李夢云，張 華，劉亞麗，張 慧，莊雪晴

（1.安徽建筑大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.環(huán)境污染控制與廢棄物資源化利用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230601）

胞外聚合物普遍存在于活性污泥絮體內(nèi)部和表面，附著于微生物的表面，對微生物生命活動具有一定的保護功能，可以抵御對微生物細胞有毒害作用的殺菌劑和有毒物質(zhì)[1]。同時，胞外聚合物具有富集環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的功能，在胞外各種酶的催化下，將營養(yǎng)物質(zhì)降解為微生物可吸收利用的小分子物質(zhì)[1]。而在污水生物處理過程中，胞外聚合物會受到污水中各種環(huán)境因素的干擾，如抗生素、重金屬及農(nóng)藥等，破壞胞外聚合物結(jié)構(gòu)和功能，從而威脅微生物的生命安全，影響到污水處理的效果[2]。因此，研究環(huán)境因素對胞外聚合物的影響具有重要意義。

胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖為主要成分，兩者占胞外聚合物總量的70%～80%。四環(huán)素類抗生素是目前醫(yī)療和養(yǎng)殖業(yè)用量最大的抗生素之一，通過人類及動物排泄物等途徑進入城市污水管網(wǎng)，在全球多地區(qū)的污水處理廠中均有此類抗生素檢出[3]。在污水處理過程中，四環(huán)素通過氫鍵和范德華力與胞外聚合物中的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使胞外聚合物喪失功能，影響污水處理效果[4]。銅離子在畜禽養(yǎng)殖中被大量使用，促進動物生長同時增強動物的抗病能力，進入動物體內(nèi)的銅離子部分隨排泄物排出進入污水處理設(shè)施。胞外聚合物表面含有大量帶負(fù)電荷的基團，在污水處理過程中，銅離子可以與帶負(fù)電的基團發(fā)生絡(luò)合沉淀和離子交換，從而改變或破壞胞外聚合物內(nèi)部結(jié)構(gòu)，對污水處理產(chǎn)生不利影響[5]。然而，污水中的污染物往往不是單獨存在，研究表明混合物會形成更復(fù)雜的作用[6]。污水生物除磷是污水生物處理極其重要的部分，而污水中四環(huán)素和銅離子往往以混合的形式存在。因此，研究四環(huán)素和銅離子對污水生物除磷微生物胞外聚合物的影響具有重要意義。然而，四環(huán)素和銅離子形成的混合污染物對生物除磷過程中微生物胞外聚合物聯(lián)合作用的研究卻極其缺乏。

該實驗選用四環(huán)素和銅離子作為典型污染物，研究四環(huán)素、銅離子及其混合污染物對生物除磷微生物胞外聚合物的影響。首先測定單獨四環(huán)素和銅離子作用下，胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖含量的變化；再利用直接均分射線法[7]設(shè)計3 種不同濃度配比的四環(huán)素和銅離子的混合污染物，測定不同濃度配比下混合污染物對微生物胞外蛋白質(zhì)和多糖的含量，并結(jié)合三維熒光研究蛋白質(zhì)的變化，為科學(xué)評價四環(huán)素和銅離子對微生物胞外聚合物的作用風(fēng)險提供依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置及運行

該實驗選用序批試活性污泥反應(yīng)器，通過厭氧-好氧交替運行的方式實現(xiàn)生物除磷。實驗用水為人工配制的模擬污水廠進水，配藥成分如表1所示。通過微電腦時控裝置自動控制反應(yīng)器運行，運行周期為360 min，其中包括進水20 min、厭氧75 min、好氧180 min、沉淀60 min、出水5 min 和閑置20 min。

表1 實驗用水配方

1.2 投加污染物及樣品采集測定方法

各反應(yīng)器投加四環(huán)素濃度依次為0 mg/L、0.01 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L；銅離子濃度依次為0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L；反應(yīng)器編號分別為1*、2*、3*、4*、5*、6*、7*、8*。該實驗每隔12 h 取樣取至96 h，包括各階段水樣和污泥混合樣。胞外聚合物中的蛋白質(zhì)和多糖分別采用BCA 法測定和蒽酮法測定；MLSS 采用重量法測定；正磷酸鹽采用鉬銻抗分光光度法測定。

1.3 污染物抑制效應(yīng)分析

每周期的比吸磷率即該周期厭氧階段末期與好氧階段末期的正磷酸鹽含量之差與MLSS的比值。利用比吸磷率的抑制率表示生物除磷微生物受抑制程度，污染物作用時比吸磷率的抑制率M，其計算如公式（1）所示：

C——污染物濃度，mg/L；

C0——污染物半數(shù)效應(yīng)濃度即EC50，mg/L。

利用Logistics 函數(shù)擬合四環(huán)素和銅離子的濃度和比吸磷率抑制率值獲得濃度-效應(yīng)曲線，得到四環(huán)素和銅離子的半數(shù)效應(yīng)濃度分別為7.455 mg/L和8.464 mg/L。

1.4 不同配比的混合物實驗設(shè)計

利用直接均分射線法（EquRay）設(shè)計3 種不同配比的四環(huán)素和銅離子混合物，分別為L1、L2 和L3，其配比值分別為0.297、0.894 和2.676。根據(jù)稀釋因子法[9]在每個濃度配比下設(shè)計9 組（含空白對照組）四環(huán)素和銅離子混合物，混合物濃度依次為0 mg/L、0.339 mg/L、0.692 mg/L、1.412 mg/L、2.882 mg/L、5.882 mg/L、12.005 mg/L、24.500 mg/L、50.000 mg/L，對應(yīng)9 個反應(yīng)器，反應(yīng)器編號分別為1*、2*、3*、4*、5*、6*、7*、8*、9*。

2 結(jié)果與討論

2.1 四環(huán)素對生物除磷中微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖的影響

在生物除磷反應(yīng)器中投加不同濃度四環(huán)素后微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖的變化情況如圖1 所示。由圖1 可知，投加四環(huán)素后，在0～36 h各反應(yīng)器的蛋白質(zhì)和多糖均出現(xiàn)增加趨勢，并在36 h 達到最大值，此時各反應(yīng)器的蛋白質(zhì)濃度最大達到78.39 mg/gVSS；多糖濃度最大達到15.48 mg/gVSS。而在36～96 h 時，蛋白質(zhì)和多糖含量均出現(xiàn)逐漸減少的趨勢。當(dāng)四環(huán)素作用時間為96 h 時，各反應(yīng)器的蛋白質(zhì)濃度最低降至13.83 mg/gVSS；多糖濃度最低降至4.62 mg/gVSS。

圖1 不同濃度四環(huán)素作用下胞外聚合物組成成分變化

根據(jù)微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖含量變化可知，蛋白質(zhì)和多糖均出現(xiàn)先增加后減少的趨勢。前期含量增加可能是由于投加四環(huán)素初期，活性污泥中的微生物受外來污染物刺激，分泌更多聚合物在微生物表面形成更嚴(yán)固的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)保護層，用于抵抗不利的外界環(huán)境[10]。隨后含量減少可能是由于隨著四環(huán)素的持續(xù)輸入，胞外聚合物中更多的蛋白質(zhì)與四環(huán)素以氫鍵和范德華力結(jié)合，胞外聚合物蛋白質(zhì)中更多結(jié)合位點被四環(huán)素占據(jù)，導(dǎo)致胞外聚合物肽鏈結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞[11]；同時四環(huán)素能夠特異性地結(jié)合到微生物體內(nèi)核糖體30S 亞基中A 的位置，有效阻止了胺基酰-tRNA 與核糖體上此位置的聯(lián)結(jié)，進而抑制肽鏈的進一步增長，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受阻，進而使微生物喪失功能，蛋白質(zhì)和多糖含量均下降[12]。

2.2 銅離子對生物除磷中微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖的影響

生物除磷反應(yīng)器中投加不同濃度銅離子后微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖的變化情況如圖2 所示。由圖2 可知，投加銅離子后，在0～12 h 各反應(yīng)器的蛋白質(zhì)出現(xiàn)小幅度的下降；在12～48 h 各反應(yīng)器的蛋白質(zhì)出現(xiàn)增加趨勢，并在48 h 達到最大值，此時各反應(yīng)器的蛋白質(zhì)濃度最大達到75.93 mg/gVSS。在0～48 h各反應(yīng)器的多糖出現(xiàn)增加趨勢，并在48 h 達到最大值，此時各反應(yīng)器多糖濃度最大達到14.12 mg/gVSS。而在48～96 h 時，蛋白質(zhì)和多糖含量均出現(xiàn)逐漸減少的趨勢。當(dāng)銅離子作用時間為96 h 時，各反應(yīng)器的蛋白質(zhì)濃度最低降至15.22 mg/gVSS；多糖濃度最低降至4.98 mg/gVSS。

圖2 不同濃度銅離子作用下胞外聚合物組成成分變化

根據(jù)微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖含量變化可知，初期蛋白質(zhì)含量小幅度減低，可能是反應(yīng)器進水中銅離子迅速與蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變失活形成聚沉[13]。隨后蛋白質(zhì)和多糖均出現(xiàn)先增加后減少的趨勢。前期增加可能是因為銅離子的加入產(chǎn)生了不利的環(huán)境條件，刺激微生物分泌更多的胞外聚合物，保護微生物細胞減少污染物對微生物的不利影響[10]。隨后蛋白質(zhì)和多糖含量減少，可能是由于銅離子的持續(xù)投加，胞外聚合物表面的大量帶負(fù)電的基團與銅離子發(fā)生離子交換、絡(luò)合沉淀，改變或破壞胞外聚合物內(nèi)部結(jié)構(gòu)[14]；同時，蛋白質(zhì)是銅離子的強配體，蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈與銅離子通過靜電作用相結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)失活，進而使微生物喪失功能，蛋白質(zhì)和多糖含量下降[15]。

2.3 三種濃度配比混合物對微生物胞外聚合物蛋白質(zhì)和多糖的影響

2.3.1 不同濃度配比下微生物胞外聚合物蛋白質(zhì)和多糖含量變化

三種濃度配比四環(huán)素和銅離子的混合物對生物除磷中微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖的影響如圖3 所示。由圖3 可知，三種配比下蛋白質(zhì)和多糖均出現(xiàn)先增大后減小的現(xiàn)象。混合物投加初期對微生物產(chǎn)生刺激作用，微生物為了保護細胞不受污染物的毒害作用分泌更多的胞外聚合物，形成保護屏障，從而蛋白質(zhì)和多糖均出現(xiàn)不同程度的增加。隨反應(yīng)時間增加，微生物胞外聚合物遭到破壞，蛋白質(zhì)和多糖呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢。因此，投加三種配比混合物，微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖均出現(xiàn)了先增加后逐漸減小的現(xiàn)象。

圖3 三種濃度配比混合物對生物除磷中微生物胞外聚合物組成成分的影響

三種配比下混合物投加初期，蛋白質(zhì)和多糖濃度逐漸增加。其中，配比為L1 時最大分別為74.60 mg/gVSS 和12.77 mg/gVSS；配比為L2 時最大濃度分別68.81 mg/gVSS 和12.53 mg/gVSS；配比為L3時最大濃度分別70.02 mg/gVSS 和13.49 mg/gVSS。由此可見，當(dāng)混合物配比為L1 時，蛋白質(zhì)和多糖增加量最大，可能是由于銅離子占比高，四環(huán)素與銅離子發(fā)生絡(luò)合作用后，銅離子占主導(dǎo)作用，胞外聚合物表面大量帶負(fù)電荷的基團與銅離子結(jié)合，且蛋白質(zhì)是銅離子的強配體，為了保護細胞不受污染物的毒害作用，從而初期刺激微生物分泌更多的胞外聚合物[10]。當(dāng)混合物配比為L2 時，四環(huán)素和銅離子所占比例比較接近，四環(huán)素分子中含有酚羥基和二甲基酰胺等基團與銅離子結(jié)合發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[15]，導(dǎo)致投加混合污染物初期刺激微生物分泌的胞外聚合物量較配比L1 和L3 少。當(dāng)混合物配比為L2 時，四環(huán)素占比高，四環(huán)素與銅離子發(fā)生絡(luò)合作用后，四環(huán)素占主導(dǎo)作用，研究發(fā)現(xiàn)胞外聚合物中主要成分蛋白質(zhì)與四環(huán)素發(fā)生反應(yīng)，而胞外聚合物表面含有多種官能團與金屬離子有更強的結(jié)合能力，因此，反應(yīng)初期刺激微生物分泌胞外聚合物相對L1 少[16]。

2.3.2 三種濃度配比下微生物胞外聚合物的三維熒光光譜

三種配比混合物作用下，3*、5*、7*和9*反應(yīng)器微生物胞外聚合物的三維熒光光譜如圖4所示。由圖4 可知，三維熒光光譜主要有兩個區(qū)域。其中區(qū)域Ⅰ為酪氨酸峰（Ex 為200～250 nm，Em 為300～380 nm），區(qū)域Ⅱ為類色氨酸峰（Ex 為250～300 nm，Em 為300～380 nm），這兩種均為芳香類蛋白質(zhì)熒光峰。三種配比混合物作用下，隨混合物濃度的增加，酪氨酸峰和類色氨酸峰熒光強度均逐漸減弱。其中，配比L2 中酪氨酸峰和類色氨酸峰熒光強度比配比L1 和配比L3 的峰度減弱程度更明顯。三種配比混合物作用下，隨混合物濃度增加，微生物胞外聚合物中酪氨酸和類色氨酸熒光強度逐漸減弱，說明四環(huán)素和銅離子混合物對酪氨酸和類色氨酸的熒光產(chǎn)生了猝滅作用，且隨著混合物濃度的增加猝滅現(xiàn)象越顯著。研究表明，四環(huán)素或銅離子均可與酪氨酸、類色氨酸發(fā)生絡(luò)合作用，所生成的絡(luò)合物不再發(fā)出熒光，因此酪氨酸峰和類色氨酸峰熒光強度逐漸減弱[16-17]。

圖4 三種濃度配比混合物作用下生物除磷中微生物胞外聚合物的三維熒光光譜圖

3 結(jié)論

不同濃度四環(huán)素和銅離子分別單獨作用下，微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖含量均出現(xiàn)先增加后減少的趨勢。三種配比的混合物作用下微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖含量也出現(xiàn)了先增加后減少的趨勢。其中，四環(huán)素和銅離子配比為0.297 時，銅離子占比較大，混合物投加初期胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖增加量三種配比下相對最高；四環(huán)素和銅離子配比為0.894 時，四環(huán)素與銅離子濃度相當(dāng)，混合物投加初期胞外聚合物中蛋白質(zhì)和多糖增加量三種配比下相對最低。三種配比混合物作用下，隨混合物濃度增加，微生物胞外聚合物中蛋白質(zhì)三維熒光強度逐漸減弱。