海參多肽酶解工藝的優(yōu)化

肖彥春, 關(guān)秀杰, 郝長紅, 郝生宏, 李 爽

（遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 遼寧營口 115009）

海參屬于棘皮動(dòng)物門海參綱的無脊椎動(dòng)物, 全球有11000多種, 可食用的有40多種[1]。海參在各類山珍海味中位尊“八珍”, 國內(nèi)外學(xué)者對40多種海參化學(xué)成分的研究表明, 海參體內(nèi)富含氨基酸、維生素和化學(xué)元素等人體所需的50多種營養(yǎng)成分[2]。近年來, 對海參的深入研究發(fā)現(xiàn), 其含有許多具有重要生物學(xué)活性的物質(zhì), 如酸性黏多糖、多肽、皂苷等[3]。研究表明, 海參多肽具有良好的溶解性和穩(wěn)定性, 易被消化吸收, 具有降血壓、預(yù)防心腦血管疾病、抗疲勞、提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等功效[3-4]。

紅極參屬富含50多種搭配均衡的天然營養(yǎng)成分, 18種氨基酸, 豐富的維生素和礦物質(zhì), 蛋白質(zhì)含量達(dá)36.2%, 脂肪含量僅有0.06%左右, 屬高蛋白、低脂肪、低糖、低膽固醇的健康食品, 是海參中的保健營養(yǎng)極品。以紅極海參體壁為原料, 以多肽得率為指標(biāo), 篩選合適的蛋白酶, 并優(yōu)化其酶解工藝, 為以其為原料開發(fā)多肽產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器試劑

1.1.1 材料

干制紅極參, 大連御品堂水產(chǎn)品有限公司提供；木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶, 河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.1.2 儀器設(shè)備與試劑

組織搗碎機(jī)、H1850型高速離心機(jī)、FA2004型天平、7230G型可見分光光度計(jì)、HWZ-24型電熱恒溫水浴鍋等。

結(jié)晶牛血清蛋白（BSA）、三氯乙酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅等, 均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解工藝

將海參放入燒杯中, 加入去離子水并沒過海參, 隔4 h換1次水, 進(jìn)行脫鹽處理。采用硝酸銀滴定法進(jìn)行檢驗(yàn), 若浸泡液中無白色沉淀析出則表示脫鹽完成。

將海參剁碎, 稱取5 g, 按料液比加水, 攪拌均勻, 用合適的酸堿溶液調(diào)節(jié)酶的最適的pH值, 加入一定量的酶, 調(diào)節(jié)水浴至合適的溫度, 酶解一定的時(shí)間, 將其煮沸后計(jì)時(shí)10 min, 取下冷卻, 使酶失去活性, 得到海參多肽酶解液。

1.2.2 蛋白酶的選擇

取3個(gè)不同的酶（木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶）酶解海參。分別做3個(gè)平行試驗(yàn)。通過比較3種酶解液中多肽得率, 從中篩選出最佳蛋白酶。

蛋白酶的選擇見表1。

表1 蛋白酶的選擇

1.2.3 酶解單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）酶解溫度的選擇。溫度對酶活性有很大影響, 溫度過高或過低都會降低酶的活性。在加酶量為1500 U/g, 料液比為1∶4, 酶解pH值為6.5時(shí), 酶解時(shí)間3 h, 設(shè)置溫度分別為50, 55, 60, 65, 70℃, 研究不同溫度對酶解液多肽得率的影響。

（2）酶解pH值的選擇。在加酶量為1500 U/g, 料液比為1∶4, 酶解時(shí)間為3 h, 酶解溫度65℃的條件下用濃度為0.05 moL/L的NaOH溶液和1%HCl溶液調(diào)節(jié)pH值, 在酶解pH值分別為5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5時(shí), 研究不同pH值對酶解液多肽得率的影響。

（3）酶解時(shí)間的選擇。在加酶量為1500 U/g, 料液比1∶4, 酶解溫度為65℃, 酶解pH值6.5的條件下, 設(shè)置酶解時(shí)間分別為2, 3, 4, 5, 6 h, 研究不同酶解時(shí)間對酶解液多肽得率的影響。

（4）加酶量的選擇。在料液比1∶4, 酶解溫度為65℃, 酶解時(shí)間為4 h, pH值6.5的條件下設(shè)定加酶量為500, 1500, 3000, 4500, 6000 U/g, 研究不同加酶量對酶解液多肽得率的影響。

（5）料液比的選擇。在加酶量為4500 U/g, 酶解pH值為6.5, 酶解溫度為65℃, 酶解時(shí)間為4 h的條件下, 設(shè)置料液比分別為1∶3, 1∶4, 1∶5, 1∶5, 1∶6, 1∶7, 研究不同料液比對酶解液多肽得率的影響。

1.2.4 確定酶解最佳工藝條件的正交試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果, 以多肽得率為考查指標(biāo), 采用三因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。研究木瓜蛋白酶酶解溫度（A）, pH值（B）, 料液比（C）對指標(biāo)的影響, 以確定最佳酶解反應(yīng)條件。

L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的測定

取6個(gè)50 mL容量瓶, 配置0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白質(zhì)溶液, 用水補(bǔ)至50 mL, 然后取6支試管, 試管分別加6 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液在加入4 mL雙縮脲試劑。以轉(zhuǎn)速2000 r/min離心10 min, 在室溫（20～25℃）下放置30 min, 于波長540 nm處進(jìn)行比色。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo), 吸光度作為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得回歸方程為Y=0.0717X-0.0024, 相關(guān)系數(shù)R2=0.9941。

1.2.6 多肽含量的測定

取5 mL酶解液至于離心管中, 加入100 mg/mL三氯乙酸溶液5 mL, 以轉(zhuǎn)速4000 r/min離心15 min, 其上清液用50 mg/mL的三氯乙酸定容至50 mL的容量瓶中, 取6 mL再加4 mL雙縮脲溶液到離心管中, 靜置10 min, 以轉(zhuǎn)速2000 r/min離心10 min, 取出用可見分光光度計(jì)進(jìn)行比色測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

不同蛋白酶的水解效果見表3。

表3 不同蛋白酶的水解效果

以酶解后多肽得率為指標(biāo), 從表3可以看出, 酶解能力由強(qiáng)到弱的排列順序?yàn)槟竟系鞍酌福疽鹊鞍酌福静ぬ}蛋白酶。因此選擇木瓜蛋白酶作為海參多肽的最適佳分解酶。

2.2 酶解工藝的優(yōu)化

2.2.1 酶解溫度對多肽得率的影響

酶的催化作用受溫度影響很大, 溫度升高, 反應(yīng)速率加快, 但隨溫度升高, 酶蛋白會逐漸變性而失活, 引起酶反應(yīng)速率下降[5]。不同蛋白酶都有其最適的酶反應(yīng)溫度, 但會受到酶的純度、底物及pH值等因素的影響。

不同溫度對酶解液多肽得率的影響見圖1。

圖1 不同溫度對酶解液多肽得率的影響

從圖1可以看出, 在50～65℃時(shí), 酶解后多肽得率逐漸升高, 65℃時(shí)達(dá)到最高, 隨著溫度繼續(xù)升高, 酶解作用逐漸減弱。因此, 最佳的酶解溫度在65℃左右。

2.2.2 酶解pH值對多肽得率的影響

不同pH值溫度對酶解液多肽得率的影響見圖2。

圖2 不同pH值溫度對酶解液多肽得率的影響

從圖2可以看出, 用木瓜蛋白酶酶解海參多肽最適pH值6.5左右, 隨著pH值升高, 酶解活力也隨之下降。每種酶都有最適pH值, 當(dāng)偏離最適pH值時(shí), 維持酶三維結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵受到離子作用力的干擾, 從而會導(dǎo)致酶蛋白自身會發(fā)生變性。因此, 酶解pH值宜控制在6.5左右。

2.2.3 酶解時(shí)間對多肽得率的影響

在酶解的過程中, 并非酶解時(shí)間越長酶解效果越好, 還需要尋找最佳的酶解時(shí)間。

不同時(shí)間對酶解液多肽得率的影響見圖3。

圖3 不同時(shí)間對酶解液多肽得率的影響

從圖3可以看出, 隨著酶解時(shí)間的增加, 多肽得率逐漸增加, 在4～5 h趨于平穩(wěn), 隨著時(shí)間的延長, 多肽得率又逐漸降低, 可能隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行, 多肽進(jìn)一步酶解成氨基酸, 從而降低酶解液中多肽的得率。因此, 酶解時(shí)間不宜太長, 以4 h為優(yōu)。

2.2.4 加酶量對多肽得率的影響

不同加酶量對酶解液多肽得率的影響見圖4。

從圖4可以看出, 加酶量為4500 U/g時(shí)多肽得率達(dá)到最高, 隨著加酶量的增加, 多肽得率逐漸降低。酶的用量大于最適濃度時(shí), 過量的酶很難與底物接觸, 不能提升對底物蛋白的水解。因此, 選用加酶量為4500 U/g。

圖4 不同加酶量對酶解液多肽得率的影響

2.2.5 料液比對多肽得率的影響

不同料液比對酶解液多肽得率的影響見圖5。

從圖5可以看出, 隨著物料比的增加, 多肽得率逐漸升高, 料液比1∶3時(shí)達(dá)到最高, 之后又逐漸降低, 主要可能是料液比大時(shí)體系水分較少, 底物黏稠, 酶解反應(yīng)較慢, 隨著水分增加, 酶與底物接觸多, 水解速率增大, 但隨著料液比的增加, 降低了體系中酶的濃度, 使得酶促反應(yīng)速度下降, 水解度降低。因此, 料液比選擇1∶3較為合適。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上, 以多肽得率為指標(biāo), 對料液比、酶解溫度、酶解pH值等3個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)和結(jié)果分析見表4。

表4 正交試驗(yàn)和結(jié)果分析

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 對海參酶解的主要因素（酶解溫度、pH值、料液比）進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn), 正交試驗(yàn)結(jié)果表所示, 各因素的影響次序?yàn)槊附鉁囟龋ˋ）＞料液比（C）＞pH值（B）, 得出理論的最優(yōu)組合為A2B3C2, 即酶解溫度為65℃, pH值為6.5, 料液比為1∶4。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出, 試驗(yàn)最佳組合為A2B3C1, 通過試驗(yàn)驗(yàn)證比較, 確定最優(yōu)酶解工藝為A2B3C2, 即酶解溫度為65℃, pH值為6.5, 料液比為1∶4, 酶解時(shí)間為4 h, 加酶量為4500 U/g。

最優(yōu)試驗(yàn)組合驗(yàn)證見表5。

表5 最優(yōu)試驗(yàn)組合驗(yàn)證

3 結(jié)論

試驗(yàn)以紅極參為原料制備海參多肽, 以多肽得率為指標(biāo), 篩選最優(yōu)蛋白酶, 分別研究了酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH值、加酶量、料液比對海參酶解液多肽得率的影響, 并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上, 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化確定最佳酶解工藝為酶解溫度65℃, pH值6.5, 料液比1∶4, 酶解時(shí)間4 h, 加酶量4500 U/g, 此時(shí)酶解多肽得率為15.40%, 為海參肽產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論指導(dǎo)。