絲素調(diào)控磷酸鈣晶體的生長過程研究

2022-09-26 06:39:58曹金平徐曉春趙瑞波崔福齋孔祥東

絲綢 2022年9期

曹金平, 徐曉春, 趙瑞波, 崔福齋, 孔祥東

(1.浙江理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,杭州 310018; 2.清華大學(xué) 材料學(xué)院,北京 100084)

人類骨骼中的主要成分是膠原和磷酸鈣。基于模仿天然骨成分和結(jié)構(gòu)的仿生思路,在膠原調(diào)制磷酸鈣礦化基礎(chǔ)上制備的骨植入材料近年來已經(jīng)被廣泛地發(fā)展[1-3]。有機(jī)基質(zhì)調(diào)制生物礦化研究也成為化學(xué)、生物、材料及醫(yī)學(xué)研究熱點,在有機(jī)基質(zhì)調(diào)制磷酸鈣礦化的研究中發(fā)現(xiàn),有機(jī)質(zhì)相對分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)、反應(yīng)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)等條件會影響體系中磷酸鈣晶體的生長過程,并影響最終復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)、性能[4-7]。在生物材料研究中,還需考慮材料在生物體內(nèi)的生物相容性和可降解性能[8-11]。絲素蛋白作為一種天然的絲蛋白,表現(xiàn)出優(yōu)異的人體生物安全性,被廣泛應(yīng)用于生物復(fù)合材料的制備[12-13]。在對磷酸鈣/絲素體系的研究中,選用的絲素蛋白為天然蠶絲的纖維織物或蠶絲纖維機(jī)械粉碎后的超細(xì)粉體[14-17],由于天然蠶絲是具有β折疊結(jié)構(gòu)的高分子,相對分子質(zhì)量達(dá)到30萬,在體內(nèi)難以降解,不能用來開發(fā)對降解速度有嚴(yán)格要求的多種組織工程材料,此外,超細(xì)蠶絲粉體中由于含有生物相容性較差的絲膠蛋白,用其開發(fā)的材料仍不能用作醫(yī)用材料[18]。盡管不同性質(zhì)的絲素蛋白用于調(diào)控磷酸鈣礦化的研究已較深入,但絲素蛋白在溶液體系中作為有機(jī)基質(zhì)調(diào)制磷酸鈣晶體生長過程的研究尚未探明。

本研究以水解方法獲得的水溶性絲素蛋白作為有機(jī)基質(zhì),選用相對溫和的生物礦化環(huán)境,對絲素調(diào)制磷酸鈣晶體生長的過程進(jìn)行研究,最終制備出一種微米級羥基磷灰石/絲素(簡寫為HA/絲素)復(fù)合材料。該方法是在絲素蛋白分子自組裝的同時制備復(fù)合材料,遵循了生物自組裝的思路,制備的材料有望具有良好的生物學(xué)性能,并采用紅外光譜就絲素蛋白對羥基磷灰石晶體生產(chǎn)過程進(jìn)行細(xì)致分析。

1 實驗

1.1 試劑與材料

試劑:Na2CO3、CaCl2、NaH2PO4、NaOH,均為分析純(北京化學(xué)試劑有限公司)。

絲素蛋白溶液制備:家蠶蠶繭在0.5%的Na2CO3溶液中脫去絲膠,每次脫膠時間為30 min;將脫膠后得到的絲素用去離子水清洗后,80 ℃烘干;然后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42%的沸騰CaCl2溶液中溶解10 min;將所得溶液在4 ℃的去離子水中透析3 d,去除鹽分;將得到的溶液經(jīng)濃縮、離心后,4 ℃保存。

冷凍干燥絲素蛋白制備:取部分上述溶液冷凍干燥后用作對照。

1.2 方法

100 ℃條件下,在2 700 mL的30 mmol/L CaCl2溶液中溶解4.07 g絲素蛋白(絲素蛋白的相對含量為羥基磷灰石理論產(chǎn)量的50%)[18],冷卻至室溫,用0.5 mmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0左右;將1 620 m的30 mmol/L NaH2PO4溶液逐滴加入反應(yīng)溶液中,整個反應(yīng)過程中溶液需要不斷攪拌,并維持反應(yīng)的pH值在8.0左右。每隔0.5 h從反應(yīng)體系中取出150 mL溶液進(jìn)行抽濾,收集顆粒沉淀物并以去離子洗滌,標(biāo)記為CaP-SF;不添加絲素蛋白的反應(yīng)體系合成的顆粒沉淀物標(biāo)記為CaP-0。所獲得樣品經(jīng)冷凍干燥后,研磨成粉。

1.3 測試分析

1.3.1 傅里葉紅外光譜分析(FTIR)

采用溴化鉀壓片法分別將樣品CaP-SF、CaP-0按質(zhì)量比1︰100與溴化鉀粉末混合,充分研磨后壓片(30 MPa,45 s)。利用SpectrumGx傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Electron Corporation)進(jìn)行化學(xué)官能團(tuán)分析,分辨率0.3 cm-1,掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.3.2 熱重分析(TG)

在流動的氮氣氣氛下,利用TGA2050熱重分析儀(日本Hitachi公司),分別分析樣品CaP-SF、CaP-0的有機(jī)物與無機(jī)物的含量百分比及其分解溫度,其中升溫速率為20 ℃/min,測定的溫度范圍為30～800 ℃。

1.3.3 場發(fā)射掃描電鏡分析(FE-SEM)

將樣品用無水乙醇超聲分散后,噴金。采用LEO-1530熱場發(fā)射掃描電鏡(日本Hitachi公司)先對樣品進(jìn)行形貌觀察,電壓為3 kV;再對材料進(jìn)行能譜分析,電壓為10 kV。

2 實驗分析

2.1 傅里葉紅外光譜結(jié)果分析

圖1 不同反應(yīng)時間的CaP-0和CaP-SF的FTIR圖譜Fig.1 FTIR spectra of CaP-0 and CaP-SF in different reaction times

由圖1(a)可見,隨著反應(yīng)時間的延長,各相關(guān)基團(tuán)對應(yīng)的吸收峰所在位置幾乎沒有發(fā)生變化,但吸收峰強(qiáng)度略有降低。HA是磷酸鈣熱力學(xué)上最穩(wěn)定的相,盡管CaP-0中的沉淀最終也能夠轉(zhuǎn)變?yōu)镠A,但是需要16 h以上才能夠完全轉(zhuǎn)變?yōu)镠A。

從圖1(b)(c)可以看到,反應(yīng)5.5 h前,CaP-SF樣品中酰胺Ⅱ的強(qiáng)度呈不斷增加的趨勢,而反應(yīng)5.5 h后樣品譜線的強(qiáng)度則又呈現(xiàn)降低的趨勢。本研究認(rèn)為:5.5 h前的樣品中,共沉淀物中蛋白質(zhì)的含量是不斷增加的,引起酰胺Ⅱ的強(qiáng)度增加;5.5 h后的樣品中,由于蛋白質(zhì)與HA晶體發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用,有更多的HA晶體與蛋白質(zhì)結(jié)合,N—H平面彎曲和C—N的伸縮振動受到較大程度的抑制,從而引起酰胺Ⅱ強(qiáng)度降低。

2.2 熱重結(jié)果分析

圖2是CaP-0和CaP-SF在不同反應(yīng)時間的TG曲線和DTG曲線(TG曲線的微分曲線)。從CaP-0的TG曲線中可見(圖2(a)),不同反應(yīng)時間的曲線相似,在145～213 ℃急劇下降。該范圍內(nèi)CaP-0樣品的質(zhì)量減少了約20%,與DCPD分子內(nèi)含21%的結(jié)晶水的比例非常接近,因而此處主要是由于DCPD分子內(nèi)的結(jié)晶水分解造成的熱失重。由圖2(a)TG曲線中還可以看到,不同反應(yīng)時間的樣品在700 ℃時殘余質(zhì)量百分比不同。隨著反應(yīng)時間的加長,剩余樣品的質(zhì)量百分比略微升高,表明隨反應(yīng)的進(jìn)行,樣品中DCPD的含量有減少趨勢。由此可證明,反應(yīng)過程中DCPD會發(fā)生部分晶相轉(zhuǎn)變,生成了含有結(jié)晶水比例更低或者不含結(jié)晶水的磷酸鈣。從圖2(a)DTG曲線上可以看到,CaP-0樣品中DCPD的最大分解溫度出現(xiàn)在(188±1) ℃附近,此時CaP-0樣品的失重速度最快。另外,從圖2(a)DTG曲線上還可以看到,CaP-0樣品在430 ℃左右有一處吸熱峰,該處的吸熱峰是由于CaHPO4發(fā)生化學(xué)反應(yīng),生成了焦磷酸鈣(Ca2P2O7)的緣故。

圖2 不同反應(yīng)時間的CaP-0和CaP-SF的TG及DTG曲線Fig.2 TG and DTG curves of CaP-0 and CaP-SFin different reaction times

從CaP-SF樣品的TG曲線和DTG曲線上可以看到(圖2(b)),在40～60 ℃曲線上有一個與空氣揮發(fā)有關(guān)的峰,最大揮發(fā)溫度隨樣品中HA含量的增加而升高?？梢酝茢?這是由于隨著反應(yīng)的進(jìn)行,在CaP-SF中生成的磷酸鈣/絲素復(fù)合物尺寸減小,空隙度增加,從而加大了對空氣的吸附力度。在100 ℃左右,曲線上有一水分蒸發(fā)形成的峰。在145～208 ℃顯示了DCPD的分解峰,DCPD的最大分解溫度在(179±2) ℃,比CaP-0樣品中的分解溫度要低6～10 ℃。

而且隨著樣品中生成HA含量的增多,最大分解溫度呈現(xiàn)弱的降低趨勢。在270～390 ℃的峰,是由于磷酸鈣/絲素復(fù)合物中絲素蛋白的分解造成的。絲素蛋白作為有機(jī)基質(zhì),在高溫下蛋白質(zhì)會發(fā)生肽鍵裂解和氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的分解。相關(guān)文獻(xiàn)中記錄絲素蛋白的最大分解溫度為290 ℃左右,然而圖2(b)的DTG曲線顯示絲素蛋白的最大分解溫度出現(xiàn)在340 ℃,分析認(rèn)為是由于磷酸鈣與絲素蛋白形成的化學(xué)鍵合作用增強(qiáng)了絲素蛋白的溫度耐受性。CaP-SF樣品的DTG曲線上也能夠看到430 ℃左右的吸熱峰,但隨著反應(yīng)時間的增加,樣品中DCPD的含量不斷減少,生成的CaHPO4數(shù)量也隨之減少,在該處吸熱峰的強(qiáng)度也就不斷降低了。

根據(jù)CaP-SF樣品在不同溫度范圍內(nèi)的失重情況,計算出樣品中各成分的相對百分含量,如表1所示。計算結(jié)果表明,不同沉積時間的CaP-SF樣品中除少量的水分,還含有數(shù)量不等的絲素蛋白。在反應(yīng)5.5 h前的樣品中,絲素蛋白的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢;在反應(yīng)5.5 h后的樣品中,其含量則相對穩(wěn)定,維持在14.3%左右。這個結(jié)果進(jìn)一步證明了絲素蛋白與磷酸鈣發(fā)生共沉淀,此外,樣品中絲素蛋白含量變化對應(yīng)FTIR圖譜中酰胺Ⅱ強(qiáng)度的變化趨勢。

表1 不同反應(yīng)時間的CaP-SF中各成分的相對百分含量Tab.1 Relative percentage of each component inCaP-SF in different reaction times

從表1可以看出,在反應(yīng)初期得到的樣品中無機(jī)相DCPD的相對含量高達(dá)85.6%,隨著反應(yīng)時間的推移,樣品中DCPD的含量逐漸下降;反之,HA在樣品中的含量逐漸增加,在反應(yīng)10 h后的樣品中,HA的含量達(dá)到了75.8%。而上述TG分析的結(jié)果顯示,反應(yīng)2.5 h的CaP-SF樣品中DCPD以外的結(jié)晶相已達(dá)17.4%,這些結(jié)晶相被認(rèn)為是HA或者HA的前體物(表1中均以HA計)。

2.3 場發(fā)射掃描電鏡結(jié)果分析

在做掃描電鏡形貌觀察時,發(fā)現(xiàn)CaP-0樣品主要是大的片層結(jié)構(gòu)。圖3(a)(b)僅列了反應(yīng)時間為0.5 h和10.0 h時CaP-0樣品照片。從圖3(a)(b)可以看到,CaP-0樣品中的磷酸鈣主要以薄片狀DCPD的形式存在,晶體的長度與寬度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于晶體的厚度,電鏡下觀察時發(fā)現(xiàn)有的DCPD的結(jié)晶片長度可以達(dá)到200 μm,呈現(xiàn)典型的DCPD晶體的形貌結(jié)構(gòu)。只是隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行,生成的晶體的表面發(fā)生了部分變化。如圖3(a)中,DCPD表面比較平整,并有少量無定型的磷酸鈣附著;圖3(b)中,DCPD結(jié)晶片的表面已經(jīng)開始變得粗糙,表面是細(xì)小的顆粒物沉積,可能是晶相開始發(fā)生轉(zhuǎn)變的征兆。

圖3 不同反應(yīng)時間的CaP-0和CaP-SF的SEM照片F(xiàn)ig.3 SEM images of CaP-0 and CaP-SF in different reaction times

圖3(c)(d)是反應(yīng)時間為0.5 h和2.5 h時CaP-SF樣品的照片,可以看到磷酸鈣形貌發(fā)生了較大的變化。在圖3(c)中的DCPD雖然多數(shù)呈片狀結(jié)構(gòu),但是由于受到溶液中蛋白基質(zhì)的影響,晶體的厚度要比CaP-0中大得多。圖3(d)中的CaP-SF樣品,雖然其中的磷酸鈣仍然以DCPD為主,但是片狀DCPD晶體的表面有許多呈現(xiàn)一定走向的磷酸鈣沉積。掃描電鏡EDS能譜分析發(fā)現(xiàn),該區(qū)域的Ca/P為1.05左右,與實際DCPD中的Ca/P比數(shù)據(jù)也是相當(dāng)接近的。同時,樣品中新出現(xiàn)了一些不規(guī)則的顆粒狀磷酸鈣,是DCPD發(fā)生晶相轉(zhuǎn)變后形成的新的物相的磷酸鈣。EDS能譜分析表明,顆粒狀磷酸鈣的Ca/P為1.33,與磷酸八鈣(OCP)的數(shù)據(jù)是一致。同時樣品中均含有較高含量的碳元素(15.22%±3.7%),表明樣品中的磷酸鈣與絲素是復(fù)合在一起的,并不能將它們從形貌上區(qū)別開來。

3 結(jié)果討論

分析上述研究結(jié)果可知,絲素蛋白對磷酸鈣結(jié)晶過程起了控制作用,顯著地促進(jìn)了磷酸鈣的晶相轉(zhuǎn)變,形成了磷酸鈣/絲素復(fù)合物。

1) 在制備實驗樣品時,有一個從混濁溶液中抽濾分離沉淀的過程。在過濾CaP-SF反應(yīng)初期的沉淀物時,過濾速度非?？?而隨著反應(yīng)的進(jìn)行,利用抽濾方法使水與沉淀物分離的速度越來越慢。研究結(jié)果反應(yīng)的沉淀尺寸變化可以很好地解釋實驗時的現(xiàn)象:由于反應(yīng)生成的沉淀物的顆粒尺寸不斷變小,聚集度逐漸增加,在濾紙底層形成一層致密的膜,限制了水分子流動速度。

2) CaP-SF樣品的SEM照片顯示了磷酸鈣/絲素復(fù)合物的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)有一個明顯的演變過程,與CaP-0中的樣品相比,這種演變說明絲素蛋白作為有機(jī)基質(zhì)對磷酸鈣的晶體生長產(chǎn)生了重大的影響。通過前文的FTIR結(jié)果可以知道,CaP-SF最終的樣品中無機(jī)相的成分主要是羥基磷灰石,它與絲素蛋白通過化學(xué)鍵合形成了復(fù)合物,最終CaP-SF樣品中出現(xiàn)了大量微米級的磷酸鈣。

4) 本研究肯定了絲素蛋白在調(diào)制生物礦化過程中所起的作用,雖然絲素蛋白中羧基含量較少,但是蛋白質(zhì)肽鍵上含有豐富的羰基及其他極性基團(tuán),這些基團(tuán)在水溶性絲素中能夠充分暴露,當(dāng)與Ca2+結(jié)合后可以促進(jìn)形核作用。另外,蛋白質(zhì)多肽鏈中的極性氨基酸殘基也會影響生物礦化過程。這些極性氨基酸殘基如天門冬氨酸、精氨酸、谷氨酸等并非均勻地分布在多肽鏈上,而是以一種極性團(tuán)簇的形式存在,它們也能夠結(jié)合一定數(shù)量的鈣離子并促進(jìn)形核作用,繼而降低了產(chǎn)生HA晶體所需要的活化能。由于反應(yīng)溶液中含有較高濃度的絲素蛋白,有大量晶核可以形成,大量晶核的存在消耗了溶液中的大量鈣離子,限制了HA晶體的進(jìn)一步長大,使其維持在微米尺度。

磷酸鈣體系極為復(fù)雜的一個原因是其存在多種結(jié)晶相。羥基磷灰石是磷酸鈣熱力學(xué)上最穩(wěn)定的相,但它在溶液中的析出通常伴隨若干前體相的沉淀,如無定型磷酸鈣。不同溶液條件下形成的前體相類型也不同。反應(yīng)2.5～7.5 h的CaP-SF樣品的SEM結(jié)果中發(fā)現(xiàn)除了DCPD,還有OCP的存在,但這并不影響得出肯定的結(jié)論,即最終CaP-SF樣品中磷酸鈣的結(jié)晶相主要是HA。因為本研究所用的溶液中具有較高的離子強(qiáng)度和較強(qiáng)的堿性,在此條件下,DCPD較先產(chǎn)生,隨后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為OCP,最終轉(zhuǎn)化為熱力學(xué)穩(wěn)定的HA。