操慶國(guó)，郭 欽，彭 凱，蔡佳惠，任成萬，李昀庭

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院，句容 212400； 2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant，MRSA)是一種高度且多重耐藥的食源性致病菌，已被列為3大世界最難解決的感染性疾患之一。MRSA基因組中含有葡萄球菌染色體盒，后者攜帶基因，其編碼新的青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)PBP2a，具有轉(zhuǎn)糖基酶和轉(zhuǎn)肽酶活力，通過催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)合成肽聚糖。PBPs是細(xì)菌細(xì)胞膜上能與β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合的蛋白質(zhì)，MRSA中包含6種PBPs(PBP1、PBP2、PBP3、PBP3’、PBP4和獨(dú)特的PBP2a)。PBP2a和β-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎沒有親和力，當(dāng)其他PBPs與β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合失去活性后，PBP2a仍可繼續(xù)參與肽聚糖合成，因此MRSA對(duì)幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素均耐藥。此外，、和等基因也對(duì)MRSA的耐藥性起重要作用。MRSA是導(dǎo)致化膿性關(guān)節(jié)炎、皮膚和軟組織感染、肺炎、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等嚴(yán)重感染的主要細(xì)菌病原體之一。MRSA分泌的腸毒素?zé)岱€(wěn)定性較好，100 ℃處理30 min后仍保持活性，是高溫滅菌后引起食物MRSA中毒的主要原因。

MRSA可通過食物鏈傳播，近年來，世界范圍內(nèi)從肉類到乳制品等多種食品中都發(fā)現(xiàn)了MRSA。易受MRSA污染的食物包括發(fā)酵制品、乳制品和肉魚類制品等。Jones等在2002年首次報(bào)道了由社區(qū)獲得性MRSA引起的食物中毒。檢測(cè)美國(guó)5個(gè)城市的136份肉類樣品發(fā)現(xiàn)， 42%的豬肉感染了葡萄球菌(SA)，其中，64%為MRSA感染。在瑞士和日本的肉類產(chǎn)品中，SA的檢出率分別為23%和65%。食用被MRSA污染的食物，極易引起嘔吐、腹瀉、腸胃炎等，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起食物中毒，甚至危及生命。MRSA對(duì)食品安全構(gòu)成了巨大威脅，占北美細(xì)菌性食物中毒的9.52%，每年約造成1.5億美元的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，MRSA已發(fā)生轉(zhuǎn)移，通過環(huán)境、畜牧業(yè)、食物鏈等進(jìn)入人體，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅。2005年，首次證實(shí)豬源MRSA可通過豬傳給人群。Boer等在264/2217份樣本中發(fā)現(xiàn)MRSA(11.9%)，Neeling等在荷蘭9個(gè)屠宰場(chǎng)中抽取的209/540頭豬鼻腔中有MRSA，每個(gè)屠宰場(chǎng)中均有生豬被檢出帶有MRSA。由于MRSA對(duì)四環(huán)素類、林可胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類等多種抗菌藥物也有耐藥性，使防治MRSA引起的牲畜感染非常困難，高效、安全的動(dòng)物源MRSA新型抗菌藥物急需開發(fā)。

新型抗生素研發(fā)一般需要10～15年，而細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生僅需要2～3年，因此天然產(chǎn)物與抗生素聯(lián)合抑菌被視作防治MRSA的研究熱點(diǎn)之一。已發(fā)現(xiàn)的PBP2a天然產(chǎn)物抑制劑包括黃芩中的黃芩苷、綠茶中的兒茶素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCg)、大角蓮中的柯里拉京和玫瑰中的鞣質(zhì)和特里馬素等。此外，小舌菊和四環(huán)素聯(lián)用、黃連葉精油或姜花素D或刺苞菊醛和慶大霉素聯(lián)用、鼠尾草酸和諾氟沙星等的聯(lián)用皆能協(xié)同降低抗生素對(duì)MRSA的MIC，但協(xié)同抑菌機(jī)制并未得到清晰的闡明。本研究從多種天然產(chǎn)物中進(jìn)行抗MRSA篩選，并與抗生素進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗(yàn)，同時(shí)闡釋天然產(chǎn)物與抗生素聯(lián)合抑制MRSA的分子機(jī)制，為降低畜牧養(yǎng)殖中抗生素的使用、提高肉奶類食品安全奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)購(gòu)自武漢大學(xué)菌種保藏中心，MRSA(ATCC 33591)購(gòu)自美國(guó)模式菌種保藏中心(American type culture collection，ATCC)，鹽酸小檗堿(BBR)購(gòu)自西安優(yōu)碩生物科技有限公司，阿莫西林、左氧氟沙星、萬古霉素、氯霉素、頭孢唑林、青霉素、四環(huán)素均購(gòu)自上海原葉生物有限公司；RNAprep Pure提取試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRR Premix Ex TaqTM‖PCR試劑盒購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物有限公司(TaKaRa)，牛肉浸粉購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。

超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇凈化設(shè)備有限公司，LRH系列生化培養(yǎng)箱購(gòu)自一恒科學(xué)儀器有限公司，高壓滅菌鍋購(gòu)自鳥取三洋電機(jī)，HYG-C型多功能搖床購(gòu)自太倉(cāng)試驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)檢測(cè)

1.2.1.1 天然產(chǎn)物配制：稱取BBR 0.1 g，振蕩后均勻溶解于1 mL水中，濃度為 0.1 g·mL，過濾除菌后，4 ℃保存。

1.2.1.2 抗生素配制：稱取7種抗生素0.012 8 g，溶解于1 mL無菌水中，濃度為12.8 mg·mL，過濾除菌后，-20 ℃避光保存。

1.2.1.3 MIC/MBC測(cè)定：按照微量肉湯稀釋法進(jìn)行。96孔板橫排前十孔每孔加入10 μL 水解酪蛋白培養(yǎng)基(MH培養(yǎng)基)后，在第1孔內(nèi)加入10 μL BBR或者抗生素，均勻震蕩后，吸出10 μL加入至第2孔，依次梯度稀釋，直至第10孔。之后，每孔加入90 μL細(xì)菌培養(yǎng)液，使終體積為100 μL，細(xì)菌終濃度為5×10CFU·mL。第11孔中加入100 μL的菌液作為陽(yáng)性對(duì)照，第12孔采用空白NB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。將96孔板在37 ℃培養(yǎng)24～48 h，以24 h無菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC，48 h后肉眼無細(xì)菌生長(zhǎng)的試管中取100 μL菌液涂平板；過夜培養(yǎng)后平板無菌生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)肉湯管中的最低藥物濃度，即是MBC。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

1.2.1.4 聯(lián)合抑菌和FIC測(cè)定：采用棋盤法進(jìn)行，96孔板中每橫排從左至右依次加入5 μL抗生素(終濃度為2MIC～1/64MIC)，每縱列從上至下依次加入5 μL BBR(終濃度為1/2 MIC～1/32 MIC)，再加入90 μL菌液(終濃度為5×10CFU·mL)，終體積100 μL。分別加入100 μL的菌液和空白培養(yǎng)基為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h，無菌生長(zhǎng)的最低濃度為抗生素和BBR聯(lián)合抑菌MIC。

抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration, FIC)計(jì)算方法：

FIC=MIC(聯(lián)合)/MIC(BBR)+MIC(聯(lián)合)/MIC(抗生素)

協(xié)同：FIC≤0.5；相加：0.52。

1.2.2 時(shí)間殺滅曲線測(cè)定 設(shè)置BBR組(1/4 MIC BBR、1/2 MIC BBR和MIC BBR)、MIC抗生素組和聯(lián)合組(1/8 MIC BBR+1/32 MIC 抗生素)，以無藥物加入的NB培養(yǎng)液為對(duì)照，分別加入細(xì)菌培養(yǎng)物，使終濃度為1×10CFU·mL。7組試管于37 ℃ 振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，稀釋后，涂NB平板，37 ℃培養(yǎng)12～24 h 后計(jì)數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪圖，即時(shí)間殺滅曲線。

1.2.3 電導(dǎo)率測(cè)定 取100 μL細(xì)菌過夜培養(yǎng)物，稀釋50倍后，分別加入BBR、抗生素和聯(lián)合抑菌液，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)。于0、1、2、4、6、8 h分別定時(shí)取樣，5 000 r·min離心10 min，吸取上清液，無菌水均勻稀釋，測(cè)定電導(dǎo)率。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

1.2.4 膜電位測(cè)定 細(xì)菌于NB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h，取100 μL過夜培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)接到含有BBR、抗生素和聯(lián)合抑菌液的培養(yǎng)基中，混合均勻，取100 μL混合液加入96孔板中，過夜培養(yǎng)。用5 μmol·LDiBAC4(3) 緩沖液清洗96孔板3次，加入180 μL 5 μmol·LDiBAC4(3)的緩沖液進(jìn)行染色，37 ℃孵育30 min，多功能酶標(biāo)儀3 min檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度。以無細(xì)菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.2.5 堿性磷酸酶(AKP)的測(cè)定 取100 μL細(xì)菌過夜培養(yǎng)物加入5 mL NB培養(yǎng)基中，再分別加入BBR、抗生素和聯(lián)合抑菌液，37 ℃ 下振蕩培養(yǎng)，0、1、2、4、6、8 h 定時(shí)取500 μL樣品，5 000 r·min離心10 min，用試劑盒測(cè)定AKP含量。

1.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR) 細(xì)菌過夜活化，1∶100的比例轉(zhuǎn)接到分別含有BBR、抗生素和聯(lián)合抑菌液的NB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，提取mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，16S rRNA為內(nèi)參基因，使用熒光定量試劑盒，測(cè)定的表達(dá)水平。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性 30 s；95 ℃ 變性5 s，50～ 60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線從 65 ℃ 升至 95 ℃，每5 s升溫0.5 ℃。

1.2.7 轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè) 送北京諾禾致源有限公司協(xié)作完成。具體操作為提取樣品的總mRNA，使用fragmentation buffer隨機(jī)將其打斷成短片段，按照鏈特異性建庫(kù)的方式建庫(kù)。在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中，將片段化的mRNA作為模板，隨機(jī)寡核苷酸作為引物，合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，將dNTPs(將dNTP中的dTTP用dUTP取代)作為原料在DNA polymerase I 體系下合成cDNA第二條鏈(使第二條鏈中包含A/U/C/G)，再用AMPure XP beads篩選250～300 bp的cDNA，通過cDNA末端修復(fù)、加A尾、連接測(cè)序接頭，并借助USER酶降解含U的cDNA第二鏈，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增并獲得文庫(kù)。

庫(kù)檢合格后，根據(jù)有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求對(duì)不同文庫(kù)pooling后，再按照邊合成邊測(cè)序(sequencing by synthesis)的原理進(jìn)行Illumina測(cè)序。添加4種熒光標(biāo)記的dNTP、DNA聚合酶以及接頭引物于測(cè)序的flow cell中進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)測(cè)序簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP即可釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光，并利用軟件將測(cè)序儀接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰，從而獲得待測(cè)片段的序列信息。

1.2.8 生物信息學(xué)分析 對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行GO富集、KEGG富集和差異基因篩選。值≤0.05的通路定義為在顯著差異表達(dá)基因中顯著富集的通路。應(yīng)用DESeq2方法計(jì)算不同樣本之間基因表達(dá)量的差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的確定為差異表達(dá)基因。值<0.05，F(xiàn)DR≤0.01和差異表達(dá)倍數(shù)≥2的基因即顯著差異表達(dá)基因。

2 結(jié) 果

2.1 抗生素和BBR單獨(dú)作用于SA/MRSA的MIC

BBR與抗生素單獨(dú)作用于SA/MRSA的MIC/MBC見表1。7種抗生素對(duì)SA/MRSA均有抑菌效果，但對(duì)MRSA的MIC顯著高于SA，除萬古霉素和氯霉素以外，其他5種抗生素對(duì)MRSA的MIC比SA高了100倍～2 000倍之多。其中，阿莫西林對(duì)SA的抑菌效果最佳，MIC為0.5 μg·mL；萬古霉素對(duì)MRSA的抑菌效果最佳，MIC為2 μg·mL。BBR對(duì)SA和MRSA的抑菌效果一致，均為1 250 μg·mL。

表1 不同抗生素對(duì)SA/MRSA的MIC和MBCTable 1 MICs and MBCs of different antibiotics against SA/MRSA μg·mL-1

2.2 抗生素和BBR聯(lián)用的FIC

BBR和7種抗生素聯(lián)用對(duì)SA均具有協(xié)同抑菌作用，但只與4種抗生素聯(lián)用能協(xié)同抑制MRSA(表2)。其中，1/32 MIC BBR+1/64 MIC青霉素聯(lián)用對(duì)SA具有最小的FIC值0.047，但對(duì)MRSA卻呈現(xiàn)無關(guān)作用；1/32 MIC BBR+1/32 MIC阿莫西林聯(lián)用對(duì)MRSA具有最小的FIC值0.063，1/16 MIC BBR+1/4 MIC左氧氟沙星對(duì)SA和MRSA的FIC均為0.313。由于阿莫西林對(duì)MRSA的MIC太高，為5 120 μg·mL，而左氧氟沙星僅為128 μg·mL，因此選擇左氧氟沙星進(jìn)行之后的試驗(yàn)。聯(lián)合抑菌結(jié)果表明，BBR不但能夠直接抑制MRSA，而且與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用能夠恢復(fù)其對(duì)MRSA菌株的敏感性。

表2 BBR與各抗生素聯(lián)用對(duì)SA/MRSA作用對(duì)比Table 2 Comparison of the effects of BBR combined with various antibiotics on SA/MRSA

2.3 時(shí)間殺滅曲線

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)BBR和左氧氟沙星的殺菌效果，作者測(cè)定了它們單獨(dú)和聯(lián)合分別作用于MRSA的時(shí)間殺滅曲線。當(dāng)MRSA初始接種濃度為1×10CFU·mL時(shí)，24 h后MIC BBR組細(xì)菌顯著下降，為(5.57±0.21)×10CFU·mL(<0.05)；而1/4 MIC BBR組和1/2 MIC BBR組則分別為(6.17±0.15)×10和(6.3±0.2)×10CFU·mL，對(duì)照組細(xì)菌數(shù)可達(dá)(1.16±0.04)×10CFU·mL(圖1a)。24 h后，MIC左氧氟沙星組細(xì)菌數(shù)為(6.07±0.29)×10CFU·mL，而聯(lián)合組則為(4.7±0.2)×10CFU·mL(圖1b)。聯(lián)合組的抑菌效果不如左氧氟沙星單獨(dú)作用，原因可能是因?yàn)閺?fù)配濃度大幅度降低的原因，但兩者聯(lián)用依然可以抑制MRSA的生長(zhǎng)繁殖，達(dá)到有效的MIC水平。

a.BBR； b. BBR和左氧氟沙星聯(lián)合a.BBR; b. The combination of BBR and levofloxacin圖1 對(duì)MRSA的時(shí)間殺滅曲線Fig.1 Time-kill curve of drugs against MRSA

2.4 BBR和抗生素聯(lián)用破壞MRSA細(xì)胞結(jié)構(gòu)

電導(dǎo)率可以衡量細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，電導(dǎo)率越大，細(xì)胞膜被破壞越嚴(yán)重，因此可通過菌液電導(dǎo)率的變化判斷細(xì)菌細(xì)胞膜的受損情況。結(jié)果表明，對(duì)照組菌液8 h內(nèi)電導(dǎo)率無顯著變化， BBR+左氧氟沙星聯(lián)合組電導(dǎo)率變化率顯著高于對(duì)照組但低于BBR組(<0.05)(圖2a)。

a.電導(dǎo)率變化；b.熒光強(qiáng)度變化；c.AKP活性a. Conductivity change; b. Fluorescence intensity change; c. AKP activity圖2 BBR和抗生素聯(lián)用破壞MRSA細(xì)胞結(jié)構(gòu)Fig.2 The combination of BBR and antibiotics destroyed the cell structure of MRSA

DiBAC4(3)是一種親脂性陰離子熒光染料，本身無熒光，但它能和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，當(dāng)細(xì)胞膜受損，細(xì)胞熒光會(huì)大幅度增加。結(jié)果表明，對(duì)照組菌液30 min內(nèi)熒光強(qiáng)度無顯著變化，聯(lián)合組的熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組而低于BBR組(圖2b)。

AKP的活性表明細(xì)菌細(xì)胞壁的破損程度。8 h內(nèi)，對(duì)照組AKP活性無顯著變化，而聯(lián)合組AKP活性顯著高于對(duì)照組卻顯著低于BBR組(<0.05)(圖2c)。

2.5 BBR和抗生素聯(lián)用下調(diào)mecA表達(dá)

圖3表明，BBR顯著下調(diào)了的相對(duì)表達(dá)水平，且呈現(xiàn)濃度依賴，與對(duì)照組相比，添加1/4 MIC、1/8 MIC和1/32 MIC BBR的分別降低為對(duì)照組的16.69%、5.26%和75.19%(<0.05)，說明可能是BBR的作用靶點(diǎn)之一。左氧氟沙星組表達(dá)上調(diào)26.82倍，而聯(lián)合組卻顯著降低的相對(duì)表達(dá)水平為對(duì)照的1.35%(<0.05)。BBR作用于，使得MRSA細(xì)胞壁完整性降低，而左氧氟沙星作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶II，兩者聯(lián)用能大幅度協(xié)同下調(diào)的表達(dá)。

1. 對(duì)照組; 2. 1/4MIC BBR; 3. 1/8MIC BBR; 4. 1/32MIC BBR; 5. 1/64MIC萬古霉素； 6. 1/64MIC 萬古霉素+1/8MIC BBR； 7. 1/8MIC氯霉素； 8. 1/8MIC 氯霉素+1/4MIC BBR； 9. 1/32MIC左氧氟沙星； 10. 1/32MIC左氧氟沙星+1/8MIC BBR; 11. 1/32MIC阿莫西林； 12. 1/32MIC阿莫西林+BBR 1/8MIC; 13. 1/16MIC紅霉素； 14. 1/16MIC 紅霉素+BBR 1/8MIC； 15. 1/8MIC四環(huán)素； 16. 1/8MIC四環(huán)素+BBR 1/4MIC； 17. 1/64MIC磺胺甲惡唑； 18. 1/64MIC磺胺甲惡唑+1/32MIC BBR組1. Control group; 2. BBR 1/4MIC group; 3. BBR 1/8MIC group; 4. BBR 1/32MIC group; 5. Vancomycin 1/64MIC group; 6. Vancomycin 1/64MIC+BBR 1/8MIC group; 7. Chloramphenicol 1/8MIC group; 8. Chloramphenicol 1/8MIC +BBR 1/4MIC group; 9. Levofloxacin 1/32MIC group; 10. Levofloxacin 1/32MIC+BBR 1/8MIC group; 11. Amoxicillin 1/32MIC group; 12. Amoxicillin 1/32MIC+BBR 1/8MIC group; 13. Erythromycin 1/16MIC group; 14. Erythromycin 1/16MIC+BBR 1/16MIC group; 15. Tetracycline 1/8MIC group; 16. Tetracycline 1/8MIC+BBR 1/4MIC group; 17. Sulfamethoxazole 1/64MIC group; 18. Sulfamethoxazole 1/64MIC+BBR 1/32MIC group圖3 mecA基因表達(dá)變化Fig.3 The mecA expression change of MRSA

2.6 BBR和左氧氟沙星聯(lián)用的分子機(jī)制

GO富集結(jié)果(圖4)表明，BBR影響MRSA 73個(gè)基因的表達(dá)，重要的上調(diào)基因功能包括氧化還原、氨基酸和維生素的合成與代謝，重要的下調(diào)基因功能包括轉(zhuǎn)錄和同化。

a. BBR; b. 左氧氟沙星；c. 聯(lián)合組a. BBR; b. Levofloxacin; c. Combination group圖4 差異表達(dá)基因GO富集Fig.4 Go enrichment of differentially expressed genes

左氧氟沙星影響MRSA 114個(gè)基因的表達(dá)，重要的上調(diào)基因功能包括有機(jī)氮化合物的合成和代謝、細(xì)胞酰胺合成和代謝過程以及碳水化合物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，重要的下調(diào)基因功能包括藥物反應(yīng)、發(fā)展過程、對(duì)化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)和磷脂生物合成過程。細(xì)胞膜由磷脂雙分子層構(gòu)成，左氧氟沙星使得磷脂合成受到抑制，則細(xì)胞膜更易受到破壞，細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞形態(tài)難以維持。這可能是兩者聯(lián)用導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)的原因之一。

聯(lián)合組影響MRSA 95個(gè)基因的表達(dá)，重要的上調(diào)基因功能包括維生素合成和代謝、細(xì)胞骨架組織、嘧啶化合物代謝過程和硫化合物的生物合成過程，重要的下調(diào)基因功能主要包括氨基酸、陰離子、有機(jī)酸和羧酸的運(yùn)輸和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

表3～5總結(jié)了BBR、左氧氟沙星和聯(lián)合組的KEGG富集結(jié)果。其中，與BBR抑菌有關(guān)的可能為維生素B2代謝、β-內(nèi)酰胺抗性、雙組分系統(tǒng)和多樣環(huán)境中的微生物代謝，與左氧氟沙星組抑菌有關(guān)可能為甘油磷脂代謝，與聯(lián)合組抑菌有關(guān)的代謝通路可能為維生素B2代謝和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體。

表3 BBR KEGG 富集匯總Table 3 KEGG enrichment summary of the BBR group

表4 左氧氟沙星組主要代謝通路的 KEGG 富集匯總Table 4 KEGG enrichment summary of the levofloxacin group

表5 聯(lián)合組 KEGG 富集匯總Table 5 KEGG enrichment summary of the combination group

2.7 重要的差異表達(dá)基因

與對(duì)照組相比，BBR、左氧氟沙星和聯(lián)合組的重要差異表達(dá)基因如表6。BBR組和基因表達(dá)量與對(duì)照組相比分別下調(diào)為對(duì)照的42.92%和44.05%；BBR組、左氧氟沙星組及聯(lián)合組中基因表達(dá)量均顯著下調(diào)，分別下調(diào)為對(duì)照組的46.73%、36.63%和43.67%；在組和聯(lián)合組均表現(xiàn)為上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)分別為2.69和3.64倍。

表6 重要差異表達(dá)基因Table 6 Important differentially expressed genes

3 討 論

β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺核能不可逆地與PBPs的Ser 403位點(diǎn)結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)肽酶的活性位點(diǎn)從而阻止肽聚糖合成，抑制細(xì)胞壁合成，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。當(dāng)正常PBPs與β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合失去活性時(shí)，PBP2a可以代替它們合成繼續(xù)肽聚糖，從而維持MRSA的生長(zhǎng)繁殖。

雖然阿莫西林、青霉素和頭孢唑林均作用于MRSA的細(xì)胞壁，但它們和BBR聯(lián)用產(chǎn)生的抑菌效果不同，推測(cè)可能是由于它們對(duì)MRSA細(xì)胞壁的作用靶點(diǎn)不同。PBP2a在其余PBPs失去活性后仍能維持MRSA的細(xì)胞壁形態(tài)。研究認(rèn)為，兩種藥物聯(lián)用時(shí)，作用靶位相同會(huì)產(chǎn)生拮抗作用，當(dāng)聯(lián)用的兩種藥物分別作用于不同的PBPs時(shí)可產(chǎn)生協(xié)同作用；或者兩種藥物聯(lián)用，而其中一種發(fā)揮β-內(nèi)酰胺酶作用時(shí)，亦可產(chǎn)生協(xié)同作用。青霉素作用位點(diǎn)為PBP1，頭孢唑林抗菌的作用位點(diǎn)主要為PBP1和PBP3，低濃度的阿莫西林可使PBP4及PBP5達(dá)到部分飽和。當(dāng)三者和BBR聯(lián)用，頭孢唑林和阿莫西林繼續(xù)協(xié)同抑制SA和MRSA，青霉素則失去協(xié)同抑制MRSA的效果，這也許說明BBR對(duì)MRSA的一個(gè)作用位點(diǎn)可能是PBP1。左氧氟沙星主要作用靶位是拓?fù)洚悩?gòu)酶II，因此和BBR具有協(xié)同作用。

BBR組的電導(dǎo)率和熒光強(qiáng)度顯著高于抗生素組和聯(lián)合組，可能是因?yàn)槠淠軌蛟黾蛹?xì)胞膜通透性，促進(jìn)物質(zhì)泄漏。細(xì)胞膜不是左氧氟沙星的作用靶點(diǎn)，而BBR可通過增加細(xì)胞膜通透性，從而與其產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用。BBR與左氧氟沙星聯(lián)用時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著大于對(duì)應(yīng)抗生素組，表明MRSA細(xì)胞產(chǎn)生超極化現(xiàn)象，抗生素更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。BBR能提高提升細(xì)胞壁通透性，當(dāng)其降低濃度與左氧氟沙星聯(lián)用時(shí)，細(xì)菌AKP活性增高，表明聯(lián)用后細(xì)胞壁進(jìn)一步受到破壞，細(xì)胞形態(tài)完整性難以維持，抗生素更容易突破胞壁屏障，進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，從而造成更好的殺菌效果。

天然產(chǎn)物往往具有多種抑菌機(jī)制，基因可能只是其中一個(gè)靶點(diǎn)，為了進(jìn)一步尋找聯(lián)合抑菌機(jī)制，作者對(duì)BBR組、左氧氟沙星組和聯(lián)合組進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄學(xué)的研究，對(duì)其差異基因進(jìn)行GO富集、KEGG分析和顯著差異基因的比較。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體中的fhuA是一種鉻鐵-鐵受體，屬于外膜蛋白家族，它與能量轉(zhuǎn)換蛋白TonB一起，介導(dǎo)含鐵載體通過革蘭陰性菌外膜的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體可催化脂雙層的脂類在兩層之間翻轉(zhuǎn)，對(duì)膜的發(fā)生和功能具有重要的意義，還與細(xì)菌對(duì)藥物的抗性有關(guān),其表達(dá)下調(diào)也許說明MRSA細(xì)胞內(nèi)藥物的聚集。

和基因調(diào)控MRSA中一種保守的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(two-component regulatory systems, TCSs)，參與生物膜的生成、莢膜多糖的合成、自我分解、抗生素抗性及血紅素毒素的抗性等。和編碼感應(yīng)器蛋白(如Spa和Fnba)及細(xì)胞壁相關(guān)蛋白(如Eap和Emp)。受到外界信號(hào)激活后發(fā)生自主磷酸化，隨后磷酸化，磷酸化的結(jié)合到P1啟動(dòng)子區(qū)，和RNA聚合酶共同調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程。BBR可通過下調(diào)和基因表達(dá)，抑制MRSA細(xì)胞膜、細(xì)胞壁合成和抗生素抗性基因的表達(dá)。

和可能是BBR和左氧氟沙星聯(lián)合抑菌的重要差異基因。

維生素 B2在生物氧化過程中發(fā)揮遞氧的作用，參與糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝?；虮磉_(dá)上調(diào)不僅限制維生素B2的合成，其基因編碼的雙功能酶的催化還會(huì)導(dǎo)致下游產(chǎn)物5-氨基-6-(D-核糖氨基)尿嘧啶的積累，這種高活性嘧啶二酮化合物對(duì)細(xì)胞的毒害作用可造成細(xì)胞自溶。是MRSA的固有多藥耐藥外排泵，與MRSA的耐藥性極度相關(guān)。受到左氧氟沙星的誘導(dǎo)后，的表達(dá)大幅度增加，從而使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物被更多更快的泵出體內(nèi)，最終造成細(xì)胞耐藥。很多文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)這點(diǎn)，并以為調(diào)控靶點(diǎn)，尋找天然外排泵抑制劑。

是一種機(jī)械敏感通道(mechanosensitive channels, MS)，是一種跨膜通道蛋白，可感受細(xì)胞膜表面的張力。起到“緊急釋放閥”的作用，當(dāng)細(xì)菌的外部環(huán)境滲透壓急劇變化引起細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜上產(chǎn)生張力時(shí)，直接感知張力形成一個(gè)直徑約為3 nm的通道，釋放胞內(nèi)物質(zhì)維持滲透壓的平衡，從而避免細(xì)胞的裂解?；虻南抡{(diào)直接限制了這一調(diào)控機(jī)制，使得MRSA對(duì)外界滲透壓變化的耐受能力顯著降低，較小的滲透壓變化即可使細(xì)胞破裂。

4 結(jié) 論

BBR不但能夠直接抑制MRSA，且與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用時(shí)能夠恢復(fù)其對(duì)MRSA菌株的敏感性，大幅度降低抗生素的使用水平。BBR和左氧氟沙星聯(lián)用對(duì)MRSA效果最佳，可降低左氧氟沙星的MIC至原來的1/16。聯(lián)合抑菌的靶點(diǎn)為細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，包括破壞細(xì)胞壁，增加細(xì)胞膜的通透性，上調(diào)和下調(diào)和表達(dá)水平，從而達(dá)到協(xié)同抑菌的目的。