑體積比為1∶4，溶劑反溶劑混合流速為0.2、0.7、1.2、1.7、2.2 mL/min的條件下，玉米醇溶蛋白-百里香酚微膠囊包封率的變化如圖3所示。

圖3 溶劑反溶劑混合流速對(duì)包封率的影響Fig.3 Effect of mixed solvent flow rate on entrapment efficiency

由圖3可知，隨著溶劑反溶劑的滴加速率增加，ZT微膠囊的包封率逐漸提高，在流速為1.2 mL/min時(shí)達(dá)到最大為37.20%±3.39%，主要是由于滴加速率過(guò)慢，玉米醇溶蛋白粒子之間通過(guò)疏水相互作用相互吸引，聚集形成大顆粒以及絮凝物[20]。隨著滴加速率的增加，粒子的流動(dòng)速度增加，并且隨著攪拌方向做有規(guī)律的離心運(yùn)動(dòng)，減少玉米醇溶蛋白粒子發(fā)生碰撞的機(jī)會(huì)，抑制了玉米醇溶蛋白聚集體的形成，從而使得包封率有所提高[21]，因此溶劑反溶劑的滴加速率應(yīng)為1.2 mL/min。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。以芯壁比、溶劑反溶劑混合體積比、溶劑反溶劑滴加速率(mL/min)為響應(yīng)變量，以包封率為響應(yīng)值對(duì)表2進(jìn)行方差分析、模型顯著性分析以及數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Tab.2 Response surface experiment scheme and results

將響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Design-Expert數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸擬合，得到響應(yīng)值Y和各個(gè)因子之間的二次多元回歸方程模型為：Y=72.26+3.66X1-2.22X2+4.60X1X2-5.69X12-9.63X22-9.10X32，并對(duì)此模型進(jìn)行方差分析，模型顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3的方差分析可知，該模型顯著性檢驗(yàn)P<0.000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)P>0.05不顯著，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該模型的R2值為0.986 8，變異系數(shù)=3.71%，表示98.68%的數(shù)據(jù)符合擬合模型，該模型的擬合程度良好且誤差較小。一次項(xiàng)X1，X2、交互項(xiàng)X1X2以及二次項(xiàng)X12，X22，X32對(duì)包封率的影響均為極顯著(P<0.01)。此外，各因素對(duì)包封率影響的排序?yàn)閄1(芯壁比)>X2(溶劑與反溶劑體積比)>X3(反溶劑流速)。

表3 回歸模型方差分析表Tab.3 Variance analysis table of regression model

響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷贸龅淖顑?yōu)試驗(yàn)條件為芯壁比為1∶21.52，溶劑反溶劑混合體積比為1∶4.98，溶劑反溶劑滴加速率為1.18 mL/min?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將最優(yōu)條件調(diào)整為芯壁比1∶21.5，溶劑反溶劑混合體積比1∶5，溶劑反溶劑滴加速率1.2 mL/min，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)三次。在最優(yōu)條件下包封率達(dá)到54.04%±2.27%，基本符合預(yù)測(cè)值，說(shuō)明模型擬合程度良好，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)正確有效。

2.3 粒徑分析

圖4顯示了玉米醇溶蛋白(a)以及最優(yōu)條件下制備的ZT復(fù)合微粒(b)的粒徑分布圖。基本都是成雙峰分布體積四次矩平均徑D(4,3)是4.863 μm，表面積體積平均徑D(3,2)為0.182 μm，ZT膠體顆粒的粒徑分布呈三峰分布，D(4,3)是1.087 μm，D(3,2)為0.112 μm。與單一的玉米醇溶蛋白相比，ZT復(fù)合粒子的曲線呈現(xiàn)出更寬更低的形態(tài)，原因可能是百里香酚與玉米醇溶蛋白進(jìn)行結(jié)合，導(dǎo)致粒子的粒徑增大，但是復(fù)合顆粒不穩(wěn)定，因此形成的峰較低

(a)玉米醇溶蛋白

2.4 DSC

通過(guò)DSC表征復(fù)合微膠囊的熱力學(xué)性質(zhì)，如圖5所示，百里香酚在50.43 ℃出現(xiàn)一個(gè)尖銳的吸熱峰，主要是由于百里香酚晶體熔化所形成的。在ZT復(fù)合微膠囊的圖譜中并沒(méi)有出現(xiàn)此吸熱峰，表明在形成微膠囊的過(guò)程中百里香酚原有的晶體結(jié)構(gòu)消失，以無(wú)定型的狀態(tài)存在于微膠囊中，同時(shí)抑制了百里香酚在復(fù)合粒子中的結(jié)晶，也有可能是百里香酚顆粒基質(zhì)與玉米醇溶蛋白粒子形成了無(wú)定型復(fù)合物[22]；同時(shí)，ZT復(fù)合顆粒的吸熱峰溫度為84.08℃，焓值為117.4 J/g純玉米醇溶蛋白的吸熱峰溫度為83.39℃，焓值為107.2 J/g略低于復(fù)合顆粒，說(shuō)明復(fù)合微粒的熱穩(wěn)定性提高，這可能是由于百里香酚與玉米醇溶蛋白質(zhì)之間形成新的作用力所導(dǎo)致的。

圖5 差示掃描量熱圖Fig.5 Differential scanning calorimetry

2.5 FTIR

圖6顯示了在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)玉米醇溶蛋白、百里香酚以及ZT復(fù)合微膠囊的紅外光譜圖。紅外光譜的峰形、位移發(fā)生的微小變化都可以表明分子間相互作用的發(fā)生。從圖中可以看出，在3 300 cm-1左右玉米醇溶蛋白以及ZT復(fù)合微膠囊都出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，根據(jù)之前的研究報(bào)道可知3 500～3 100 cm-1范圍內(nèi)的譜帶歸屬于O-H的振動(dòng)收縮[23]。玉米醇溶蛋白與百里香酚形成ZT復(fù)合顆粒以后，相較于純的玉米醇溶蛋白，該特征峰譜帶向低波數(shù)方向移動(dòng)，主要是因?yàn)橛衩状既艿鞍字械孽０坊c百里香酚的羥基之間形成相互結(jié)合形成氫鍵，從而使該處的特征峰向低波數(shù)方向移動(dòng)，可以說(shuō)明百里香酚成功被玉米醇溶蛋白包埋，這與DSC的結(jié)果一致。

此外，玉米醇溶蛋白在酰胺Ⅰ帶(1 750～1 600 cm-1)以及酰胺Ⅱ帶(1 550～1 510 cm-1)也出現(xiàn)兩個(gè)特征峰，酰胺Ⅰ帶主要是由于C-O基團(tuán)以及C-N的基團(tuán)的伸縮振動(dòng)形成的，酰胺Ⅱ帶主要是由于N-H基團(tuán)以及C-N基團(tuán)的彎曲振動(dòng)形成的[24- 25]。從圖6中觀察到加入百里香酚形成ZT復(fù)合顆粒以后峰值的強(qiáng)度都有不同程度上的降低，并且兩個(gè)特征峰都向低波數(shù)方向移動(dòng)，這些變化都表明玉米醇溶蛋白與百里香酚之間不僅有氫鍵作用，由于玉米醇溶蛋白含有較多的疏水性氨基酸，因此復(fù)合粒子中還有部分疏水作用以及靜電相互作用的存在[26]。

圖6 傅里葉紅外光譜圖Fig.6 Fourier infrared spectra

2.6 XRD

X-射線衍射分析主要用來(lái)分析物質(zhì)的結(jié)晶狀態(tài)。百里香酚等活性物質(zhì)被包埋的時(shí)候，其晶體狀態(tài)變成無(wú)定型狀態(tài)[27]。圖7是百里香酚、玉米醇溶蛋白以及ZT復(fù)合顆粒的X-射線衍射圖，由圖中可以看出玉米醇溶蛋白在2θ=9°以及19°的時(shí)候出現(xiàn)兩個(gè)較寬的衍射峰，而ZT復(fù)合顆粒的峰型與玉米醇溶蛋白相似，但是峰的強(qiáng)度較低，說(shuō)明玉米醇溶蛋白以及ZT復(fù)合顆粒均為無(wú)定型結(jié)構(gòu)[28]。百里香酚的XRD圖譜中有很多尖銳的峰出現(xiàn)，表明百里香酚在自然的狀態(tài)下是高度結(jié)晶的；但是，在ZT復(fù)合微膠囊的XRD圖譜中這些尖銳的特征峰完全消失，表明百里香酚被包埋之后是以無(wú)定型的狀態(tài)存在于包埋物中的，這與傅玉穎等[29]的研究結(jié)果一致。

圖7 X-射線衍射圖Fig.7 X-ray diffraction pattern

2.7 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率是體外抗氧化能力的測(cè)定方法，自由基清除率越高則抗氧化能力越強(qiáng)[30]。圖8顯示的是最優(yōu)條件下(芯壁比1∶21.52，溶劑反溶劑混合體積比1∶5，滴加速率1.2 mL/min)制備的樣品對(duì)DPPH的清除率。結(jié)果表明：隨著ZT含量的增加，自由基清除率逐步增加，在樣品添加量為2.5 mg時(shí)清除率可達(dá)47.29%±0.71%。該結(jié)果也說(shuō)明百里香酚被成功包埋并保持了原有的生物活性。

圖8 DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging rate

3 結(jié)論

本文通過(guò)反溶劑法成功制備玉米醇溶蛋白-百里香酚復(fù)合微膠囊，并對(duì)其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，在最佳的工藝(芯壁比1∶21.5，溶劑反溶劑混合體積比1∶5，滴加速率1.2 mL/min)條件下制備的復(fù)合微膠囊，具有較高的包封率為54.04%±2.27%。粒徑分布圖顯示復(fù)合微膠囊粒子大小更均勻。DSC、FTIR以及XRD則證實(shí)百里香酚被成功包埋，百里香酚是通過(guò)氫鍵、靜電相互作用以及疏水作用嵌入到玉米醇溶蛋白之內(nèi)的。DPPH自由基清除率結(jié)果表明該方法制備的復(fù)合粒子可以有效地保持芯材的生物活性；因此，將玉米醇溶蛋白作為活性物質(zhì)的有效載體，可以對(duì)百里香酚等活性物質(zhì)達(dá)到有效的包埋，提高百里香酚的穩(wěn)定性以及生物利用率。