仝錫帥，余耿生，李雅文，冉 迪，顧建紅， 鄒 輝，袁 燕，卞建春，劉宗平*

(1.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院(教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際聯(lián)合研究實(shí)驗(yàn)室)，揚(yáng)州 225009； 2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

鎘(cadmium，Cd)是一種環(huán)境重金屬污染物，半衰期長(zhǎng)，具有多器官毒性，可引起肺、腎、肝、骨骼、心血管和生殖系統(tǒng)等器官或組織的損傷。Cd可通過(guò)飲水、食物和空氣等途徑進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，直接刺激或間接誘發(fā)肺相關(guān)疾病。體內(nèi)研究表明，Cd可通過(guò)消化道途徑引起SD大鼠肺組織的病理性改變，導(dǎo)致局灶性肺組織纖維增生、肺間質(zhì)血管閉塞與肺泡腔變小。氯化鎘(cadmium chloride，CdCl)溶液腹腔注射SD大鼠，能夠引起Cd在肺組織中高度蓄積，導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、肺泡間隔增厚及間質(zhì)纖維增生。此外，Cd可顯著上調(diào)肺細(xì)胞凋亡蛋白Bax、capase-3和細(xì)胞色素c(cytochrome-c，cyto-c)的表達(dá)，對(duì)肺產(chǎn)生損傷。體外研究發(fā)現(xiàn)，Cd可顯著誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Cd(5 μmol·L)能夠顯著抑制人肺上皮細(xì)胞Beas-2B細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低膠原蛋白-I(collagen-I，Col-I)、Col-IV及Col-V的表達(dá)，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)是一種含巰基的抗氧化劑，可清除已生成的自由基離子，抑制細(xì)胞凋亡。NAC顯著緩解Cd誘導(dǎo)的多器官或組織來(lái)源的細(xì)胞氧化應(yīng)激或細(xì)胞凋亡。NAC能夠刺激肺泡表面活性物質(zhì)的分泌，亦可促進(jìn)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的生成，明顯改善肺的功能。然而，NAC如何緩解Cd暴露誘導(dǎo)大鼠肺組織損傷的作用機(jī)制尚未闡明。因此，本試驗(yàn)以去卵巢SD大鼠作為動(dòng)物模型，通過(guò)測(cè)定肺組織中Cd含量、觀察肺組織病理變化、檢測(cè)肺組織Col-I和Col-III mRNA的轉(zhuǎn)錄水平及凋亡蛋白的表達(dá)，旨在探討NAC通過(guò)抑制大鼠肺細(xì)胞凋亡緩解Cd致肺組織損傷的作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用NAC防治Cd暴露引起的肺損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡雌性SD大鼠40只，體重240 g±10 g，購(gòu)自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑與儀器

NAC和CdCl購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒和Masson染色試劑盒購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和無(wú)RNA酶水購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。Bcl-2、Bax、cleaved caspase- 3(Asp175)、p-Akt、Akt、p53、β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗和HRP標(biāo)記的兔抗小鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling technology公司。Trizol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。其他試劑由實(shí)驗(yàn)室提供。

Milli-Q Biocel型超純水系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore公司。5810R低溫高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。微波消解儀購(gòu)自安東帕(上海)商貿(mào)有限公司。Nanodrop 2000型超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。Epoch型超微量微孔板分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。電泳儀和電泳槽購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。Tanon 5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。PinAAcle 900F火焰原子吸收光譜儀購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。ABI7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 試驗(yàn)分組與處理

40只雌性SD大鼠通過(guò)卵巢摘除術(shù)去除卵巢，飼養(yǎng)室控制晝夜時(shí)間均等(12 h/12 h)，室溫飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境清潔和安靜，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0020。40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照(Control)組、Cd組、NAC組和NAC + Cd組，每組10只。各組按以下方法處理：對(duì)照組大鼠正常飼喂，自由飲用超純水；NAC組與NAC + Cd組大鼠自由飲用NAC水(濃度為100 mg·L)，持續(xù)1個(gè)月；預(yù)處理結(jié)束，Cd組與NAC+Cd組大鼠自由飲用鎘水(濃度為50 mg·L)。18個(gè)月后，所有大鼠肌內(nèi)注射2 %戊巴比妥鈉(劑量60 mg·kg，根據(jù)體重計(jì)算用量)，斷頸處死大鼠，完整分離肺。分塊裝入離心管中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Cd含量測(cè)定

使用微波消解儀對(duì)大鼠肺組織進(jìn)行消解。方法：將各組大鼠肺組織置于80 ℃烘箱內(nèi)烘干、研磨粉碎，精確稱(chēng)取0.2 mg組織粉末置于消解管，添加4 mL硝酸(分析純)。按照梯度溫度(90 ℃、120 ℃至 170 ℃)的方法進(jìn)行加熱。冷卻后，轉(zhuǎn)移至離心管，每管定容至10 mL，置于室溫。使用PinAAcle 900F火焰原子吸收光譜儀進(jìn)行Cd含量測(cè)定。

1.5 HE染色與Masson染色

將新鮮肺組織置于4%多聚甲醛溶液，固定24 h。通過(guò)梯度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋。利用切片機(jī)進(jìn)行組織切片，漂浮于40 ℃溫水，使切片鋪開(kāi)，將組織切片置于載玻片，置于60 ℃烘箱內(nèi)烤片。經(jīng)HE染色和Masson染色，封片，光學(xué)顯微鏡觀察，并拍照。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)肺組織Col-I和Col-III mRNA的變化

利用Trizol試劑提取肺組織總RNA。Nanodrop 2000型超微量分光光度計(jì)對(duì)樣品RNA進(jìn)行純度檢測(cè)，即A/A比值。HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑反轉(zhuǎn)錄獲取樣品cDNA模板，以ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)肺組織-I和-III mRNA的表達(dá)。引物序列如表1，其中，-n為內(nèi)參基因。20 μL反應(yīng)體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，補(bǔ)充無(wú)RNA酶水至20 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)。采用ABI7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，采用2-ΔΔ法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 目的基因引物序列Table 1 The primers of sequence for target genes

1.7 Western blot

RIPA裂解液對(duì)組織樣品進(jìn)行裂解，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組樣品蛋白濃度，并將各組濃度調(diào)整一致。將5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液加入各組樣品，沸水煮10 min。電泳條件為110 V，90 min；轉(zhuǎn)膜條件為260 mA，90 min；5%脫脂乳封閉，室溫2 h；加入相應(yīng)一抗(Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-Akt、Akt、p53、β-actin抗體)，4 ℃過(guò)夜；收集一抗抗體，加入二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔抗體、HRP標(biāo)記兔抗小鼠抗體)，室溫孵育2 h。收集二抗抗體，通過(guò)Tanon 5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行攝片。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肺組織中Cd含量的測(cè)定

如圖1所示。與Control組相比，Cd組大鼠肺組織中Cd的含量極顯著(<0.01)增加，而NAC組無(wú)差異性(>0.05)。與Cd組相比，NAC+Cd組大鼠肺組織中Cd的含量極顯著(<0.01)減少。

**.P<0.01；*.P<0.05，下同**.P<0.01；*.P<0.05，the same as below圖1 大鼠肺組織中Cd含量變化Fig.1 The changes of cadmium (Cd) content of lung tissue in rats

2.2 大鼠肺組織病理學(xué)觀察

如圖2所示。對(duì)大鼠肺組織進(jìn)行HE染色與Masson染色，與Control組相比，Cd組可見(jiàn)大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺纖維組織增生。與Cd組相比，NAC+Cd組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)，并緩解肺組織損傷。

圖2 大鼠肺組織HE染色與Masson染色(200×)Fig.2 The observation of HE staining and Masson staining of lung tissue in rats (200×)

2.3 qRT-PCR檢測(cè)大鼠肺組織Col-I和Col-III mRNA的表達(dá)水平

如圖3所示。與Control相比，Cd組大鼠肺組織中-I和-III mRNA表達(dá)極顯著(<0.01)升高，而NAC組無(wú)差異性(>0.05)。與Cd組相比，NAC+Cd組大鼠肺組織中-I和-III mRNA的表達(dá)極顯著(<0.01)下降。

圖3 NAC對(duì)Cd處理的大鼠肺組織纖維化關(guān)鍵蛋白Col-I和Col-III mRNA的影響Fig.3 The effect of NAC on fibrosis protein Col-I和Col-III mRNA of lung tissue treated by Cd in rats

2.4 Western blot檢測(cè)大鼠肺組織凋亡蛋白Bcl-2、Bax及cleaved caspase-3的表達(dá)

如圖4所示。與Control相比，Cd組大鼠肺組織中Bax/Bcl-2的比值和cleaved caspase-3的表達(dá)極顯著(<0.01)升高，而NAC組無(wú)差異性(>0.05)。與Cd組相比，NAC+Cd組大鼠肺組織中Bax/Bcl-2的比值和cleaved caspase-3的表達(dá)顯著(<0.01或<0.05)下降。

圖4 NAC對(duì)Cd處理的大鼠肺組織凋亡蛋白(Bcl-2、Bax及cleaved caspase-3)表達(dá)的影響Fig.4 The effect of NAC on apoptosis-related protein (Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3) expression of lung tissue treated by Cd in rats

2.5 Western blot檢測(cè)大鼠肺組織Akt磷酸化及p53的表達(dá)

如圖5所示。與Control相比，Cd組大鼠肺組織中p-Akt/Akt的比值極顯著(<0.01)降低，p53的表達(dá)極顯著(<0.01)升高，而NAC組無(wú)差異性(>0.05)。與Cd組相比，NAC+Cd組大鼠肺組織中p-Akt/Akt的比值極顯著(<0.01)增加，而p53的表達(dá)極顯著(<0.01)下降。

圖5 NAC對(duì)Cd處理的大鼠肺組織Akt磷酸化及p53表達(dá)的影響Fig.5 The effect of NAC on Akt phosphorylation and p53 expression of lung tissue treated by Cd in rats

3 討 論

環(huán)境中的重金屬主要來(lái)源于工業(yè)廢棄物的泄漏，并對(duì)動(dòng)物的健康構(gòu)成潛在的威脅。Cd作為一種無(wú)生理功能的重金屬，被認(rèn)為是損傷動(dòng)物機(jī)體的有毒有害物質(zhì)之一。在世界范圍內(nèi)，Cd及其化合物在環(huán)境中的生產(chǎn)和釋放顯著增加，但無(wú)有效的回收方式。Cd可在機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期積累，半衰期長(zhǎng)。Cd作為一種環(huán)境性雌激素，通過(guò)“模仿”雌激素的功能，以高親和力在受體激素結(jié)合域活化雌激素受體(estrogen receptor，ER)，發(fā)揮內(nèi)分泌干擾物的作用。然而，這種作用可被抗雌激素藥物阻斷。此外，動(dòng)物的性別可影響肺相關(guān)疾病的患病率，一方面，與性激素是否直接相關(guān)尚不清楚；另一方面，性激素可調(diào)節(jié)肺的基本生理狀態(tài)及其發(fā)育過(guò)程。因此，本試驗(yàn)以去卵巢SD大鼠作為動(dòng)物模型，減少或排除雌激素的作用。

Cd及其化合物可引起水、土壤和空氣的污染，最終進(jìn)入植物、動(dòng)物或人機(jī)體內(nèi)。已知Cd是動(dòng)物體內(nèi)最易積累的毒性重金屬之一，機(jī)體組織半衰期可長(zhǎng)達(dá)30年，血液中半衰期為3～4個(gè)月。Cd可與機(jī)體內(nèi)的氨基、巰基、硫蛋白等結(jié)合，損害酶防御系統(tǒng)，破壞肺、肝、腎等器官的正常結(jié)構(gòu)，引發(fā)機(jī)體組織內(nèi)Cd的蓄積。本試驗(yàn)結(jié)果證明Cd組大鼠肺組織中Cd含量顯著增加，血清中Cd的含量也顯著增加(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。此外，Cd與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生密切相關(guān)，其通過(guò)觸發(fā)波形蛋白瓜氨酸化，活化成纖維細(xì)胞，上調(diào)纖維化蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致肺纖維化。成纖維細(xì)胞可活化細(xì)胞外基質(zhì)Col-I和Col-III，后兩者的過(guò)度沉積導(dǎo)致組織的纖維化。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Cd組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)損傷、萎縮或消失，肺纖維組織增生，顯著升高-I和-III mRNA的表達(dá)。這表明Cd暴露可增加大鼠肺組織中Cd含量，誘導(dǎo)肺組織纖維化膠原酶-I和-III mRNA表達(dá)的上調(diào)。

動(dòng)物試驗(yàn)及臨床數(shù)據(jù)分析表明，Cd可引起肺損傷，誘導(dǎo)肺細(xì)胞凋亡。Cd能夠破壞動(dòng)物機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，活化肺細(xì)胞線(xiàn)粒體凋亡途徑，上調(diào)凋亡蛋白Bax、caspase-3、細(xì)胞色素C和p53 mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。低濃度(1～10 μmol·L)醋酸鎘(CdAc)處理大鼠克拉拉細(xì)胞(Clara細(xì)胞)與肺泡II型細(xì)胞，能夠以Bax與p53依賴(lài)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Cd誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞的多種類(lèi)型死亡，通過(guò)線(xiàn)粒體膜電位的“崩潰”，以caspase-3依賴(lài)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如前所述，Cd作為一種環(huán)境性雌激素，可結(jié)合雌激素受體，后者始終存在于肺細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞中。其中，雌激素受體β能夠活化PI3K/Akt/Bcl-XL信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、線(xiàn)粒體合成及抗細(xì)胞凋亡的作用。然而，Cd可通過(guò)激活大鼠神經(jīng)元細(xì)胞中Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路，并誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。Cd也可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，通過(guò)活化豬淋巴結(jié)或雞腎組織中PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Cd組大鼠肺組織中細(xì)胞凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和p53的表達(dá)顯著增加，Akt磷酸化受抑制(這與其他研究結(jié)果不太一致。分析認(rèn)為本研究中動(dòng)物模型為去卵巢SD大鼠，可能是雌激素受體在該過(guò)程中發(fā)揮了比較重要的調(diào)節(jié)作用，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí))。這表明Cd暴露可誘導(dǎo)大鼠肺組織細(xì)胞凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)，并通過(guò)p53途徑進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡。

NAC作為一種常用的小分子高效抗氧化劑，可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽-S-基轉(zhuǎn)移酶的活性誘導(dǎo)還原型谷胱甘肽(GSH)的合成，清除氧自由基離子，發(fā)揮抗氧化的作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，NAC可顯著降低大鼠肺組織中Cd含量，緩解肺組織病理變化，表明NAC對(duì)肺組織損傷有一定的緩解作用。此外，NAC能夠緩解Cd誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞的損傷，上調(diào)凋亡蛋白Bcl-2/Bax的比值與cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞凋亡率。鄭嘉銘的研究也表明，NAC可顯著下調(diào)Cd誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比值與p53及cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)。最近研究表明，NAC通過(guò)降低外周血結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)與纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的表達(dá)，發(fā)揮抗肺纖維化的作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，NAC可顯著下調(diào)Cd組大鼠肺組織中細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比值與cleaved caspase-3及p53蛋白的表達(dá)。這表明NAC可降低Cd致大鼠肺組織凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)，進(jìn)一步緩解Cd誘導(dǎo)的肺組織凋亡。

4 結(jié) 論

本研究從肺細(xì)胞凋亡的角度探討了NAC對(duì)Cd致大鼠肺組織損傷的緩解作用，并通過(guò)p53途徑減輕肺組織病理變化及下調(diào)肺細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)。這為NAC緩解Cd誘導(dǎo)肺損傷相關(guān)的機(jī)理研究提供新的理論依據(jù)。