亞麻籽油中苯并(α)芘的脫除工藝

額爾敦巴雅爾，孫 萍，張慧如，張國強，云雪艷，陳倩茹，董同力嘎,

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古伊泰生態(tài)業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古滿洲里 021400）

亞麻即胡麻，為典型的亞麻科、亞麻屬的一年生草本植株，同時也為典型的高油料作物成分。亞麻籽油是從草本植株亞麻的種子中提取而來的一類干性油脂成分，其中不飽和脂肪酸含量在90%以上，-亞麻酸是人體必需但自身不能合成的n-3不飽和脂肪酸，其占比45%～65%左右，另外還有大量維生素以及微量元素成分。亞麻籽油中的-亞麻酸具有促進大腦發(fā)育，降血壓、降血脂、保護視力，預防癌癥等功效。-亞麻酸通常被人體吸收后會轉(zhuǎn)化為DHA，維持神經(jīng)系統(tǒng)的健康，有效延長神經(jīng)細胞的壽命。同時亞麻籽油中的亞麻木酚素、維生素E 以及黃酮等營養(yǎng)元素，能夠減少自身免疫性病癥、心血管病癥、糖尿病以及一些癌癥的發(fā)生。因此，亞麻籽油有的保健功效，被認為是目前最受青睞的保健油脂之一。苯并（）芘是一種多環(huán)芳烴類物質(zhì)，具有毒性。苯并芘對人體的危害性極大，有致癌、致畸、致突變的作用。高劑量的情況下更是會導致免疫抑制問題，長期下來，對機體造成嚴重的危害。

近些年來，國家食品安全監(jiān)管機構(gòu)對壓榨亞麻籽油產(chǎn)品進行抽樣檢測，發(fā)現(xiàn)苯并（）芘含量嚴重超標。而苯并（）芘這種物質(zhì)的強致癌性以及長期隱匿性對人體的危害不容小覷，故需要對亞麻籽油的苯并（）芘殘留問題及相應防控做深入研究。目前植物油中苯并芘的脫除方法主要包括化學脫除法、溶劑萃取法、離心低溫分離法、物理吸附法、微生物降解法等。例如周興旺等采用活性炭吸附以降低壓榨油茶籽油中苯并（）芘含量。研究表明，油茶籽油于特定的情況下壓榨后，在低溫條件下加0.1%～0.2%左右的活性炭能夠非常好的實現(xiàn)對苯并（）芘的高效吸附。李巖及其團隊分析指出芽孢桿菌M1 對200 μg/mL 苯并（）芘有著較好的耐受作用，其對于苯并芘的去除具有生物吸附以及生物降解二者協(xié)同作用，證明了苯并（）芘的去除可能與5 個功能基因調(diào)控有關。目前大多數(shù)脫除方法存在脫除率低，不易操作，有雜質(zhì)殘留等問題。因此本文采用脫除效率高、易操作、易實現(xiàn)的物理吸附法對亞麻籽油中的苯并（）芘進行脫除試驗。

本文的脫除方法操作簡單易實現(xiàn)，為實際生產(chǎn)加工提供一定的參考價值以及技術支持。此外，在提高人們的食品安全意識以及保障健康方面發(fā)揮重要作用，具有很好的經(jīng)濟效益和社會效益。本文主要研究內(nèi)容是采用物理吸附法對亞麻籽油中的苯并（）芘進行脫除試驗，確定最佳工藝條件；建立了超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOFMS）對經(jīng)過脫除裝置的亞麻籽油與未處理亞麻籽油主要不飽和脂肪酸成分含量進行對比分析的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞麻籽油 內(nèi)蒙古伊泰生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；苯并（）芘標準品（＞99%）國家標準物質(zhì)中心；活性白土 食品級，廣西隆安瑞豐工貿(mào)有限責任公司；活性炭 食品級，上海熙碳環(huán)?？萍加邢薰荆粺o水乙醇、石油醚 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；甲醇、乙腈 色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；水（娃哈哈飲用純凈水）杭州娃哈哈集團有限公司出品；正己烷 天津市永大化學試劑公司；乙腈（質(zhì)譜純）、異丙醇、甲酸（質(zhì)譜純）德國Merck公司；實驗用水：超純水Millipore 純水器制備。

ZK-82A 型真空干燥箱 上海市實驗儀器廠；FA1104N 型電子天平 上海精密儀器有限公司；MAS-I 型微波快速制樣系統(tǒng) 上海新儀微波化學科技有限公司；KQ2200B 型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；U-3900 紫外可見分光光度計 日本日立公司；RE52-86A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HZS-H 水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；高效液相色譜儀Agilent1100 系列、Agilent Poroshel 120SB C色譜柱 美國Agilent 公司；DK-98-2 型水浴鍋 天津泰斯特公司；R201L+W2-100 旅轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技公司；Waters Acquity UPLC 液相色譜儀，配有Empower3.0 Synapt G2-SQ-TOF 質(zhì)譜儀 美國Waters 公司；工作站和MassLvnxV41 分析軟件 美國Waters 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液制備 稱量苯并（）芘標準品10 mg，再用乙腈溶液稀釋至100 mL 的容量瓶中，制得100 μg/mL 的一級標準儲備液；吸取此儲備液1 mL 定容至100 mL 的容量瓶內(nèi)，得1 μg/mL 的二級標準儲備液，再用此儲備液配制0.5、2、5、10、20、50 ng/mL 濃度的標準溶液；置于4 ℃環(huán)境條件下避光保存，待用。

1.2.2 樣品前處理 選用中性氧化鋁柱對油樣品進行預處理。具體操作方法為：預先使用約30 mL 的正己烷溶液活化SPE 柱，當正己烷溶液的液面超出氧化鋁填料5 mm 左右時活化完成。稱取0.3 g 亞麻籽油樣品于小試管中，使用3 mL 正己烷充分溶解后將其倒入活化好的SPE 柱，內(nèi)用10 mL 正己烷溶液分三洗滌之前的小試管，洗液均倒入SPE 柱內(nèi)，同時用150 mL 的旋蒸濃縮瓶接收，向SPE 柱內(nèi)倒入共80 mL 的正己烷溶液進行洗脫。把收集液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40 ℃下旋蒸至幾乎為干，再用5 mL 正己烷溶液沖洗旋蒸濃縮瓶內(nèi)壁，繼續(xù)旋蒸至干。用300 μL 乙腈溶液溶解濃縮瓶中的殘留物，移到2 mL棕色進樣瓶內(nèi)，待測。

1.2.3 測定條件 HPLC 測定條件：色譜柱為Poroshell120EC.C，柱溫設置為30 ℃，流動相A 為水，流動相B 為乙腈，甲醇溶液用于沖洗色譜柱，進樣量為10 μL，熒光檢測器激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm，梯度洗脫如表1 所示。根據(jù)保留時間定性，在樣品前處理之前加入內(nèi)標物苯并（）芘的標準品，然后用內(nèi)標法定量。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

MS 測定條件：色譜柱為HP-5MS 毛細管柱；載氣為高純氦。電離方式為EI，負離子掃描方式，電子能量70 eV；定性離子m/z126，m/z250，m/z252；定量離子m/z252。根據(jù)標準品的出峰時間結(jié)合NIST 圖譜庫檢索結(jié)果定性，內(nèi)標法定量分析。

1.2.4 吸附實驗 稱取50.0 g 亞麻籽油置于三口燒瓶中，再加入一定量的吸附劑（活性白土或活性炭或活性白土和活性炭混合吸附劑），在一定的吸附溫度、吸附時間、真空度0.095 MPa 及不引起飛濺的攪拌條件下，對亞麻籽油進行吸附精制，之后過濾分離出吸附劑，對所得亞麻籽油苯并（）芘含量進行檢測。

1.2.5 吸附劑用量對苯并（）芘脫除效果

1.2.5.1 活性白土用量對苯并（）芘的脫除效果 在亞麻籽油樣品中分別加入油質(zhì)量1%、2%、3%、4%、5%、6%的活性白土，按照1.2.4 吸附實驗條件下對亞麻籽油進行攪拌吸附脫除苯并（）芘。

1.2.5.2 活性炭用量對苯并（）芘的脫除效果 在亞麻籽油樣品中分別加入油質(zhì)量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的活性炭，按照1.2.4 吸附實驗條件下對亞麻籽油進行攪拌吸附脫除苯并（）芘。

1.2.5.3 活性白土與活性炭比例對苯并（）芘的脫除效果 固定活性白土濃度，在亞麻籽油樣品中分別加入油質(zhì)量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%、1.6%、2%的活性炭作為混合吸附劑，并分別表述為0.2%+4%、0.4%+4%、0.6%+4%、0.8%+4%、1.2%+4%、1.6%+4%、2%+4%，按照1.2.4 吸附實驗條件下對亞麻籽油進行攪拌吸附脫除苯并（）芘。

1.2.6 吸附劑對不同濃度苯并（）芘的脫除效果

1.2.6.1 活性白土對不同濃度苯并（）芘的脫除效果在苯并（）芘濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg/kg 的亞麻籽油樣品（樣品本身含有一定濃度的苯并（）芘）中分別加入4%的活性白土，觀察活性白土對不用濃度苯并（）芘的脫除效果，計算苯并（）芘的殘留量和苯并（）芘的脫除率。

1.2.6.2 活性炭對不同濃度苯并（）芘的脫除效果在苯并（）芘濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg/kg 的亞麻籽油樣品中分別加入2%的活性炭，觀察活性炭對不用濃度苯并（）芘的脫除效果，計算苯并（）芘的殘留量和苯并（）芘的脫除率。

1.2.6.3 活性白土與活性炭混合吸附劑對不同濃度苯并（）芘的脫除效果 在苯并（）芘濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg/kg 的亞麻籽油樣品中分別加入0.8%+4%的活性炭與活性白土混合吸附劑，觀察混合吸附劑對不用濃度苯并（）芘的脫除效果，計算苯并（）芘的殘留量和苯并（）芘的脫除率。

1.2.7 吸附速率的計算方法 本試驗吸附劑吸附速率指在苯并（）芘濃度為28.6 μg/kg 的50 mL 油樣品中單位時間內(nèi)吸附劑所吸附苯并（）芘的量。稱取一定量的各吸附劑，置于層析柱中，將油樣品注入各裝置進行吸附過濾。對過濾后的油樣品進行苯并（）芘含量的測定。

根據(jù)公式計算得出吸附速率:

式（1）中q—吸附速率（μg·mL/kg·min）；c—吸附前后油樣品中苯并（）芘質(zhì)量濃度（μg/kg）；t—吸附時間（min）；v—油樣品體積（mL）。

1.2.8 苯并（）芘含量和脫除率的計算方法 根據(jù)公式計算得出：

式（2）中w—苯并（）芘的含量（μg/kg）；c—標準曲線中計算出的待測液中苯并（）芘的濃度（ng/mL）；v—待測液定容的體積（mL）；m—樣品質(zhì)量（g）。

式（3）中S—苯并（）芘脫除率（%）；c—吸附前油樣品中苯并（）芘的質(zhì)量濃度（μg/kg）；c—吸附后油樣品中苯并（）芘的質(zhì)量濃度（μg/kg）。

1.2.9 不飽和脂肪酸的分析 通過UPLC-Q-TOFMS/MS 技術，具體方法是樣品經(jīng)甲醇超聲提取后，采用Poroshell120EC.C色譜柱分離，以水溶液和乙腈作為流動相進行梯度洗脫，流速為0.4 mL/min；質(zhì)譜采用Q-TOF-MS 作檢測器，采用電噴霧離子源（ESI）正負離子模式，以保留時間、精確分子量和二級碎片比對進行定性分析得到總離子圖譜，根據(jù)扣除背景噪音后的特征離子碎片，儀器自動與NIST 標準圖譜庫進行匹配，選取Match 值高于85%，同時匹配概率大于70%的成分作為結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin2018 軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸附劑類型對苯并（α）芘吸附速率的影響

由高效液相色譜測定得出的苯并（）芘物質(zhì)的出峰時間為5.542 min（圖1）。

圖1 苯并（α）芘標準色譜圖Fig.1 The standard chromatogram of benzo (α) pyrene

活性白土和活性炭能夠脫除亞麻籽油中的苯并（）芘，主要是通過物理吸附，而不是離子交換吸附。吸附過程主要分為表面活性位點接觸和內(nèi)部擴散吸附效應兩個階段。吸附速率即能很好地反映油脂中苯并（）芘與吸附劑接觸到反應這一過程中的性能變化。一定質(zhì)量的吸附劑在一定時間內(nèi)所吸附的物質(zhì)量即為吸附速率，是衡量吸附處理過程中吸附效果的主要指標之一。吸附速率決定了亞麻籽油中苯并（）芘與吸附劑的接觸時間，吸附速率與接觸時間呈負相關。吸附速率快則接觸時間就短，即表明吸附劑可提供的活性位點越多，苯并（）芘就可以快速的到達對應的位點進行吸附反應，從而達到更好的吸附效果，結(jié)果見圖2。

圖2 吸附劑類型對苯并（α）芘吸附速率的影響Fig.2 The effect of adsorbent type on adsorptionrate of benzo (α) pyrene

如圖2 是不同時間段內(nèi)不同吸附劑對亞麻籽油中苯并（）芘的吸附速率曲線。由圖可看出在40 min 之前，三種吸附劑的吸附速率變化較快，40 min 之后，三種吸附劑的吸附速率變化明顯減緩，但總體隨著時間的增加，吸附速率都呈現(xiàn)增大的趨勢。其原因是：剛加入吸附劑，吸附劑中大量的活性位點與亞麻籽油中的苯并（）芘接觸，而且最開始時，亞麻籽油中的苯并（）芘濃度最大，因此與吸附劑表面的活性位點發(fā)生碰撞的概率增大。但是，隨著吸附反應的進行活性白土與活性炭上的活性位點被苯并（）芘所占據(jù)，于是吸附速率變化也減緩。由圖可看出活性白土與活性炭串聯(lián)后吸附速率高于單一吸附劑的吸附速率，說明活性白土與活性炭串聯(lián)后提供更大量的表面活性位點與亞麻籽油中的苯并（）芘進行表面接觸，并向內(nèi)部擴散，縮短苯并（）芘與吸附劑的接觸時間，則吸附速率更快。

2.2 吸附劑用量對苯并（α）芘脫除效果的影響

2.2.1 活性白土用量對苯并（）芘脫除率的影響 由圖3 可知，當活性白土的添加量為1%時，苯并（）芘的脫除率為15%，隨活性白土用量的增加，其對亞麻籽油中的苯并（）芘脫除效果越好，當活性白土用量達到4%時，此時脫除率為38%，之后再添加一定量的活性白土其脫除率趨于平緩，不再增長。說明活性白土對苯并（）芘的脫除效果起到一定作用，但是脫除效果沒有明顯的優(yōu)勢。

圖3 活性白土用量對苯并（α）芘脫除率的影響Fig.3 The effect activated clay usage on benzo (α) pyrene removal rate

2.2.2 活性炭用量對苯并（）芘脫除率的影響 由圖4 可知，隨活性炭用量的增多，其對亞麻籽油中的苯并（）芘脫除效果越好，當活性炭用量達到2.0%時，此時脫除率為83%，之后再添加一定量的活性炭其脫除率變化很小。說明活性炭對亞麻籽油中的苯并（）芘有明顯的去除效果，對于苯并（）芘的脫除實驗選擇性較好。

圖4 活性炭用量對苯并（α）芘脫除率的影響Fig.4 The effect activated carbon usage on benzo (α) pyrene removal rate

2.2.3 活性白土與活性炭比例對苯并（）芘脫除率的影響 由圖3、圖4 可知活性炭對苯并（）芘的脫除效果比活性白土好，所以固定活性白土的用量（4%），變化活性炭的用量。由圖5 可知，兩者串聯(lián)后的圖像趨勢與單一吸附劑對亞麻籽油中苯并（）芘脫除率的影響趨勢一致，當吸附劑串聯(lián)使用量為0.8%+4%時，苯并（）芘的脫除率為96%，之后再添加一定量的吸附劑其脫除率變化很小，所以該比例為最佳比例。因此采用活性炭與活性白土混合吸附劑串聯(lián)對亞麻籽油中苯并芘的脫除是有效和可靠的。

圖5 吸附劑串聯(lián)比例對苯并（α）芘脫除率的影響Fig.5 The effect adsorbent series ratio on benzo (α) pyrene removal rate

2.3 吸附劑對不同濃度苯并（α）芘的脫除效果

2.3.1 活性白土對苯并（）芘脫除效果 從圖6 可知，固定活性白土濃度為4%時，苯并芘初始濃度與苯并（）芘殘留量呈正相關，而與苯并（）芘的脫除率呈負相關。苯并（）芘濃度為15 μg/kg 時，活性白土單獨作用處理后的油樣品中苯并（）芘殘留量為10.5 μg/kg，超出了國標限量，此時脫除率為59%。

圖6 活性白土對苯并（α）芘脫除效果的影響Fig.6 The effect of activated clay on benzo (α) pyrene removal

2.3.2 活性炭對苯并（）芘脫除效果 從圖7 可以看出，固定活性炭濃度為2%時，苯并（）芘濃度為15 μg/kg 時活性炭對苯并（）芘的脫除率為74%，此時苯并（）芘殘留量為7.4 μg/kg，可以看到活性炭對苯并（）芘的脫除效果明顯優(yōu)于活性白土。苯并（）芘濃度為30 μg/kg 時，苯并（）芘殘留量為10.2 μg/kg，超出了國家標準，此時脫除率為65%。

圖7 活性炭對苯并（α）芘脫除效果的影響Fig.7 The effect of activated carbon on benzo (α) pyrene removal

2.3.3 吸附劑串聯(lián)對苯并（）芘脫除效果 從圖8 可以看出，將濃度為0.8%的活性白土與4%活性炭串聯(lián)在一起（0.8%+4%），與單一吸附劑對亞麻籽油中苯并（）芘脫除效果的影響趨勢一致，即隨著苯并（）芘濃度的增加，苯并（）芘的殘留量逐漸增大，脫除率逐漸降低。其原因是活性白土與活性炭逐漸趨向吸附飽和狀態(tài)，最終失去了吸附能力。由圖8 可知，苯并（）芘濃度為15 μg/kg 時吸附劑串聯(lián)共同作用脫除率為93%，此時苯并（）芘殘留量為1.8 μg/kg，符合歐盟限量標準2 μg/kg。在苯并（）芘濃度為50 μg/kg 時，苯并（）芘殘留量為9.5 μg/kg 仍符合國家標準，此時脫除率為64%。結(jié)果表明，將活性白土與活性炭串聯(lián)在一起對亞麻籽油中的苯并（）芘進行脫除試驗，效果最為顯著。

圖8 吸附劑串聯(lián)對苯并（α）芘脫除效果的影響Fig.8 The effect of adsorbents in series on benzo (α) pyrene removal

2.4 吸附劑對亞麻籽油中不飽和脂肪酸的影響

亞麻籽油中含有大量的不飽和脂肪酸組分，不飽和脂肪酸具有免疫調(diào)節(jié)、保證細胞正常生理功能、降低血液中的膽固醇等生理功能。因此考慮到活性炭與活性白土是否會造成亞麻籽油中不飽和脂肪酸的損失，故建立了UPLC-Q-TOF-MS 對經(jīng)過脫除裝置的亞麻籽油與未處理亞麻籽油主要不飽和脂肪酸成分含量進行對比分析，結(jié)果如圖9 所示。

由圖9 得知，同一濃度條件下，經(jīng)實驗裝置吸附過濾后的亞麻籽油主成分色譜峰值與吸附過濾前的亞麻籽油差別不大，只出現(xiàn)了一少部分化合物的變化和減少，一些雜質(zhì)峰也有被去除，說明活性白土與活性炭還可去除一些亞麻籽油中的雜質(zhì)。

圖9 苯并（α）芘脫除前（a）后（b）亞麻籽油的總離子圖譜Fig.9 Total ion spectrum of flaxseed oil before (a) and after (b) benzo (α) pyrene removal

表2 為亞麻籽油中主要不飽和脂肪酸檢索結(jié)果，對應總離子圖譜觀察發(fā)現(xiàn)，苯并（）芘脫除前亞麻籽油中的不飽和脂肪酸相對含量為90.88%，苯并（）芘脫除后亞麻籽油中不飽和脂肪酸相對含量為90.29%，其含量變化差異不明顯，表明吸附劑沒有對亞麻籽油中不飽和脂肪酸造成損失。其原因是：苯并（）芘脫除過程中，活性白土與活性炭利用的是物理吸附，其吸附熱很小不會對油脂中不飽和脂肪酸組分造成影響。其中變化較大的飽和烴基類化合物，可能會形成苯并（）芘的中間產(chǎn)物，這些物質(zhì)的減少也進一步驗證了活性白土與活性炭能夠去除苯并（）芘的能力。檢測中發(fā)現(xiàn)呋喃、吲哚、酰胺等含N、O 的環(huán)狀和鏈狀酯類化合物輕微減少，通過分析以及文獻參考，這些物質(zhì)的變化與蛋白質(zhì)的裂解有一定的關聯(lián)。

表2 亞麻籽油中不飽和脂肪酸NIST 譜庫檢索結(jié)果Table 2 Search results of NIST database of unsaturated fatty acids in linseed oil

3 結(jié)論

活性白土與活性炭串聯(lián)后吸附速率都高于它們單獨作用時的吸附速率，表明吸附劑串聯(lián)后可以提供大量的表面活性位點與苯并（）芘接觸，向內(nèi)部擴散進一步反應，提高了反應效率，達到了更好的脫除效果；以不同用量的吸附劑對一定質(zhì)量的亞麻籽油進行苯并（）芘脫除率的測定，結(jié)果表明：活性白土與活性炭串聯(lián)后處理脫除率最高；且當使用量為0.8%+4%時，脫除率可達96%；通過對三種吸附劑脫除能力的測定，結(jié)果得出：苯并（）芘濃度＜15 μg/kg 時使用活性白土吸附過濾；苯并（）芘濃度為15～30 μg/kg 時使用活性炭吸附過濾；苯并（）芘濃度＞30 μg/kg 時使用二者串聯(lián)吸附過濾；經(jīng)實驗裝置處理前后的亞麻籽油中不飽和脂肪酸成分含量幾乎發(fā)生沒有變化，表明活性白土與活性炭沒有對亞麻籽油中不飽和脂肪酸造成損失。