陽離子淀粉與硒化淀粉混合對淀粉基仿生谷胱甘肽過氧化物酶催化活性的影響

張瑞瑞，石 成，胡漢嬌，鐘書明，鄭韻英，梁興唐，尹艷鎮(zhèn)

（廣西綠色化工新材料與安全技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，北部灣大學(xué)石油與化工學(xué)院，廣西欽州 535011）

硒是一種微量元素，硒及其化合物雖然都具有一定毒性，但是硒是動植物必需的營養(yǎng)元素。硒在生命化學(xué)中的作用依賴于一個獨(dú)特的官能團(tuán)：硒醇基團(tuán)（-SeH）。谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）以還原性谷胱甘肽（Glutathione，GSH）為底物，催化還原多種過氧化物，進(jìn)而清除細(xì)胞組織中過量的脂質(zhì)過氧化物和自由基，避免機(jī)體受過氧化物損傷。這對于保持生物體正常的生理代謝起著重要的作用，通常將GPx 活性作為衡量硒在人體內(nèi)功能的指標(biāo)。GPx對治療和預(yù)防克山病、心血管病、炎癥及癌癥等疾病具有很重要的作用。天然GPx 是優(yōu)秀的生物催化劑，在溫和的條件下具有高效的催化特異性。然而，幾乎所有的天然GPx 都具有蛋白質(zhì)固有的缺點(diǎn)，包括體外穩(wěn)定差、來源有限、利用率低、成本高，難以回收和難再生等。近年來，天然GPx 的獨(dú)特催化性能激發(fā)了許多科學(xué)家推動仿生GPx 模擬催化劑的開發(fā)。仿生GPx 的研究進(jìn)展不僅促進(jìn)了人們對催化機(jī)理的認(rèn)識，也促進(jìn)了具有潛在醫(yī)藥應(yīng)用前景的仿生GPx 的生產(chǎn)。將硒或碲引入仿生GPx 中已成為人工酶研究的熱點(diǎn)。

淀粉作為可再生的天然高分子材料具有很大的開發(fā)前景，本文在前期研究了以木薯淀粉（Cassava Starch，CS）為骨架構(gòu)建仿生GPx，辛烯基琥珀酸淀粉酯（Starch Octenyl Succinate，OSA-starch）與硒氫化鈉（NaSeH）的親核加成反應(yīng)為所得硒化淀粉（Selenized Starch，SCS）提供了催化活性位點(diǎn)（-SeH）和疏水微環(huán)境，賦予SCS 良好的抗氧化催化活性。同時在SCS 上添加正電荷基團(tuán)，能夠有效地模擬識別位點(diǎn)，與催化中心有效配合能夠富集底物，對催化活性具有提升作用，但在SCS 上直接修飾陽離子基團(tuán)所受到的影響因素比較多，很難保證催化中心和正電荷基團(tuán)達(dá)到最佳配合，而且過多的陽離子改性會導(dǎo)致催化活性降低。合成制備具有正電荷基團(tuán)的陽離子淀粉（Cationic Starch，CCS）與SCS 進(jìn)行有效地混合，SCS 提供的催化活性位點(diǎn)（-SeH）和疏水微環(huán)境與CCS 的正電荷基團(tuán)實(shí)現(xiàn)有效配合，可以提升SCS 的催化活力。同時，陽離子淀粉的制備工藝比較成熟，可以進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，因此本研究采用SCS 與CCS 混合構(gòu)建類GPx 的催化中心、疏水微環(huán)境、識別位點(diǎn)，通過類GPx 的催化活性測試和催化機(jī)理分析，表明提升淀粉基仿生谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的催化活力，這些可以為淀粉基仿生GPx 規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用提供了理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辛烯基琥珀酸酐、無水硫酸銅、硼酸、甲基紅、芘 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、硫酸鉀、氫氧化鈉、硫酸、硝酸、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 西隴科學(xué)股份有限公司；硼氫化鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硒粉 天津市大茂化學(xué)試劑廠；溴甲酚綠 成都市科隆化學(xué)品有限公司；4-硝基苯硫酚 英國Fluorochem 公司；過氧化氫 成都金山化學(xué)試劑有限公司；高氯酸 福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨 上海麥克林生化科技有限公司；以上試劑均為分析純；氮?dú)猓?9.99%）廣西瑞達(dá)化工科技有限公司；木薯淀粉（工業(yè)級）廣西農(nóng)墾明陽生化集團(tuán)有限公司；3-羧基-4-硝基苯硫酚（TNB）根據(jù)Dong 等報道的方法自制。所有化學(xué)試劑無需進(jìn)一步純化即可使用。

PSB 50-72 石墨消解器 Perkin-Elmer 美國股份有限公司；AFS-9530 原子熒光光度計 北京海光儀器有限公司；Perkin-Elmer Frontier 傅里葉變換紅外光譜儀 美國Perkin-Elmer 股份有限公司；AVANCE III HD 500 MHz 核磁共振波譜儀、D8 ADVANCE X 射線衍射儀 德國布魯克科技公司；Sigma HD 掃描電子顯微鏡 德國蔡司股份公司；UV-2600 紫外可見分光光度計 日本島津公司；TG/DSC 1 熱分析儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Agilent Cary Eclipse 熒光分光光度計 美國安捷倫科技有限公司；Zetasizer Nano-ZS 納米粒度及Zeta 電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 硒化木薯淀粉的制備 將135.2 mg 硒粉（Se）和194.3 mg 硼氫化鈉（NaBH）置于三口燒瓶中，通入氮?dú)?0 min 除去體系中的空氣，然后在氮?dú)夥諊孪驘恐屑尤?0 mL 無氧的去離子水。反應(yīng)在室溫條件下進(jìn)行30 min，得到硒氫化鈉（NaSeH）溶液。在氮?dú)夥諊蛿嚢璧臈l件下，將上述NaSeH 溶液滴加到含有5.0 g OSA-starch（DS=0.012）和80 mL乙醇的250 mL 燒瓶中。反應(yīng)在40 ℃下保持6 h。然后在氮?dú)夥諊掠萌ルx子水和75%乙醇交替洗滌產(chǎn)物，在55 ℃真空干燥24 h 后，獲得SCS（圖1）。

圖1 SCS 的合成Fig.1 Synthesis of SCS

1.2.2 陽離子淀粉的制備 根據(jù)任紅銳等、冒愛榮等的實(shí)驗方法，將20.0 g 木薯淀粉和100 mL異丙醇水溶液（30%，w/w）配制成乳液，加入1.0 g NaOH 進(jìn)行活化30 min，將4.0 g 2,3-環(huán)氧丙基三甲氯化銨（GTA，基于淀粉樣品質(zhì)量的25%）溶解于20 mL 去離子水中，并緩慢滴加入淀粉乳液中，滴加完畢以后在40 ℃下攪拌進(jìn)行反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后用HCl 溶液（0.5 mol/L）逐滴加入直至反應(yīng)液成中性，真空抽濾反應(yīng)液，然后采用去離子水和75%乙醇交替洗滌產(chǎn)物，最后在55 ℃條件下烘干12 h，即可得到陽離子淀粉（CCS）樣品（圖2）。

圖2 CCS 的合成Fig.2 Synthesis of CCS

1.2.3 核磁共振氫譜分析 CS、SCS 和CCS 的核磁共振氫譜（H NMR）測試在核磁共振儀（Bruker AVANCE III HD 500 MHz）上進(jìn)行，將干燥后的樣品溶于重水（DO）中，超聲處理5 min，將樣品轉(zhuǎn)移進(jìn)入核磁管，然后進(jìn)行測試。

1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 CS、SCS 和CCS 的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）測試在傅里葉紅外光譜儀（PerkinElmer Frontier）上進(jìn)行，干燥的樣品使用衰減全反射（ATR）模式在4000～500 cm的范圍內(nèi)掃描，掃描次數(shù)為32 次，分辨率為4 cm。

1.2.5 X 射線衍射分析 CS、SCS 和CCS 的X 射線衍射（XRD）曲線的測定在X 射線衍射儀（Bruker D8 ADVANCE）上進(jìn)行。掃描條件為電壓為40 kV，電流為40 mA，衍射角（2）的掃描范圍為5～50°，步寬為0.05°。在測定之前，樣品在50 ℃下平衡24 h。根據(jù)Frost 等先前報道的方法定量估計樣品的相對結(jié)晶度，即結(jié)晶域面積（衍射峰的面積）與XRD 總面積之比。

1.2.6 熱失重測定 CS、SCS 和CCS 的熱重分析在同步熱分析儀（Mettler-Toledo TGA/DSC1）上進(jìn)行，干燥的樣品（10 mg 左右）在氮?dú)鈼l件下（20 mL/min）進(jìn)行升溫測定，溫度范圍為30～600 ℃，加熱速率為10 ℃/min。

1.2.7 掃描電子顯微鏡分析 CS、SCS 和CCS 的形貌檢測在掃描電子顯微鏡（Zeiss Sigma HD）上進(jìn)行，將干燥后的樣品輕薄且均勻的涂抹在樣品臺上的導(dǎo)電膠上，隨后進(jìn)行噴金處理，在加速電壓5.0 kV 條件下進(jìn)行掃描，拍攝具有代表性的形貌圖片。

1.2.8 SCS 與CCS 的混合 稱取0.5 g 的SCS，根據(jù)正電荷基團(tuán)與催化中心不同的比例，即氮與硒的摩爾比（n（N）/n（Se））為100、300、600、1200、2000、3000、6000，添加不同質(zhì)量的CCS（7.194、21.58、43.16、86.32、215.8、431.6 g）與SCS 進(jìn)行充分的研磨混合，記為SCS/CCS。

1.2.10 CCS 中氮含量的測定 0.5 g CCS 樣品、0.5 g無水硫酸銅（CuSO）和4.5 g 硫酸鉀（KSO）加入到50 mL 錐形瓶中，然后加入10 mL 濃HSO，蓋上彎頸漏斗搖勻后拿去加熱板上進(jìn)行消解處理。分別在180、240、400 ℃消解60 min，然后冷卻至室溫待測。加入10 mL 去離子水將消解后的樣品轉(zhuǎn)移至凱氏定氮管中并放置于凱氏定氮儀中，樣品中的氨在蒸氣的作用下被蒸餾出來，被硼酸溶液所吸收，顏色由紫紅色變?yōu)榫G色。最后用硫酸溶液（0.5 mol/L）進(jìn)行滴定，滴定終點(diǎn)是綠色變?yōu)榈t色。同時，做空白實(shí)驗，樣品氮含量根據(jù)下式計算：

式中，X 為淀粉樣品的氮含量（%）；c 為HSO溶液的濃度（mol/L）；V為淀粉樣品滴定消耗硫酸的體積（mL）；V為空白滴定消耗硫酸的體積（mL）；m 為淀粉樣品的質(zhì)量（g）；1.401 為氮的相對原子質(zhì)量/10（g/mol）。每個測試樣品做3 個平行實(shí)驗，取平均值。CCS 樣品的氮含量為0.136%。

1.2.11 催化活性的測定 根據(jù)Wu 等報道的方法測定GPx 的催化活性，即使用苯硫酚（ArSH）和氫過氧化物（ROOH）作為底物在紫外-可見分光光度計上進(jìn)行測定。首先，將700 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.0，50 mmol/L）、100 μL 淀粉樣品分散液和100 μL ArSH 底物溶液（4-硝基苯硫酚（NBT）或3-羧基-4 硝基苯硫酚（TNB），1.5 mmol/L）加入石英比色皿（1 mL，L=1 cm）中。石英比色皿中的混合物在室溫下在超聲下孵育1 min。通過添加100 μL ROOH（枯烯過氧化氫（CUOOH）或過氧化氫（HO），2.5 mmol/L）啟動酶促反應(yīng)。在紫外-可見分光光度計上監(jiān)測410 nm吸光度的變化（ΔA）。使用上述相同方法進(jìn)行對照測試，但淀粉樣品分散液被100 μL PBS 代替。酶促反應(yīng)的初始反應(yīng)速率（v，μmol/(L·min)），即GPx 的催化活性，由下式計算：

式中，ΔA 為淀粉樣品和對照組之間在410 nm處的吸光度變化；為ArSH 底物的摩爾消光系數(shù)（=14600 L/mol·cm，=13600 L/mol·cm，pH=7.0）；L 為石英比色皿的光程（cm）；Δt 為410 nm 處吸光度變化的時間差（min）。所有樣品測定3 次，取平均值。

1.2.12 催化活性的分析 根據(jù)Wu 等建立評估天然GPx 和仿生GPx 的催化活性的方法，以初始速率（v，（μmol/L）/min）作為抗氧化催化活性的指標(biāo)。在測定v的過程中扣除了ArSH 的自氧化速率，使用一個分子催化中心（-SeH）作為酶的催化中心來計算活性，以ArSH 底物和氫過氧化物（ROOH）底物為雙重底物，測量SCS、CCS、SCS/CCS 和GTA/SCS的抗氧化催化活性（v，（μmol/L）/min）。此外，其他酶學(xué)參數(shù)根據(jù)Michaelis-Menten 方程（式3）和雙倒數(shù)圖（式4）確定。

式中，K是米氏常數(shù)（μmol/L），[S]是底物的濃度（μmol/L），v表示最大反應(yīng)速率（μmol/（L·min））。

[E]是酶的初始濃度（μmol/L），反應(yīng)常數(shù)（K，1/min）可以根據(jù)以下式進(jìn)行計算：

1.2.13 疏水性測定 采用芘熒光探針法分析SCS、CCS 和SCS/CCS 樣品的疏水性。芘采用甲醇配制成1×10mol/L 的芘儲備液。100 μL 的儲備溶液添加比色管中，然后在除去甲醇后分別添加10 mL 的淀粉樣品分散液（2% w/V），室溫下超聲處理20 min。熒光光譜測定在熒光分光度計（Agilent Cary Eclipse）中進(jìn)行，熒光激發(fā)波長為334 nm，激發(fā)狹縫寬度為5 nm，發(fā)射狹縫寬度為2.5 nm，發(fā)射波長范圍為350～500 nm。每個樣品做3 個平行，取平均值。采用λ=372 nm 處峰與λ=383 nm 處峰的強(qiáng)度比（I/I）評價疏水性。

1.2.14 Zeta 電位分析 不同氮與硒物質(zhì)的量比的SCS/CCS 樣品Zeta 電位的測定在納米粒度及Zeta電位分析儀（Zetasizer Nano-ZS）進(jìn)行，樣品分別采用去離子水配制成分散液（1% w/V），室溫下超聲處理20 min，然后將上述分散液分別加入樣品池中，在25 ℃下測定樣品的Zeta 電位，每個樣品做3 個平行，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 2018 64Bit 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 1H NMR 分析

CS、SCS 和CCS 的H NMR 譜圖如圖3 所示。信號峰在約5.46 ppm（a）和3.5～4.3 ppm（b）主要來源于淀粉糖單元骨架上亞甲基氫（-CH-）和次甲基氫（-CH-），出現(xiàn)在CS 的H NMR 光譜中。與CS 相比，c 信號峰代表的是酯化改性O(shè)SA 上雙鍵以外氫的信號峰。在SCS 的H NMR 譜中，a 和b 信號峰仍然存在，表明在硒化和酯化改性過程中保留了CS 的主要骨架結(jié)構(gòu)。對比CS 的核磁譜圖，CCS譜圖中b 信號峰的強(qiáng)度較弱，主要是淀粉骨架上活化的羥基與陽離子醚化劑發(fā)生了陽離子醚化改性反應(yīng)。CCS 的譜圖上在化學(xué)位移3.22 ppm（d）處一個額外的信號峰，這歸因于季銨基（CH）N上的質(zhì)子氫，季銨基基團(tuán)特征峰的出現(xiàn)表明，CS 上成功改性了陽離子基團(tuán)，氮含量的測定也同時印證了這一觀點(diǎn)。

圖3 CS、SCS 和CCS 的1H NMRFig.3 1H NMR spectra of CS,SCS and CCS

2.2 FT-IR 分析

CS、SCS 和CCS 的FT-IR 光譜如圖4 所示。所有特征峰均根據(jù)報道的文獻(xiàn)進(jìn)行分配。在CS 的FT-IR 光譜中：3300 cm左右的較寬的峰信號主要是由于-OH 伸縮振動引起；1639 cm左右出現(xiàn)的峰信號峰源于淀粉中結(jié)合水的吸收振動。與CS 的FT-IR 光譜圖相比，SCS 的FT-IR 光譜顯示出與CS 基本相同的信號峰，表明淀粉的分子骨架在改性過程中是穩(wěn)定的。同時，3300 cm的-OH 拉伸強(qiáng)度和1639 cm處結(jié)合水振動強(qiáng)度降低，這些結(jié)果表明SCS 的合成制備過程消耗了淀粉骨架上的羥基，并且在改性過程中可能產(chǎn)生了疏水特性導(dǎo)致結(jié)合水的減少。與木薯的FT-IR 光譜圖相比，CCS 在1483 cm處表現(xiàn)出新的信號峰，這個特征信號峰可歸因于季銨基C-N 拉伸振動，這就是陽離子基團(tuán)與淀粉主鏈結(jié)合的證據(jù)。同時，在1238 cm處C-O-C 的特征峰信號強(qiáng)度有所增強(qiáng)，這些證據(jù)表明在CS 骨架上成功改性了陽離子基團(tuán)，這個結(jié)果與H NMR 分析結(jié)果一致。CCS 的FT-IR 光譜顯示出與CS 基本相同的吸收峰，表明在陽離子醚化改性過程中淀粉的分子骨架沒有發(fā)生改變，具有穩(wěn)定性。

圖4 CS、SCS 和CCS 的FT-IR 光譜Fig.4 FT-IR spectra of CS,SCS and CCS

2.3 XRD 分析

X 射線衍射技術(shù)是一種重要的結(jié)構(gòu)測試手段，可以檢測淀粉樣品的晶體結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而分析淀粉樣品的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變化。CS、SCS 和CCS 的X 射線衍射曲線如圖5 所示。所有樣品均顯示出典型的A型結(jié)構(gòu)，即在15°、17°、18°和23°處出現(xiàn)衍射峰，改性過程并未破壞淀粉的主體晶體結(jié)構(gòu)。與CS 的結(jié)晶度（44.1%）相比，SCS 的結(jié)晶度降低到38.1%。由于硒化改性只在OSA 鏈上發(fā)生親核加成，不影響淀粉的結(jié)晶度，結(jié)晶度的輕度降低可能是強(qiáng)堿性環(huán)境引起的。CCS 的XRD 衍射峰與CS 基本上一致，結(jié)晶度降低到38.6%，陽離子醚化改性也是在堿性條件下進(jìn)行，這些可能是強(qiáng)堿性的反應(yīng)環(huán)境影響的結(jié)果?？傮w而言，SCS 和CCS 保持淀粉結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，堿性反應(yīng)條件的腐蝕使結(jié)晶度有所降低。

圖5 CS、SCS 和CCS 的XRD 曲線Fig.5 XRD curves of CS,SCS and CCS

2.4 熱重（TG &DTG）分析

TG 是一種常用的材料結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，根據(jù)溫度來改變樣品的重量，并評估其熱穩(wěn)定性。CS、SCS和CCS 的TG 曲線和相應(yīng)的差熱分析（DTG）曲線分別如圖6A 和圖6B 所示。所有淀粉樣品的熱分解在TG 曲線中主要分為兩個階段。第一階段是物理脫水引起的失重，第二階段是淀粉聚合物鏈的熱分解引起的失重。如圖6A 所示，在150 ℃之前，發(fā)生了第一階段失重，SCS、CCS 和CS 的物理脫水重量損失分別為6.9%、8.2%和9.5%。與CS 相比，SCS表現(xiàn)出較低的失重，這可能是由于疏水性的OSA 鏈錨定在淀粉顆粒表面以抑制其吸水率。對于CCS，陽離子醚化反應(yīng)是在堿-醇混合物中進(jìn)行的，這可以使淀粉脫水。對于這些結(jié)果與相關(guān)樣品在2800～3500 cm處峰強(qiáng)度的降低一致（圖4）。SCS、CCS和CS 在第二階段失重終止溫度基本相同，但SCS和CCS 在第二階段失重起始溫度分別為234 ℃和240 ℃，低于CS 失重溫度（262 ℃），這可能是由于含功能基團(tuán)的短鏈分子如OSA 和GTA 及其與淀粉的鍵合相比規(guī)整的淀粉分子更容易分解所致。如圖6B 所示，SCS 和CCS 聚合物鏈分解的DTG 峰分別位于約300 ℃和305 ℃，即SCS 和CCS 最大失重速率溫度分別為300 ℃和305 ℃，低于木薯淀粉的最大失重速率溫度（315 ℃）。這可能是由于改性輕微腐蝕了淀粉顆粒表面，有利于傳熱，從而加速了聚合物鏈的分解。

圖6 CS、SCS 和CCS 的TG（A）和DTG（B）曲線Fig.6 TG (A) and DTG (B)curves of CS,SCS and CCS

2.5 SEM 分析

CS（A1，A2）、SCS（B1，B2）和CCS（C1，C2）的SEM 圖像如圖7 所示。粒徑在3～10 μm 范圍內(nèi)的木薯淀粉顯示出具有光滑表面的球狀或半球形結(jié)構(gòu)。SCS 保留了淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)，但表面粗糙。該表面可能是由于強(qiáng)堿性NaSeH 溶液的侵蝕和錨定的OSA 鏈和一些游離淀粉鏈在制備過程中的聚集所致。也就是說，大部分催化活性位點(diǎn)（-SeH）錨定在淀粉顆粒表面，這將有利于活性位點(diǎn)的暴露以進(jìn)行催化反應(yīng)。CCS 的淀粉結(jié)構(gòu)比較完整，形貌的改變主要發(fā)生在淀粉顆粒表面，部分淀粉顆粒表面發(fā)生類似“剝皮”的現(xiàn)象，這些形貌的改變表明陽離子化醚化改性發(fā)生在淀粉顆粒表面，CCS 表面改性的陽離子基團(tuán)能夠識別催化底物，聚集催化底物與SCS 表面上修飾的催化中心配合促進(jìn)催化反應(yīng)的進(jìn)行。

圖7 CS（A1，A2）、SCS（B1，B2）和CCS（C1，C2）的SEM 圖Fig.7 SEM images of CS (A1,A2),SCS (B1,B2)and CCS (C1,C2)

2.6 催化活性分析

根據(jù)Wu 等建立評估天然GPx 和仿生GPx的催化活性的方法，以初始速率（v，μmol/（L·min））作為催化活性的指標(biāo)。在測定v的過程中扣除了CCS 及GTA 自身的催化速率。使用一個分子催化活性中心（-SeH）作為酶的催化中心來計算活性。

為了研究CCS 上正電荷基團(tuán)與SCS 的催化中心不同比例配合在四個不同體系對催化活力的影響，將測定過程中ArSH 和ROOH 的濃度分別設(shè)置為150 μmol/L 和250 μmol/L。圖8 顯示了25 ℃、pH7.0（50 mmol/L PBS）條件下，不同比例的正電荷基團(tuán)與催化中心的SCS/CCS 催化ArSH 還原ROOH 的v。在TNB+CUOOH、TNB+HO、NBT+CUOOH、NBT+HO四個體系中，SCS/CCS 的v隨著氮元素物質(zhì)的量比硒元素物質(zhì)的量比（n（N）/n（Se））的增加呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，即v隨著n（N）/n（Se）的增加先增加而后逐步減低。當(dāng)n（N）/n（Se）為1200 時，與SCS 相比，在TNB+CUOOH、TNB+HO、NBT+CUOOH、NBT+HO四個體系中的催化活力分別提升了22.1%、25.8%、17.5%、19.6%。這可能是CCS上的正電荷基團(tuán)增加了底物識別位點(diǎn)，識別位點(diǎn)使底物富集在CCS 表面周圍，隨著布朗運(yùn)動的作用，CCS 碰撞靠近SCS 表面上的催化中心，底物與催化中心充分接觸，進(jìn)而提高反應(yīng)催化活性。當(dāng)n（N）/n（Se）超過1200 左右時，CCS 表面分子鏈與底物形成較強(qiáng)的結(jié)合力，底物會附著在CCS 表面周圍很難釋放，使SCS 表面上的催化中心很難接觸到底物，進(jìn)而使催化活性降低。SCS/CCS 在n（N）/n（Se）為1200 具有最佳的催化活性。

圖8 SCS/CCS 催化ArSH（150 μmol/L）與ROOH（250 μmol/L）反應(yīng)的初始速率（v0）Fig.8 Initial rate (v0) of the reaction between ArSH(150 μmol/L) and ROOH (250 μmol/L) catalyzed by SCS/CCS at different systems

由于CCS 顆粒大小與SCS 相當(dāng)，與催化中心碰撞接觸過程會有一定的空間位阻，需要富集更多的底物才能和催化中心進(jìn)行配合達(dá)到提高催化活性的效果。進(jìn)一步探索具有較小位阻的小分子陽離子基團(tuán)對催化活性的影響。在SCS 分散液添加不同比例GTA（n（N）/n（Se）為100、300、600、900、1200、1500、2000，記為GTA/SCS）進(jìn)行測試催化活性，圖9 顯示了在25 ℃、pH7.0（50 mmol/L PBS）條件下，不同比例的GTA 與催化中心的GTA/SCS 催化ArSH 還原ROOH 的v。GTA/SCS 的催化活力在隨著n（N）/n（Se）的變化呈現(xiàn)出相似的規(guī)律，即當(dāng)n（N）/n（Se）小于900 左右時，催化活力隨n（N）/n（Se）逐漸增加；然而，當(dāng)n（N）/n（Se）的比例進(jìn)一步增加會導(dǎo)致催化活力的降低。與SCS 相比，在TNB+CUOOH、TNB+HO、NBT+CUOOH、NBT+HO四個體系中的最大催化活力分別提升了15.8%、29.8%、21.2%、31.6%，這可能是GTA 識別效應(yīng)對底物具有聚集作用，進(jìn)而接觸催化中心提高催化效率，提升催化活力。同時過多添加GTA，產(chǎn)生較強(qiáng)的識別作用可能會抑制反應(yīng)底物的釋放，從而阻礙下一個催化循環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致較低的催化活性。

圖9 GTA/SCS 催化ArSH（150 μmol/L）與ROOH（250 μmol/L）反應(yīng)的初始速率（v0）Fig.9 Initial rate (v0) of the reaction between ArSH(150 μmol/L) and ROOH (250 μmol/L) catalyzed by GTA/SCS at different systems

圖10 顯示了SCS/CCS 和GTA/SCS 催化ArSH還原ROOH 的v隨時間變化關(guān)系。GTA/SCS 的催化活力在隨著時間的變化呈現(xiàn)出相似的規(guī)律，隨著時間的增加催化活力逐步減低，這可能是GTA 在SCS的分散液中不能穩(wěn)定存在，其識別位點(diǎn)的作用不能穩(wěn)定，對催化效果隨著時間的變化具有不穩(wěn)定性。SCS/CCS 的催化活性基本保持一致，這是由于正電荷基團(tuán)錨定在淀粉顆粒表面，能夠穩(wěn)定存在，可以保證催化活性的穩(wěn)定一致性。后續(xù)的催化機(jī)理研究采用n（N）/n（Se）為1200 時的SCS/CCS。

圖10 SCS/CCS 和GTA/SCS 催化ArSH（150 μmol/L）與ROOH（250 μmol/L）反應(yīng)的初始速率比較Fig.10 Comparison of the initial rates (v0) for the reaction of ArSH (150 μmol/L) and ROOH (250 μmol/L) catalyzed by SCS/CCS and GTA/SCS at different systems

為了進(jìn)一步研究催化行為，將TNB 或NBT 的濃度固定為150 μmol/L，測試了SCS/CCS 在不同濃度ROOH（CUOOH 或HO）的不同反應(yīng)體系中的v。如圖11 所示，在TNB+CUOOH、TNB+HO、NBT+CUOOH、NBT+HO四個體系中，SCS/CCS的v隨著ROOH（CUOOH 或HO）濃度的增加呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，即v隨著ROOH 濃度的增加而增加，然后達(dá)到了平衡。四個體系中SCS/CCS 的v相對于ROOH 濃度的曲線類似于天然GPx 的催化行為，顯示出典型的飽和動力學(xué)行為。

圖11 在ArSH（150 μmol/L）下SCS/CCS 催化反應(yīng)初始速率隨ROOH 濃度的變化曲線Fig.11 Profiles of initial rate against the concentration of ROOH at different reactions catalyzed by SCS/CCS with concentration of ArSH at 150 μmol/L

2.7 催化機(jī)制分析

每個Se 單體對應(yīng)的v的倒數(shù)（[E]/v）與ROOH濃度的倒數(shù)（1/[CUOOH]或1/[HO]）做雙倒數(shù)曲線，即Lineweaver-Burk 圖。如圖12 所示，在TNB或NBT 濃度不變的情況下，它們在不同濃度的ArSH 下相互平行，表明SCS/CCS 對ArSH 和ROOH反應(yīng)的催化機(jī)制均為與天然GPx 相似的“乒乓”催化機(jī)制。選擇ArSH 濃度為150 μmol/L 的實(shí)驗數(shù)據(jù)擬合到乒乓動力學(xué)機(jī)制中，其中最大反應(yīng)速率（v，μmol/（L·min））、反應(yīng)常數(shù)（K，1/min）、米氏常數(shù)（K，μmol/L）和催化效率（K/K，L/mol·min）等催化反應(yīng)的動力學(xué)常數(shù)如表1 所示。

圖12 不同濃度ArSH（75、120 和150 μmol/L）下SCS/CCS 的催化速率與ROOH 濃度的雙倒數(shù)曲線Fig.12 Profiles of [E]0/v0 against 1/[ROOH] at different reactions catalyzed by SCS/CCS with concentrations of ArSH at 75,120 and 150 μmol/L

一般情況下，K代表反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時底物的濃度，反映底物與酶的結(jié)合強(qiáng)度，K越低，仿生GPx 材料與底物之間的結(jié)合力越強(qiáng)，而K/K值越大意味著仿生GPx 材料的催化效率越高。如表1 所示，在NBT 和TNB 的兩種反應(yīng)體系中，K（CUOOH）的值都小于K（HO）的值，表明底物HO與CUOOH 相比，SCS/CCS 對底物CUOOH 的親和力更高。此外，SCS/CCS 在催化CUOOH 和ArSH 反應(yīng)時顯示出更高的v和K/K，表明SCS/CCS 催化ArSH 還原CUOOH 的反應(yīng)效率高于HO。在這些反應(yīng)體系中，ROOH（CUOOH 和HO）是唯一的區(qū)別。因此，ROOH 的結(jié)構(gòu)差異可能是動力學(xué)常數(shù)變化的主要原因。由于對異丙苯基的存在，CUOOH 比HO更疏水，并且在SCS/CCS的催化下表現(xiàn)出更高的還原能力。因此，可以得出結(jié)論，SCS/CCS 更適合捕獲催化反應(yīng)的疏水底物。

表1 SCS/CCS 催化反應(yīng)的動力學(xué)常數(shù)Table 1 The kinetic parameters of catalytic reactions of SCS/CCS

由于不存在羧基，NBT 與TNB 相比顯示出更高的疏水性。然而，與其他組合相比，TNB 和CUOOH的底物組合顯示出最低的K和最大的K/K，這些結(jié)果表明，TNB 和CUOOH 具有更強(qiáng)底物結(jié)合能力，源于TNB 中的羧基與識別位點(diǎn)的正電荷基團(tuán)存在氫鍵作用，更容易富集底物，進(jìn)而提高催化效率。但是，TNB 和CUOOH 體系中的v略小于NBT和CUOOH 體系（圖9）。一方面，SCS/CCS 能夠容易捕捉疏水性底物CUOOH，另一方面，CCS 表面分子鏈段上正電基團(tuán)與底物TNB 之間的氫鍵產(chǎn)生的底物識別效應(yīng)對底物起聚集作用，但是SCS 表面催化中心和底物有一定空間位阻，不能有效進(jìn)行催化，進(jìn)而導(dǎo)致TNB 和CUOOH 體系中SCS/CCS 催化反應(yīng)的v有所降低。

根據(jù)先前報道的文獻(xiàn)，GPx 模擬物中的疏水微環(huán)境和活性位點(diǎn)在提供高催化活性方面起著重要作用。SCS 表面的疏水性O(shè)SA 鏈可以通過疏水相互作用聚集疏水性底物提供了疏水性微環(huán)境，這將有利于催化反應(yīng)。而SCS/CCS 中的疏水微環(huán)境增強(qiáng)了催化活性。為了證明SCS/CCS 中疏水微環(huán)境的形成，使用芘熒光探針法進(jìn)行測試。

芘是一種用于測試材料的疏水性常用的熒光探針，λ=372 nm 處的峰和λ=383 nm 處的峰的熒光強(qiáng)度之比（I/I）越小，材料的疏水性越強(qiáng)。芘在木薯淀粉、SCS 和SCS/CCS 分散液中和芘的水溶液的熒光光譜如圖13 所示，測試中芘濃度為5×10mol/L。芘/SCS 的I/I值為1.51，小于芘/CS 的I/I值（1.72），表明在SCS 上形成了疏水性微環(huán)境?？赡艿慕忉屖堑矸鄯肿渔湺魏蚈SA 鏈的聚集導(dǎo)致表面粗糙，從而增加了其疏水性。芘/（SCS/CCS）的I/I值（1.50）與芘/SCS 的值基本一致，CCS 的添加沒有破壞體系疏水性微環(huán)境。SCS/CCS 可以提供催化活性位點(diǎn)（-SeH）和疏水微環(huán)境，賦予混合淀粉良好的抗氧化性能。

圖13 芘在SCS（a）、SCS/CCS（b）、CS（d）分散液中和水中（c）的熒光光譜Fig.13 Fluorescence spectra of pyrene in the dispersion of SCS(a),SCS/CCS (b),cassava starch (d) and water (c)

前期研究表明，正電荷基團(tuán)是能夠高效率地模擬天然GPx 中精氨酸識別位點(diǎn)的官能團(tuán)。如圖14所示，隨著n（N）/n（Se）的增加SCS/CCS 表面的Zeta電位也增加。隨著大量的CCS 的添加，最后SCS/CCS表面的Zeta 電位呈現(xiàn)電正性，可以模擬識別位點(diǎn)。SCS/CCS 在表面的Zeta 電位約為5.6 mV 時，達(dá)到催化效果最優(yōu)。較低的Zeta 電位達(dá)到最優(yōu)催化效果，這是SCS/CCS 混合體系中識別位點(diǎn)與催化中心存在空間位阻導(dǎo)致的。CCS 表面正電荷越多越容易富集底物，而使底物難以釋放，不易與SCS 表面的催化中心接觸時進(jìn)行反應(yīng)，因此SCS/CCS 混合體系中達(dá)到最優(yōu)的催化活力需要較低的正電荷分布，即較低的Zeta 電位。

圖14 不同氮與硒物質(zhì)的量比的SCS/CCS 的Zeta 電位Fig.14 Zeta potential of SCS/CCS with different molar ratios of nitrogen and selenium

綜上所述，SCS 和CCS 組成的SCS/CCS 混合體系中，SCS 提供的催化中心和CCS 表面的底物識別位點(diǎn)有效配合，形成有利于結(jié)合底物的疏水微環(huán)境。SCS/CCS 混合體系中底物識別位點(diǎn)對提升催化活力具有貢獻(xiàn)作用，而過強(qiáng)的底物識別位點(diǎn)結(jié)合作用會降低催化活力。GPx 催化中心與疏水微環(huán)境、底物識別位點(diǎn)的有效匹配是維持SCS/CCS 的高催化活力重要因素。

3 結(jié)論

以CS 為原料，分別制備了SCS 和CCS。將兩種淀粉混合可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)淀粉中同時含有硒氫基、季銨基和疏水性的辛烯基琥珀酸酯分子鏈，而此三者可模擬谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的三核心要素：含硒催化活性中心、荷正電的識別位點(diǎn)和疏水微環(huán)境。當(dāng)混合淀粉中的氮和硒物質(zhì)的量比為1200 時，SCS/CCS 的Zeta 電位約為5.6 mV，其在TNB+CUOOH、TNB+HO、NBT+CUOOH、NBT+HO反應(yīng)體系中的GPx 催化活力分別為13.94、11.25、12.91 和10.87 μmol/min，比SCS 的催化活力分別提高了22.1%、25.8%、17.5%和19.6%。本工作為高催化活性的淀粉基仿生GPx 規(guī)?；a(chǎn)提供了一種簡單的方法。