唐紫雯，程華琴，劉冬菊，彭毛卓瑪，楊 雪，李 鍵*，殷 實*

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，成都 610041； 2.西南民族大學 現(xiàn)代生物技術國家民委重點實驗室，成都 610041)

牦牛()主要生活在青藏高原地區(qū)以及周圍空氣稀薄的高海拔地區(qū)，其肉、皮、骨、角以及糞便能為當?shù)鼐用袼茫哂休^高的經濟價值。但牦牛具有性成熟晚、繁殖率低及繁殖周期長等劣勢，嚴重限制了高原地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展。顆粒細胞(granulosa cells，GCs)是哺乳動物卵巢中一類重要的體細胞，顆粒細胞對于卵巢內卵泡和卵母細胞的發(fā)育至關重要，顆粒細胞分泌的類固醇激素(如雌二醇和孕酮)和其他多種生長因子如激活素、TGF-β和SCF等能促進卵泡的生長和發(fā)育。此外，顆粒細胞可以通過縫隙連接與卵母細胞傳遞信息，以保證卵母細胞的正常成熟。因此，顆粒細胞功能的正常執(zhí)行是母畜完成受孕以及生產的前提條件。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是體內線粒體代謝的正常產物之一。當組織和細胞所產生的ROS超過機體抗氧化防御系統(tǒng)的承載能力時，氧化平衡被打破，過量的ROS破壞細胞中DNA、蛋白質、脂質、線粒體和其他重要的細胞成分，破壞細胞膜的結構，刺激端?？s短，對機體造成損害進而引起病變。環(huán)境污染、外源致病菌毒素、高溫、強紫外線等均能誘發(fā)機體產生氧化應激反應。玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)是一種由鐮刀菌屬產生具有氧化性的非甾體類真菌毒素，因其最早從發(fā)霉的玉米中分離出來而得名。ZEA的廣泛污染已經成為了全球性問題，每年因毒素污染而造成的糧食損失可達10億噸。ZEA主要會對動物的消化、免疫、泌尿以及生殖系統(tǒng)等造成損傷。其中，ZEA對生殖系統(tǒng)的損傷尤為嚴重，主要通過如下兩種機制：1)ZEA能與雌激素受體結合，干擾類固醇激素的合成與分泌。2)ZEA能上調ROS水平，損害機體抗氧化防御系統(tǒng)，引起機體氧化損傷，誘導細胞凋亡。因此，尋找緩解ZEA毒性的方法是目前畜牧養(yǎng)殖行業(yè)一個亟需解決的問題。

抗氧化劑可以捕獲并結合氧自由基，減輕氧化應激對動物生殖系統(tǒng)帶來的損傷。原花青素(procyanidins, PC)是從植物器官中提取的一種多酚化合物，無定形粉末，是以不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素為基本結構單元結合而成的低聚體和多聚體混合物，是國際公認的超強抗氧化劑之一，其抗氧化性比維生素族更強，能更高效地清除機體內的自由基。具有抗炎、抗輻射、抗衰老、抗腫瘤、防治心腦血管疾病和促進細胞增殖等生物學功能。已有多項研究表明葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins，GSPs)能減輕氧化應激對動物生殖系統(tǒng)帶來的損傷。如GSPs對沙門菌內毒素導致的雞卵巢顆粒細胞氧化損傷具有一定的緩解作用，能夠回復沙門菌處理后GSH和T-SOD的表達水平。王友良的研究表明，原花青素可明顯抑制反式脂肪酸所致小鼠睪丸脂質過氧化損傷作用，提高機體清除自由基能力，又如原花青素能夠抑制鎘暴露導致的大鼠睪丸組織抗氧化狀態(tài)的改變，降低丙二醛(MDA)、NO和HO的含量，并提高過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(T-SOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性。盡管關于原花青素抗氧化能力研究方面的文獻眾多，但其在牦牛生殖方面的研究較少，本研究成功分離了牦牛顆粒細胞，在細胞及分子層面初步探討了原花青素對玉米赤霉烯酮誘導牦牛顆粒細胞產生氧化損傷后細胞活力、增殖生長能力、凋亡程度、激素分泌以及抗氧化性的影響，為今后原花青素禽畜育種上的應用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑：DMEM/F-12培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶-EDTA消化液(Hyclone)，青霉素-鏈霉素溶液100X(Solarbio)，玉米赤霉烯酮(上海源葉生物科技有限公司)，原花青素(上海麥克林生化有限公司)，Anti-FSHR鼠多克隆抗體(Abcam)，Goat Anti-Mouse IgG (H+L) FITC-conjugate (Affinit)，HE染色試劑盒(Solarbio)，CCK-8試劑盒(MCE)，TRIzol(Invitrogen)，PrimeScriptRT Reagent Kit反轉錄試劑盒(諾唯贊生物科技有限公司)，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊生物科技有限公司)，牛活性氧(ROS)ELISA試劑盒(鵬世達生物科技有限公司)，牛雌激素(E)ELISA 檢測試劑盒(鵬世達生物科技有限公司)。

主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)，共聚焦顯微鏡(Zeiss)，倒置顯微鏡(Olympus)，超低溫冰箱(Thermo)，定量PCR擴增儀(Bio-RAD)，紫外分光光度計(島津)，超凈工作臺(Haier)，低溫高速離心機(Thermo)，渦旋振蕩儀(Stuart)，超純水系統(tǒng)(Milli-Q)，酶標儀(Thermo)。

1.2 牦牛顆粒細胞的分離培養(yǎng)

試驗樣品來自四川省成都市青白江唐家寺牛羊肉供應基地，采集3頭年齡在3～5歲，生長狀況良好，健康的雌性牦牛卵巢，用含1%接近于牦牛體溫的雙抗的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗干凈，置于0.9%生理鹽水的保溫桶中及時帶回實驗室完成后續(xù)處理。在超凈工作臺中，用10 mL一次性注射器將吸出卵泡液，過200目細胞篩。得到濾液，并轉移至2 mL微量離心管中，調整離心機轉速為2 000 r·min，時間5 min，小心去除上清液，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12將沉淀懸浮起來，再次以上一步相同條件完成離心，丟棄上清液，向離心管中加入完全培養(yǎng)基，制成細胞懸液，測細胞活力后，調整細胞密度至1×10個·mL，吹打至無明顯沉淀后接種于90 mm培養(yǎng)皿中，于37 ℃，50 mL·LCO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)至貼壁時，用PBS清洗，棄去未貼壁的細胞及其他雜質，注意保持整個過程的無菌環(huán)境及條件。使用胰蛋白酶消化細胞并接種至一個新的細胞培養(yǎng)皿中，之后每隔一段時間進行清洗，換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 顆粒細胞蘇木素-伊紅(HE)染色及顆粒細胞免疫熒光染色

使用酒精棉球將專用的細胞爬片上的雜質擦除干凈，用75%酒精浸泡48 h，再使用PBS洗去殘余酒精，并輕放到細胞培養(yǎng)皿中，37 ℃，50 mL·LCO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取出80%匯合度的細胞爬片，PBS洗去培養(yǎng)液及其他雜質后，加入4%多聚甲醛(PFA)固定爬片20 min，洗去多聚甲醛，按照HE試劑盒要求進行染色，根據(jù)具體情況調整染色時間，爬片干燥后中性樹膠固封并鏡下觀察。以同樣的方法制得細胞爬片，加入500 μL 0.5% Triton X-100透膜液透膜20 min后，再用磷酸鹽緩沖液清洗3次，在室溫條件下，用1 mL 5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液封閉1 h，取出蓋玻片，置于稀釋了200倍的特異性抗體Anti-FSHR鼠多克隆抗體中，于4 ℃冰箱中過夜，之后，使用PBS清洗玻片3次，每次2 min，風干片刻后，滴加500 μL用PBS稀釋了300倍的對應二抗Goat Anti-Mouse IgG (H+L) FITC-conjugate，室溫避光環(huán)境中孵育1 h，DAPI染色封片并用共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況。

1.4 顆粒細胞活力檢測

用培養(yǎng)基將牦牛顆粒細胞的密度設置為1×10個·mL，在無菌條件下接種于96孔板，37 ℃，50 mL·LCO培養(yǎng)12 h后，設置空白對照組(Control)：更換培養(yǎng)12 h的培養(yǎng)基，新的培養(yǎng)基中不添加ZEA和PC，37 ℃，50 mL·LCO培養(yǎng)24 h。設置ZEA處理組：更換培養(yǎng)12 h的牦牛顆粒細胞培養(yǎng)基，在新的培養(yǎng)基中添加不同濃度的ZEA，使其最終濃度為0、5、10、20、40、60、80和100 μmol·mL，37 ℃，50 mL·LCO培養(yǎng)24 h。設置PC處理組：更換培養(yǎng)12 h的牦牛顆粒細胞培養(yǎng)基，更換新的培養(yǎng)基并添加不同濃度的PC，使其最終濃度為0、0.05、0.5、2.5、5、10、50和100 μg·mL，37 ℃，50 mL·LCO培養(yǎng)24 h。設置ZEA + PC聯(lián)合處理組：更換培養(yǎng)12 h的牦牛顆粒細胞培養(yǎng)基，在新的培養(yǎng)基中添加50 μmol·mLZEA+5 μg·mLPC，該組與氧化損傷組和PC組以相同的培養(yǎng)條件完成培養(yǎng)。在每個孔添加10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)2 h，測定OD，記錄結果，遮蓋培養(yǎng)板避光室溫保存，可多次測定吸光度，并根據(jù)說明書所示公式計算細胞活力，進行結果分析。

1.5 顆粒細胞總RNA提取、cDNA合成及實時熒光定量PCR

將細胞培養(yǎng)皿中的液體棄去，用PBS洗凈培養(yǎng)液后，加入1 mL冰冷TRIzol反復沖洗培養(yǎng)皿以獲得足夠多的細胞。收集該液體至1.5 mL無酶離心管中，室溫靜置5 min，接下來的步驟嚴格按照TRIzol法進行提取RNA，通過紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度，為挑選濃度和純度合格的樣品，選擇在OD與OD的比值處于1.8到2.0之間且OD與OD大于2.0的RNA樣本進行后續(xù)試驗，并于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將得到的顆粒細胞RNA通過PrimeScriptRT Reagent Kit反轉錄試劑盒進行反轉錄，按說明書采用兩步法反轉錄，第一步反應條件：42 ℃ 2 min，第二步反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，將得到的cDNA進行濃度及質量檢測后于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。參照NCBI數(shù)據(jù)庫中公布瘤牛()的相關基因序列，通過NCBI中的Pick Primers在線完成引物的設計，引物序列見表1。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒檢測牦牛顆粒細胞中各基因的表達情況，RT-qPCR反應體系為15 μL：模板及上、下游引物分別1 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5 μL，ddHO 4.5 μL。RT-qPCR反應程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行40個循環(huán)，重復執(zhí)行該流程，保證每個樣本重復3次。qPCR所得Ct值通過2法計算其相對表達，使用SPSS 21.0對定量結果進行方差分析。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.6 顆粒細胞ROS水平檢測

收集空白對照組(Control)、添加50 μmol·mLZEA處理組及50 μmol·mLZEA+5 μg·mLPC聯(lián)合處理組培養(yǎng)24 h后的細胞培養(yǎng)液3 000 r·min離心10 min，小心吸取得到上清液。按照?；钚匝?ROS)ELISA檢測試劑盒操作說明檢測顆粒細胞活性氧水平，迅速使用酶標儀依次測定各樣本在450 nm波長處的吸光度。繪制標準曲線，代入數(shù)值完成結果的計算。

1.7 雌二醇(estradiol，E2)濃度檢測

收集空白對照組(Control)、添加50 μmol·mLZEA處理組及50 μmol·mLZEA+5 μg·mLPC聯(lián)合處理組培養(yǎng)24 h后的細胞培養(yǎng)液3 000 r·min離心10 min，取上清液備用。使用牛雌激素(E)ELISA 檢測試劑盒完成E濃度的檢測，依次測定在450 nm下各樣本的吸光值，繪制標準曲線，代入數(shù)值完成結果的計算。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件處理，采用的統(tǒng)計學方法為Student’s unpaired t-test，統(tǒng)計結果以“mean±SEM”的方式表示，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 牦牛顆粒細胞的分離與鑒定

接種牦牛顆粒細胞幾個小時后一部分細胞已貼壁生長，原代細胞生長緩慢，且分布不均勻，細胞傳代培養(yǎng)后生長迅速，且生長形態(tài)更好。為了檢測本研究分離培養(yǎng)得到的細胞的純度，保證后續(xù)研究對象的準確性，對牦牛顆粒細胞進行了HE染色，染色情況如圖1A所示，顆粒細胞形態(tài)大多呈梭形，生長狀態(tài)良好。免疫熒光染色后的結果表明，所分離得到的細胞能夠表達顆粒細胞特異性卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor, FSHR)(圖1B)，證明本次用于試驗的細胞為純度較高的顆粒細胞。

A.不同放大倍數(shù)牦牛顆粒細胞HE染色；B.牦牛顆粒細胞FSHR的免疫熒光染色A.HE staining in yak granulosa cells at different magnifications; B. Immunofluorescent staining of FSHR in yak granulosa cells 圖1 牦牛顆粒細胞的鑒定Fig.1 Identification of yak granulosa cells

2.2 ZEA和PC對顆粒細胞活力的影響

設立不同濃度的ZEA添加到顆粒細胞培養(yǎng)液中，檢測細胞活力后結果顯示，在0～100 μmol·mL的范圍內隨著ZEA濃度增高顆粒細胞活力越低(<0.01，圖2)，以此為基礎計算出ZEA的半數(shù)抑制濃度為50 μmol·mL，并以此濃度處理牦牛顆粒細胞建立氧化損傷模型。同樣的，應用CCK-8法測定不同濃度PC對顆粒細胞相對存活率的影響來確定后續(xù)研究的適宜濃度，由圖3可知，當PC濃度小于2.5 μg·mL時，與未添加PC組顆粒細胞的活力相比沒有顯著影響，隨著濃度的上升，PC對顆粒細胞的活力有顯著提高作用，且在濃度為5 μg·mL時提高細胞活力的作用最明顯，提高了19.1%(<0.01)，但隨著PC濃度的升高，顆粒細胞的活力逐漸降低，因此本研究后續(xù)設定PC濃度為5 μg·mL來研究PC對經ZEA損傷的顆粒細胞的保護作用。

設定對照組為1，其他組別均與對照組做比較，數(shù)據(jù)表示為 “平均值±SEM ”，n=3， *表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同The control group was set as 1, and all other groups were compared with the control group, * indicated significant difference (P<0.05), Data were presented as “mean±SEM”, n=3, ** indicated extremely significant difference (P<0.01), the same as below圖2 不同濃度ZEA處理24 h后牦牛顆粒細胞的活力Fig.2 The viability of yak granulosa cells treated with different concentrations of ZEA for 24 h

圖3 不同濃度PC處理24 h后牦牛顆粒細胞的細胞活力Fig.3 The viability of yak granulosa cells treated with different concentrations of PC for 24 h

2.3 ZEA與PC聯(lián)合處理后對細胞生長活性的影響

ZEA對顆粒細胞的生長有抑制作用，與ZEA組相比，ZEA + PC聯(lián)合處理組顆粒細胞數(shù)量增加(圖4A)。經CCK-8檢測結果顯示，與ZEA組相比，ZEA + PC聯(lián)合處理組顆粒細胞活力顯著增加了56.5%(<0.01，圖4B)。

A. ZEA與PC聯(lián)合處理24 h后牦牛顆粒細胞的生長狀態(tài)(40×)；B. ZEA與PC聯(lián)合處理24 h后牦牛顆粒細胞的活力A. The growth situation of yak granulosa cells with the combined treatment of ZEA and PC for 24 h(40×); B. The viability of yak granulosa cells with the combined treatment of ZEA and PC for 24 h圖4 ZEA與PC聯(lián)合處理后對牦牛顆粒細胞生長活性的影響Fig.4 The effect of combined treatment of ZEA and PC on the viability of yak granulosa cells

2.4 ZEA與PC聯(lián)合處理后對顆粒細胞增殖以及凋亡相關基因的影響

添加ZEA后，與對照組相比顆粒細胞中與細胞增殖相關基因和生長相關基因-II mRNA的表達水平極顯著下調(<0.01)，分別下調了67.3%和52.1%。而與ZEA處理組相比，ZEA+PC聯(lián)合處理組這兩種基因的mRNA表達水平有極顯著上升(<0.01)，分別上升了78.3%和35.7%(圖5A、5B)。與對照組相比，ZEA處理組中顆粒細胞中抑凋亡相關基因和-2 mRNA的表達水平極顯著下調(<0.01)，分別下調了52.2%和59.2%。而ZEA + PC聯(lián)合處理組這兩種基因的表達水平與ZEA組相比顯著上調(<0.05)，分別上調了44.5%和49.5%(圖5C、5D)。與對照組相比，ZEA處理組中顆粒細胞中與促凋亡相關基因和3 mRNA的表達水平極顯著上調(<0.01)，分別上調了241.8%和55.0%。而ZEA + PC聯(lián)合處理組這兩種基因的表達水平與ZEA組相比有所下調，其中mRNA的表達水平極顯著下調(<0.01)，下調了35.2%，3 mRNA的表達水平顯著下調(<0.05)，下調了17.1%(圖5E、5F)。

A～B.顆粒細胞中增殖生長相關基因PCNA和 IGF-Ⅱ mRNA的相對表達水平；C～D.顆粒細胞中抑凋亡相關基因XIAP和BCL-2 mRNA的相對表達水平；E～F. 顆粒細胞中促凋亡相關基因BAX 和 CASP3 mRNA 的相對表達水平A-B. The relative mRNA expression levels of proliferation and growth-related genes PCNA and IGF-II in granulosa cells; C-D. The relative mRNA expression levels of the anti-apoptotic genes XIAP and BCL-2 in granulosa cells; E-F.The relative mRNA expression levels of pro-apoptotic genes BAX and CASP3 in granulosa cells圖5 ZEA + PC聯(lián)合處理后牦牛顆粒細胞24 h后增殖和凋亡相關基因表達水平Fig.5 The expression levels of proliferation and apoptosis-related genes in yak granulosa cells after 24 h with the combined treatment of ZEA+PC

2.5 ZEA與PC聯(lián)合處理后對顆粒細胞抗氧化能力的影響

結果顯示，與對照組相比，ZEA處理組ROS水平顯著升高了20.7%(<0.05)。而與ZEA處理組相比，ZEA+PC聯(lián)合處理組顆粒細胞的ROS水平顯著降低了11.5%(<0.05，圖6A)。對顆粒細胞抗氧化相關基因表達水平進行檢測后，發(fā)現(xiàn)單獨添加ZEA培養(yǎng)后，與對照組相比，顆粒細胞中抗氧化基因2、1及的表達水平極顯著下調(<0.01)，分別下調了24.5%、63.8%和14.7%。而與ZEA組相比，ZEA + PC聯(lián)合處理組顆粒細胞中這些抗氧化基因mRNA的表達水平均極顯著上調(<0.01)，分別上調了24.4%、68.2%和14.1%(圖6B～6D)。

A.顆粒細胞ROS相對水平；B～D.部分顆粒細胞抗氧化基因mRNA的相對表達水平A. The relative levels of ROS in granulosa cells; B-D. The relative mRNA expression levels of some antioxidant-related genes in granulosa cells圖6 ZEA與PC聯(lián)合處理后對牦牛顆粒細胞抗氧化能力的影響Fig.6 The effect of combined treatment of ZEA and PC on the antioxidant capacity of yak granulosa cells

2.6 ZEA與PC聯(lián)合處理后對顆粒細胞E2分泌水平的影響

測定顆粒細胞的E分泌水平后，結果顯示，與對照組相比，ZEA組顆粒細胞分泌的E水平顯著降低(<0.05)，降低了13.4%。而與ZEA組相比，ZEA+PC聯(lián)合處理組顆粒細胞E分泌水平顯著上升(<0.05)，上升了18.7%(圖7A)。為了探究ZEA與PC對顆粒細胞E合成相關基因的影響，檢測了部分顆粒細胞E合成相關基因的表達情況，結果表明，與對照組相比，ZEA組顆粒細胞中與E合成相關基因、11A1及3B mRNA的表達水平極顯著下調(<0.01)，分別下調了87.9%、64.1%和34.8%。而與ZEA組相比，ZEA+PC聯(lián)合處理組中這些基因的表達水平有所上升，其中及11A1 mRNA的表達水平極顯著上調(<0.01)，分別上調了94.6%和85.8%(圖7B、7C)，3B mRNA的表達水平顯著上調(<0.05)，上調了30.6%(圖7D)。

A.顆粒細胞E2相對分泌水平; B～D.部分顆粒細胞E2合成相關基因mRNA相對表達水平A.The relative secretion levels of E2 in granulosa cells; B-D. The relative mRNA expression levels of some E2 synthesis-related genes圖7 ZEA與PC聯(lián)合處理后對牦牛顆粒細胞分泌E2的影響Fig.7 Effect of the combined treatment of ZEA and PC on the secretion of E2 by yak granulosa cells

3 討 論

卵巢是雌性動物生殖系統(tǒng)的重要組成部分，顆粒細胞是卵巢卵泡內包圍在卵母細胞周圍的一類非常重要的體細胞。其主要功能是分泌雌激素、促進卵泡的生長、發(fā)育及成熟，在母畜受孕生產中有著重要作用。因此，維持顆粒細胞功能的正常執(zhí)行是提高動物繁殖能力的重要手段之一。

本研究發(fā)現(xiàn)ZEA處理顆粒細胞后細胞的活力降低，ROS水平上升且部分抗氧化酶相關基因的表達下調，而雌激素合成的能力下降，表明ZEA對牦牛顆粒細胞造成氧化損傷性并抑制了雌激素的合成。

已有多篇文獻研究了ZEA的氧化損傷作用和雌激素樣作用，如高鑫研究表明，ZEA及其代謝物能夠對人類和動物的生殖、消化、免疫系統(tǒng)等方面造成氧化損傷，從而影響機體的正常生長，甚至誘發(fā)癌癥；而向妊娠期雌性大鼠灌胃ZEA，導致體內雌二醇水平下降，干擾雌激素信號通路，導致生殖系統(tǒng)紊亂。本試驗檢測了不同濃度的PC對牦牛顆粒細胞活力的影響，結果表明，PC濃度為5 μg·mL時提高細胞活力的作用最明顯，但濃度高于50 μg·mL后，PC會顯著降低顆粒細胞的活性。在其他研究中也有類似的結果，例如有研究發(fā)現(xiàn)在人體白細胞內，同樣作為抗氧化劑的槲皮素當其濃度低于50 mmol·L時，顯示抗氧化活性，但濃度超過100 mmol·L時，DNA氧化損傷顯著增加，損害細胞活力。有研究指出，當對小鼠主動脈內皮細胞進行過表達線粒體過氧化氫酶后，發(fā)現(xiàn)可降低體內HO含量，并阻斷細胞由G0期向G1期的轉變，證明低劑量的ROS在調控細胞分裂中具有積極作用。由此推測，在本次試驗中當PC濃度高于50 μg·mL時，ROS水平低于機體正常運轉所需最低ROS水平，細胞正常功能受到影響，反而產生降低細胞活力的效果。由此可知，PC作為抗氧化劑作用于顆粒細胞應控制在一定的濃度范圍內。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，ZEA與PC聯(lián)合處理組顆粒細胞與ZEA氧化損傷組相比，細胞的活力極顯著上升，說明ZEA對PC誘導牦牛顆粒細胞活力下降具有明顯的緩解作用。

機體為了應對氧化應激，除了保證體內抗氧化酶和抗氧化性物質的正常合成以外，外源性補充生物活性物質或抗氧化劑也是減緩氧化應激的重要途徑。PC是一類生物類黃酮，屬于天然植物提取類的抗氧化劑。而本研究也證實，適宜濃度的PC能夠促進牦牛顆粒細胞的生長，下調顆粒細胞ROS水平。在ZEA與PC聯(lián)合處理牦牛顆粒細胞后，顆粒細胞活性氧水平與ZEA單獨處理組相比顯著下降，顆粒細胞活力得到顯著提高，相關基因的表達水平得到恢復，因此，本研究推測，PC可能是通過降低ZEA誘導顆粒細胞后的活性氧水平，降低顆粒細胞凋亡程度，進而提升了細胞的活力。這與其他文獻中所報道的結果一致，如有研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素B2(GSPB2)能夠提升被HO氧化損傷的豬顆粒細胞活力，這一作用是通過提高-2/比值，降低3 mRNA的表達量實現(xiàn)的。原花青素B1(PB1)處理MII 卵母細胞和卵丘細胞后，降低了細胞ROS 的產生和凋亡水平，并且增加了GSH水平。

顆粒細胞所分泌的E在卵泡發(fā)育及卵母細胞發(fā)育的過程中發(fā)揮重要作用，對雌性動物生殖能力的維持具有重要意義。而在E合成過程中主要受到、11A1及3B三種關鍵蛋白的調節(jié)作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，ZEA及其代謝物在體外抑制牛小卵泡顆粒細胞的細胞增殖和類固醇生成。在Barbe等的研究中發(fā)現(xiàn)GSPB2能夠通過提高人顆粒細胞STAR蛋白的表達水平進而促進細胞分泌孕酮和雌激素。在本研究中，添加ZEA后牦牛顆粒細胞E分泌水平顯著降低，而添加PC后，E水平以及相關基因的表達都得到了一定的恢復，推測PC可能通過促進、11A1及3B mRNA的表達進而提高顆粒細胞分泌E的能力。

4 結 論

牦牛顆粒細胞培養(yǎng)基中添加ZEA會導致細胞氧化損傷，細胞活力下降，ROS水平上升，E分泌水平下降。PC能夠減緩ZEA引起的一系列細胞功能如生長增殖、氧化應激及雌激素分泌水平等，恢復細胞功能。本試驗表明適宜濃度PC能夠改善牦牛顆粒細胞的生存環(huán)境，提升顆粒細胞應對氧化應激的抗性以及雌激素的分泌能力，減少ROS帶來的氧化損傷。