高芳美，陳夏詩，陳茂楠，高芳建，楊 文

（海南醫(yī)學(xué)院，a.第一臨床學(xué)院；b.第二臨床學(xué)院；c.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)院，?？?571199）

植物內(nèi)生菌是指在其生活的全部階段或某一階段存在于健康植物體內(nèi)，不會引起寄主植物明顯病害癥狀的微生物，它與植物在長期的生長進化過程中形成了一種互惠共生相互依存的關(guān)系［1］。近年來，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的植物內(nèi)生菌中部分內(nèi)生菌能夠合成與宿主植物相同或相似的活性成分或是合成一些新的生物活性物質(zhì)［2-4］，其所產(chǎn)生的活性物質(zhì)在抗腫瘤、抑菌、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛等方面發(fā)揮重要的作用［5，6］，其中一些已被證明在新藥發(fā)現(xiàn)中起到非常重要的作用［7］。中國藥用植物資源極為豐富，其中蘊含著大量不為人知的內(nèi)生菌類群，它不僅促進藥用植物的生長，提高藥用植物的生物防治能力和抗逆性而且影響藥材道地性［8］，是新藥及新的抗耐藥微生物藥物發(fā)現(xiàn)的良好資源［9-11］。因此，這一寶貴內(nèi)生菌類群亟待人們?nèi)ヌ剿髋c開發(fā)，植物內(nèi)生菌作為新型藥物的篩選源具有巨大潛力。

石斛（Dendrobium）屬蘭科植物，作為傳統(tǒng)的中藥之一，其含有豐富的生物堿，多糖，氨基酸，酚類等活性成分，藥理研究發(fā)現(xiàn)，石斛具有抗氧化、抗炎、降血糖、調(diào)血脂、抗菌等功效［12，13］，因產(chǎn)地、種質(zhì)、年齡等不同顯著影響其化學(xué)成分，因而藥效作用及內(nèi)生菌的種類也不盡相同［14，15］。昌江石斛（Dendrobium changjiangense），別名萬丈須，是中國海南省特有石斛物種之一［16，17］，主要分布于海南省的三亞、保亭、東方、樂東、昌江等地區(qū)，楊柳等［18］對昌江石斛不同部位進行抗菌活性篩選研究，發(fā)現(xiàn)昌江石斛的乙酸乙酯部位對白假絲酵母菌具有較強抗菌效果。但昌江石斛的內(nèi)生菌方向的研究鮮見報道。本研究對海南霸王嶺國家森林公園的野生昌江石斛進行內(nèi)生細菌的分離，從中篩選和鑒定出具有抗菌活性菌株，可成為人們尋找天然藥物和生物活性物質(zhì)的新方向，同時在保護野生與瀕危藥用植物，新藥研究等方面也具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 新鮮野生昌江石斛采自昌江黎族自治縣境內(nèi)的霸王嶺，經(jīng)海南省霸王嶺林業(yè)局鑒定為蘭科石斛屬昌江石斛；指示菌株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白假絲酵母菌（Candida albicans）、大腸埃希菌（Escherichia coli），廣東環(huán)凱微生物公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基，青島高博園科技公司；DNA提取試劑盒、瓊脂糖、核酸染料，上海生工公司；次氯酸鈉（分析純），西隴化工股份有限公司；無水乙醇（分析純），廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2 試驗儀器HR40-11 A2型生物安全柜（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司），THZ-300C型恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），510P型超聲波清洗器、全自動高壓滅菌器［美國致微（廈門）儀器公司］，生化培養(yǎng)箱（上海博迅儀器有限公司），Vortex-2型渦旋混勻儀（上海滬析實業(yè)有限公司），Mastercycler nexus GX2型PCR儀、5418R型高速離心機（德國艾本德股份公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一生物技術(shù)有限公司），電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司），liB-100型恒溫金屬浴鍋（杭州博日科技有限公司），Tanon 1600型全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物材料表面消毒 取新鮮昌江石斛根、莖、葉，用流水沖去表面泥土，晾干。在無菌環(huán)境下，先用無菌水沖洗3遍，再依次用75%乙醇和2.5%次氯酸鈉分別浸泡30 s和4 min，最后用無菌水漂洗3遍，無菌濾紙吸干表面的水分，取最后一次漂洗的無菌水涂布于分離培養(yǎng)基上作為對照，28℃避光培養(yǎng)3～5 d，檢測植物組織表面消毒是否徹底。

1.2.2 內(nèi)生細菌的分離與純化 在無菌環(huán)境下，將表面消毒的植物組織切成5 mm小段，接種于NA培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)2 d，待組織塊斷面邊緣長出菌后，轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上進行劃線分離純化，獲得純種細菌，并于4℃條件下保存。

1.2.3 代謝產(chǎn)物的提取 用接種環(huán)從固體培養(yǎng)基上蘸取單個菌落細菌后，接種于液體培養(yǎng)基NB中，放入恒溫搖床中培養(yǎng)，37℃、160 r/min，搖床振蕩3 d，得到含有昌江石斛內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，將發(fā)酵好的培養(yǎng)液放入超聲波清洗器，超聲45 min，使細菌更好地破碎、溶解于培養(yǎng)液中。該菌液置于紫外燈下照射45 min，13 000 r/min離心10 min，重復(fù)離心2次。取上清液，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾，得到不含菌的發(fā)酵液。

1.2.4 指示菌的復(fù)蘇 無菌條件下，用75%乙醇消毒西林瓶表面，開蓋后加入復(fù)蘇液，吸取適量移至固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌：NA/NB，37℃，18 h；白假絲酵母菌：PDA/PDB，37℃，48 h），復(fù)蘇后的菌種傳代3次后置于4℃冰箱備用。

1.2.5 瓊脂平板法測定代謝產(chǎn)物抑菌活性［19］吸取200 μL處理過的昌江石斛內(nèi)生細菌發(fā)酵液于無菌空培養(yǎng)皿中，加入50～60℃的無菌營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，混勻，制成含發(fā)酵液的無菌平板和空白對照平板。吸取10 μL培養(yǎng)好的3種指示菌菌液滴至濾紙片上，冷風(fēng)吹干，制成含菌紙片，輕輕貼于含有內(nèi)生細菌發(fā)酵液的平板上，每個發(fā)酵液平板做3次平行試驗，每處理設(shè)置3次重復(fù)。最后將接種好的培養(yǎng)皿放置在37℃恒溫條件下培養(yǎng)，24～48 h后觀察細菌生長現(xiàn)象，計算抑菌率。抑菌率=（L0-L1）/L0×100%。其中，L0為空白對照中指示菌長度，L1為含有內(nèi)生菌發(fā)酵液的指示菌長度（除去紙片自身長度）。

1.2.6 內(nèi)生活性菌的初步鑒定 根據(jù)菌落特性、菌體形態(tài)特征及革蘭染色等對內(nèi)生活性菌進行初步鑒定。

1.2.7 菌種的鑒定 對活性菌株16S rRNA基因片段 進 行PCR擴 增（上 游 引 物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下 游 引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。細菌PCR體系如表1所示，PCR反應(yīng)條件：①94℃預(yù)熱1 min；②循環(huán)：94℃變性1 min、58℃退火40 s、72℃延伸1 min，共經(jīng)歷35個循環(huán)；③72℃延伸10 min；④4℃保溫。成功擴增的DNA送至上海生物工程股份有限公司測序，收到拼接好的序列后利用NCBI（National Center for Biotechnology Information）上用BLAST（局部序列比對基本檢索工具）軟件的N-BLAST（核苷酸序列比對檢索）功能，將所測內(nèi)生細菌的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知的數(shù)據(jù)比對檢索，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征并找到相似性高的菌屬。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.3 數(shù)據(jù)處理

抑菌試驗重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，采用方差分析中的多重比較對不同的內(nèi)生菌發(fā)酵液對同一指示菌的抑菌率進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 昌江石斛內(nèi)生細菌的分離結(jié)果

對昌江石斛植株體進行內(nèi)生細菌分離（表2），如表2所示，共分離得到內(nèi)生細菌10株，其中根5株、莖3株、葉2株。由此可見，昌江石斛根部分離的內(nèi)生細菌最多，葉部最少。

表2 昌江石斛內(nèi)生菌的分離情況

2.2 昌江石斛內(nèi)生細菌的抗菌活性測定結(jié)果

將分離得到的昌江石斛內(nèi)生細菌分別對3種指示菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌）進行初步的體外抗菌活性研究，結(jié)果見表3。如表3所示，通過不同的內(nèi)生菌發(fā)酵液對同一指示菌的多重分析，10株內(nèi)生細菌中有2株具有一定的抑菌效果，其中有1株對3種供試指示菌有抑菌效果，另一株僅對2種指示菌有抑菌效果。由表3可以看出，對大腸埃希菌具有較好抑菌效果的2個菌株中，抑菌率C-06＞C-05，對金黃色葡萄球菌具有較好抑菌效果的是C-06，對白假絲酵母菌具有較好抑菌效果的2個菌株中，C-05與C-06抑菌率相當。昌江石斛內(nèi)生菌對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌的拮抗作用見圖1、圖2、圖3。從圖1至圖3可以看出，C-06菌株的抗菌譜相對較好，對3種供試指示菌均有抑菌活性。

圖3 昌江石斛內(nèi)生菌對白假絲酵母菌的拮抗作用

表3 昌江石斛內(nèi)生細菌對3種供試菌種的抑菌率（n=9）（單位：%）

圖1 昌江石斛內(nèi)生菌對大腸埃希菌的拮抗作用

圖2 昌江石斛內(nèi)生菌對金黃色葡萄球菌的拮抗作用

2.3 昌江石斛內(nèi)生活性菌株的初步鑒定結(jié)果

按照菌落特點和鏡下形態(tài)學(xué)特征的不同，昌江石斛分離出的內(nèi)生細菌10株，昌江石斛內(nèi)生活性菌株的形態(tài)特征、菌落及革蘭染色結(jié)果見表4、圖4和圖5。C-05菌株為革蘭染色陽性桿菌，乳白色干燥型菌落，C-06菌株為革蘭染色陰性桿菌，淡黃色粘液型菌落。

圖4 昌江石斛分離的內(nèi)生菌株的菌落

圖5 昌江石斛內(nèi)生菌革蘭染色

表4 內(nèi)生細菌的形態(tài)特征

2.4 昌江石斛分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

昌江石斛內(nèi)生菌DNA擴增后進行電泳試驗，片段大小與2 000 DNA Marker的1 500 bp相對應(yīng)，由此可知所得片段大小約為1 500 bp左右（圖6）。測序得到的內(nèi)生菌DNA序列分析和BLAST比對，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建出系統(tǒng)進化樹（圖7），結(jié)果顯示，菌株C-05與芽孢桿菌屬（Bacillussp.）的相似性為99%，C-06與類芽孢桿菌屬（Paenibacillussp.）的相似性為99%。根據(jù)比對結(jié)果，可以得出活性菌株隸屬2個屬，分別是芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬，C-05鑒定為芽孢桿菌屬，C-06鑒定為類芽孢桿菌屬。

圖6 內(nèi)生活性菌株DNA提取物PCR產(chǎn)物凝膠電泳擴增結(jié)果

圖7 昌江石斛內(nèi)生抗菌活性菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)與討論

從昌江石斛的根、莖、葉中分離得到10株內(nèi)生細菌中，以根部最多，莖部次之，葉部最少。采用大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌作為供試指示菌分別對10株內(nèi)生細菌進行抗菌活性測定，篩選出2株具有抗菌活性的菌株，其中C-06菌株對3種指示菌都有抗性，顯示抗菌活性強的特性。研究結(jié)果表明，內(nèi)生菌在昌江石斛中分布存在差異，具有抗菌活性的菌株比例比較高，抑菌作用較強的菌株分布在根、莖中。

采用細菌16S rRNA基因序列對分離出的具有抗菌活性菌株進行分子生物學(xué)鑒定和遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，這些內(nèi)生菌分布在芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬中，其中對3種指示菌都有抑制作用的C-06菌株與Paenibacillus具有密切的親緣關(guān)系。

內(nèi)生菌普遍存在于植物組織中，內(nèi)生菌的數(shù)量和種類與植物體不同組織、年齡、生境等有相關(guān)性［20］，石斛作為常用名貴中藥材，石斛的內(nèi)生菌在其生長史中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，王珊珊等［21］對6個不同種的石斛莖組織進行分離，獲得內(nèi)生菌165株，分屬20個菌屬，43個菌種，其中短小桿菌屬和芽孢桿菌屬所占比例最高。高陽等［22］從金釵石斛中分離出的芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬具有緩解高度干旱脅迫對其種子萌發(fā)的影響，Mayer等［7］研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌中的類芽孢桿菌屬等對植物表現(xiàn)出菌株特異性的植物生長促進作用。芽孢桿菌屬因其能分泌多種天然代謝產(chǎn)物，具有防治植物病蟲害、促進生長、抵抗不利生長環(huán)境等作用，逐漸成為研究的重點［23］。本研究通過比較昌江石斛內(nèi)生菌和昌江石斛不同部位的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)生菌的抗菌活性與石斛本身的抗菌活性相當或更優(yōu)［18］，一直以來人們獲得藥物的主要途徑靠的是從藥用植物中提取活性物質(zhì)，但藥用植物生長周期長、人為的過渡采集及生長環(huán)境被破壞等因素，野生石斛資源日趨減少，均會導(dǎo)致天然藥物資源供不應(yīng)求。目前許多研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌可分泌產(chǎn)生和宿主植物相同、相似的活性物質(zhì)，同時內(nèi)生菌具有繁殖周期短、生長速度快、易于工業(yè)化生產(chǎn)等特點［24］，因此活性菌株有望作為醫(yī)藥的生產(chǎn)菌種，用于現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵中生產(chǎn)出昌江石斛的活性物質(zhì)，為篩選具有廣譜性和選擇性的抗菌藥物提供了資源。

本研究中對分離的內(nèi)生細菌的抑菌作用機理只是從抑菌現(xiàn)象上進行了分析，但對內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物以及抑菌機理未進行深入的研究，下一步的研究方向：①提取、分析和鑒定活性菌株的代謝產(chǎn)物，需要深入研究其抑菌作用；②體外具有抗菌活性的菌株，其體內(nèi)抗菌活性如何；③從植物中分離出多株內(nèi)生細菌，但有些菌株在傳代中逐漸失活，考慮在試驗條件上不一定適合所有內(nèi)生菌的生長，可通過模擬石斛植物體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)細菌，以期獲取更多的內(nèi)生菌群；④在石斛等植物的內(nèi)生菌研究方面，大多采用常規(guī)的組織分離方法，獲得的是好氧型微生物且獲得的菌株有限，如加強厭氧型微生物的分離鑒定、結(jié)合新一代的分子生物測序分析技術(shù)對不同產(chǎn)地、不同時期的昌江石斛等進行全面深入研究，可發(fā)掘更多有益的內(nèi)生菌群，作為石斛藥用活性成分篩選的重要來源以及豐富菌種資源庫［20，25］。