于志瑞，張 旭，牛莎莎，鄧光存，吳曉玲*

(1.西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 銀川 750021； 2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 銀川 750021； 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院, 銀川 750004)

結(jié)核病(tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(, Mtb)感染所引起的慢性消耗性傳染病，屬于典型的人獸共患傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核病報(bào)告，2020年，全球新發(fā)結(jié)核病例990萬，死亡病例128萬。其中，艾滋病毒陽性人群中的結(jié)核病死亡人數(shù)為21.4萬。除人以外，已發(fā)現(xiàn)50種哺乳動(dòng)物和25種禽類可感染結(jié)核病，它們的流行不僅給畜牧業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅人們健康，從而成為終止結(jié)核病流行，消除結(jié)核病危害的障礙和挑戰(zhàn)。結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)致病菌，對(duì)其感染機(jī)制的研究將為結(jié)核病的預(yù)防及治療提供重要助力。巨噬細(xì)胞作為抵御病原體感染的第一道防線，其會(huì)主動(dòng)吞噬Mtb并在內(nèi)部與其發(fā)生復(fù)雜的斗爭(zhēng)。但同時(shí)，Mtb具有很強(qiáng)的抵抗力，其通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞死亡的方式和時(shí)間來劫持巨噬細(xì)胞，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞壞死來逃避宿主免疫，導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡和細(xì)菌增殖的不斷循環(huán)，以促進(jìn)疾病發(fā)展。因此，了解Mtb如何與宿主巨噬細(xì)胞相互作用來調(diào)控細(xì)胞死亡模式至關(guān)重要。

最新研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, LncRNA)是一類長度超過200個(gè)核苷酸且缺乏蛋白質(zhì)編碼能力的轉(zhuǎn)錄本，其表達(dá)水平失調(diào)與結(jié)核分枝桿菌的感染機(jī)制及細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控密切相關(guān)。如LncRNA NEAT1在結(jié)核病患者血清中高表達(dá)，并且其通過靶向調(diào)控miR-377-3p促進(jìn)Mtb感染巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。由于LncRNA與microRNAs (miRNAs)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的調(diào)控功能及在細(xì)胞或組織中的差異表達(dá)，因此它們已被提議作為結(jié)核病的潛在生物標(biāo)志物。本項(xiàng)目組前期對(duì)巨噬細(xì)胞LncRNA表達(dá)譜及轉(zhuǎn)錄譜等進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA NR_003508是與壞死相關(guān)的LncRNAs分子之一，有關(guān)其如何調(diào)控Mtb誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞壞死的研究尚未見報(bào)道。并且生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)顯示LncRNA NR_003508與miR-483-3p之間存在結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)研究報(bào)道，miR-483-3p是miR-483家族中的一員，位于胰島素樣生長因子受體基因(IGF)2的內(nèi)含子中，參與調(diào)控多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞遷移、增殖和凋亡以及促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌。然而，miR-483-3p在細(xì)胞壞死中的確切作用仍然未知。在細(xì)胞壞死通路中，混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)發(fā)揮關(guān)鍵作用，其被受體相互作用蛋白激酶3(RIPK3)所激活，并形成寡聚體易位至細(xì)胞膜改變膜通透性，最終導(dǎo)致膜破裂來介導(dǎo)細(xì)胞壞死。

綜上所述，Mtb感染后，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)某些因子的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生壞死，從而逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用。然而，在結(jié)核分枝桿菌感染過程中，LncRNA NR_003508作為長鏈非編碼RNA中的一員對(duì)巨噬細(xì)胞壞死的調(diào)控作用尚未闡明。因此，本研究采用牛分枝桿菌疫苗株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7發(fā)生壞死，通過siRNA技術(shù)干擾LncRNA NR_003508的表達(dá)，并利用Western blot、免疫熒光和流式細(xì)胞儀等技術(shù)，檢測(cè)壞死關(guān)鍵蛋白MLKL的表達(dá)水平和細(xì)胞壞死率，從而明確LncRNA NR_003508對(duì)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7壞死的調(diào)控作用，并探討其分子機(jī)制。上述研究有助于闡明Mtb與巨噬細(xì)胞之間的相互作用并為結(jié)核病的診斷或治療提供新的靶點(diǎn)，從而對(duì)畜禽結(jié)核病的流行、臨床診斷和防控具有深遠(yuǎn)意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與抗體

DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清與磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自BI公司，胰酶購自北京索萊寶科技有限公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒和Middlebrook 7H9肉湯培養(yǎng)基購自BD公司；OADC增菌劑購自青島海博公司，全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；蛋白定量(BCA)試劑盒與蛋白Marker購自美國Thermo Fisher公司，Tris甘氨酸-SDS電泳緩沖液購自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司，Western Lighting Plus ECL試劑盒購自美國PerkinElmer公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠GAPDH單克隆抗體(貨號(hào)60008-1-Ig)購自美國Proteintech公司，兔抗鼠MLKL單克隆抗體(貨號(hào)A13451)購自武漢愛博泰克(ABclonal)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，培養(yǎng)步驟：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)90 %時(shí)，吸去培養(yǎng)液，加入胰酶消化2 min，1 000 r·min離心5 min；離心結(jié)束后，吸去上清，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行傳代，于37 ℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 BCG培養(yǎng)及感染

牛分枝桿菌疫苗株卡介苗(BCG)購自上海生物制品研究所；培養(yǎng)步驟：采用Middlebrook 7H9培養(yǎng)基對(duì)BCG進(jìn)行培養(yǎng)，隨后BCG培養(yǎng)斜面上挑取菌落，接種于培養(yǎng)液中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待BCG 培養(yǎng)至合適濃度(OD=1.5)后進(jìn)行傳代操作。利用不同感染復(fù)數(shù)(multiple of infection, MOI)的BCG，感染RAW264.7細(xì)胞，建立結(jié)核分枝桿菌與小鼠巨噬細(xì)胞系互作模型，其中，MOI=10表示細(xì)胞與細(xì)菌之比為1∶10。

1.4 LncRNA NR_003508小干擾RNA和miR-483-3p過表達(dá)的構(gòu)建

根據(jù)LncRNA NR_003508序列設(shè)計(jì)合成小干擾RNA，序列：Sense 5′-ACACUGCUAGAAAU-AAAUUTT-3′，Antisense 5′-AAUUUAUUUCUAGCAGUGUGC-3′，并設(shè)計(jì)合成Negative control (NC)，序列：Sense 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，Antisense 5′-ACGUGACACG-UUCGGAGAATT-3′。根據(jù)miR-483-3p序列：5′-UCACUCCUCCCCUCCCGUCUU-3′，設(shè)計(jì)合成mimics: Sense 5′-UCACUCCUCCCCUCCCGUCUU-3′，Antisense 5′-GACGGGAGGGGAGGAGU-GAUU-3′。小干擾RNA和mimics購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

取生長至對(duì)數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞以1×10個(gè)·孔接種到六孔培養(yǎng)板中；貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，分別構(gòu)建陰性對(duì)照組(NC)、BCG感染組(BCG)、siRNA-NR_003508組和siRNA-NR_003508結(jié)合 BCG 感染組；轉(zhuǎn)染按照ZETA試劑說明書進(jìn)行，每孔加入轉(zhuǎn)染試劑7～10 μL，20 μmol·LsiRNA或mimics 3～5 μL，24 h后觀察熒光強(qiáng)度以確定轉(zhuǎn)染比例。過表達(dá)miR-483-3p的構(gòu)建分組：陰性對(duì)照組(NC)、BCG感染組(BCG)、miR-483-3p mimics組和miR-483-3p mimics結(jié)合BCG感染組。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因的構(gòu)建和檢測(cè)

應(yīng)用RegRNA 2.0 (http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/detection.html)、TargetScan (http://www.targetscan.org)和miRBase (http://www.mirbase.org/search.shtml)3個(gè)數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測(cè)LncRNA NR_003508與miR-483-3p的結(jié)合靶點(diǎn)。利用pmirGLO質(zhì)粒(Promega, Madison, WI, USA) 將LncRNA NR_003508包括預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的序列(5′-GCUGAAUGAGGGAGAGGAGUGG-3′)克隆到pmirGLO-LncRNA NR_003508-WT，同時(shí)構(gòu)建靶位點(diǎn)突變(5′-GCUGAAUGAGGGACUCCUCACG-3′)序列的pmirGLO-LncRNA NR_003508-MUT報(bào)告質(zhì)粒，將兩種重組質(zhì)粒分別與miR-483-3p mimics和陰性對(duì)照(mimics NC)共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，24 h后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行分析，酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的反應(yīng)強(qiáng)度并計(jì)算兩者比值來反映細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性。

1.7 Western blot檢測(cè)

取生長狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞以1×10個(gè)·孔接種于6孔板培養(yǎng)皿中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理后，按全蛋白提取試劑盒提取蛋白，并用BCA法試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)需要測(cè)定的蛋白大小調(diào)整分離膠的濃度，將各組蛋白按30 μg定量上樣并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品從膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，加入MLKL(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶2 000稀釋)蛋白抗體，4 ℃過夜孵育，TBST洗滌6 min×5次，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌6 min×5次，使用化學(xué)發(fā)光液(ECL發(fā)光)檢測(cè)蛋白條帶并通過GE化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行曝光。結(jié)果用ImageJ軟件分析各組條帶的灰度值。

1.8 免疫熒光檢測(cè)

提前將20 mm蓋玻片置入12孔板中，每孔接種 5×10個(gè)細(xì)胞，貼壁后按照試驗(yàn)組設(shè)計(jì)處理細(xì)胞。制片步驟：用 4%固定液固定20 min，加入0.5% TritonX-100室溫通透30 min，3% BSA室溫封閉1 h后，37 ℃孵育一抗(用3%BSA 按照1∶200比例稀釋MLKL抗體)2 h，37 ℃孵育二抗(用PBS稀釋)，最后用含有DAPI的封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察MLKL的熒光表達(dá)并拍照。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

使用TRlzol試劑(Thermo Fisher Scientific，Inc)提取各處理組的總RNA，微量分光光度計(jì)檢驗(yàn)RNA質(zhì)量。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific)將RNA合成cDNA。通過使用QuantStudio5 System實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)和SYBR&Green Reagents (TaKaRa Bio)進(jìn)行qRT-PCR。各樣本中LncRNA NR_003508和的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量以-為內(nèi)參，miR-483-3p以U6為內(nèi)參：以2-ΔΔ計(jì)算LncRNA NR_003508、miR-483-3p和MLKL表達(dá)的相對(duì)定量。具體引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq (2×) 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol·L)各0.8 μL，Rox Reference Dye Ⅱ(50×) 0.4 μL，Nuclease-free water 6 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：①預(yù)變性95 ℃ 30 s；②95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s、40個(gè)循環(huán)，運(yùn)行程序。

表1 引物名稱和序列Table 1 Name and sequence of the primers

1.10 PI檢測(cè)細(xì)胞壞死率

取生長狀態(tài)良好RAW264.7細(xì)胞以1×10個(gè)接種于6孔板，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理后，用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞壞死率。除試驗(yàn)組還需設(shè)計(jì)3個(gè)對(duì)照組，分別為不染組、Annexin V-FITC單染和PI單染，將各組細(xì)胞消化后用預(yù)冷的PBS洗滌1遍，1 000 r·min離心5 min，棄上清，加入500 μL 1×Binding buffer重懸細(xì)胞，各處理組分別加入Annexin V-FITC和 PI染色液各5 μL，輕輕混勻，室溫，避光染色20 min。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)或熒光顯微鏡觀察，細(xì)胞壞死率為PI陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 BCG感染對(duì)LncRNA NR_003508的影響

為了了解BCG感染對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)LncRNA NR_003508的影響，本研究通過qRT-PCR檢測(cè) BCG感染后LncRNA NR_003508的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所示，相比于空白對(duì)照組，BCG感染顯著上調(diào)LncRNA NR_003508的表達(dá)(<0.01)，并且呈時(shí)間依賴性表達(dá)。結(jié)果表明,BCG可以誘導(dǎo)LncRNA NR_003508的高表達(dá)。

A、B. qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LncRNA NR_003508的表達(dá)。*.P<0.05，**.P<0.01A, B. qRT-PCR was used to detect the expression level of LncRNA NR_003508. *.P<0.05，**.P<0.01圖1 BCG感染對(duì)LncRNA NR_003508的影響Fig.1 The effect of BCG infection on LncRNA NR_003508

2.2 干擾LncRNA NR_003508降低MLKL的表達(dá)

為了研究LncRNA NR_003508在BCG感染巨噬細(xì)胞過程中的作用，本研究設(shè)計(jì)并合成LncRNA NR_003508的小干擾RNA，從而檢測(cè)干擾LncRNA NR_003508對(duì)BCG感染的巨噬細(xì)胞RAW264.7壞死的影響。利用Western blot檢測(cè)了各處理組中MLKL的表達(dá)情況，結(jié)果(圖2A)表明BCG感染后，細(xì)胞中MLKL蛋白水平顯著增加(<0.01)，而干擾LncRNA NR_003508后，細(xì)胞中MLKL蛋白水平顯著下降(<0.01)。同時(shí)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)結(jié)果(圖2B)顯示，干擾LncRNA NR_003508顯著減弱了BCG感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)MLKL熒光(綠色)強(qiáng)度。結(jié)果提示干擾LncRNA NR_003508降低了BCG感染的巨噬細(xì)胞 RAW264.7內(nèi)MLKL的表達(dá)。

A. Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MLKL的表達(dá)；B.免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MLKL的表達(dá)，MLKL為綠色，DAPI為藍(lán)色(400×)。**. P<0.01A. The expression of MLKL were detected by Western blot. The results were analyzed by Image J; B. Immunofluorescence was used to detect the expression level of MLKL, Green dots represent MLKL protein and blue dots represent nucleus (400×). **. P<0.01圖2 干擾LncRNA NR_003508降低MLKL 的表達(dá)Fig.2 Interference with LncRNA NR_003508 reduces the expression of MLKL

2.3 干擾LncRNA NR_003508抑制BCG感染的細(xì)胞壞死

為了進(jìn)一步研究干擾LncRNA NR_003508在BCG感染后巨噬細(xì)胞壞死的影響。本研究利用碘化丙啶熒光染料(PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，用熒光顯微鏡觀察各處理組的細(xì)胞壞死情況，結(jié)果表明，BCG感染后RAW264.7細(xì)胞壞死率與空白對(duì)照組相比顯著上升(<0.01)，但是干擾LncRNA NR_003508結(jié)合BCG感染處理組與BCG組相比細(xì)胞壞死率顯著下降(<0.05)，見圖3。上述結(jié)果表明，干擾LncRNA NR_003508抑制了BCG感染的巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死，阻止了BCG的進(jìn)一步擴(kuò)散。

A. PI檢測(cè)細(xì)胞壞死，PI為紅色，Hoechst為藍(lán)色(100×)；B. PI陽性細(xì)胞率。*.P<0.05, **.P<0.01A. PI was used to detect cell necrosis, Red dots represent PI and blue dots represent Hoechst (100×); B. PI positive cells rates. *.P<0.05, **.P<0.01圖3 干擾LncRNA NR_003508抑制BCG感染的細(xì)胞壞死Fig.3 Interfering with LncRNA NR_003508 inhibits necrosis of BCG-infected cells

2.4 LncRNA NR_003508在巨噬細(xì)胞中起ceRNA作用海綿吸附miR-483-3p

本研究利用生物信息學(xué)軟件RegRNA 2.0預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LncRNA NR_003508與miR-483-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4A。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果(圖4B)顯示，相比于NC組，miR-483-3p mimic轉(zhuǎn)染能顯著下調(diào)野生型LncRNA NR_003508-WT質(zhì)粒組的熒光素酶活性(<0.01)，提示LncRNA NR_003508與miR-483-3p之間存在相互作用關(guān)系。為進(jìn)一步驗(yàn)證兩者關(guān)系，通過qRT-PCR對(duì)BCG感染后巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-483-3p的含量進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果(圖4C)表明miR-483-3p的含量顯著下降(<0.05)。隨之，干擾LncRNA NR_003508后miR-483-3p的表達(dá)顯著增加(<0.01) (圖4D)。上述結(jié)果表明，在BCG感染巨噬細(xì)胞過程中，LncRNA NR_003508通過與miR-483-3p特異性結(jié)合而發(fā)揮海綿吸附作用。

A. LncRNA NR_003508與miR-483-3p的結(jié)合位點(diǎn)；B. 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證LncRNA NR_003508與miR-483-3p的結(jié)合位點(diǎn)；C. qRT-PCR檢測(cè)BCG感染對(duì)miR-483-3p表達(dá)的影響；D. qRT-PCR檢測(cè)干擾LncRNA NR_003508對(duì)miR-483-3p的影響。*.P<0.05, **.P<0.01A. The binding site of LncRNA NR_003508 and miR-483-3p; B. Verification of the binding site of LncRNA NR_003508 to miR-483-3p by dual luciferase reporter system; C. qRT-PCR detection of the effect of BCG infection on the expression of miR-483-3p；D. qRT-PCR detection the influence of interference LncRNA NR_003508 on miR-483-3p. *.P<0.05, **.P<0.01圖4 LncRNA NR_003508在巨噬細(xì)胞中起ceRNA作用海綿吸附miR-483-3pFig.4 LncRNA NR_003508 functions as a ceRNA and sponges miR-483-3p in macrophages

2.5 miR-483-3p負(fù)調(diào)控MLKL的表達(dá)

通過生物信息學(xué)軟件TargetScan發(fā)現(xiàn)，miR-483-3p靶向壞死關(guān)鍵基因MLKL(圖5A)，為了解miR-483-3p對(duì)MLKL的靶向調(diào)控作用，本研究合成miR-483-3p mimics并轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，通過qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖5B、C)表明過表達(dá)miR-483-3p后，顯著抑制細(xì)胞中MLKL的mRNA水平(<0.01)。為進(jìn)一步研究miR-483-3p對(duì)MLKL的靶向調(diào)控作用，Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖5D)顯示，過表達(dá)miR-483-3p顯著降低了BCG感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)MLKL的蛋白水平(<0.01)。以上結(jié)果表明，miR-483-3p負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞中MLKL的表達(dá)水平。

A. LncRNA NR_003508與miR-483-3p的結(jié)合位點(diǎn)；B. qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-483-3p的含量；C. qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)miR-483-3p對(duì)MLKL mRNA水平的影響；D. Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MLKL的表達(dá)。*.P<0.05, **.P<0.01A. The binding site of miR-483-3p and MLKL; B. qRT-PCR was used to detect the expression level of miR-483-3p; C. qRT-PCR detects the effect of overexpression of miR-483-3p on the level of MLKL mRNA; D. The expression of MLKL were detected by Western blot. The results were analyzed by Image J. *.P<0.05, **.P<0.01圖5 miR-483-3p負(fù)調(diào)控MLKL的表達(dá)Fig.5 miR-483-3p negatively regulates the expression of MLKL

2.6 過表達(dá)miR-483-3p抑制BCG感染的細(xì)胞壞死

為了進(jìn)一步證明miR-483-3p調(diào)控BCG感染的細(xì)胞壞死，本研究采用Annexin V-FITC/PI染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行避光染色，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞壞死率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖6)顯示，與BCG單獨(dú)感染組相比，過表達(dá)miR-483-3p結(jié)合BCG感染處理組顯著降低了巨噬細(xì)胞壞死率(<0.01)。結(jié)果提示過表達(dá)miR-483-3p抑制了BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞壞死。

A. PI檢測(cè)細(xì)胞壞死率；B.細(xì)胞壞死率。*.P<0.05, **.P<0.01A. PI was used to detect cell necrosis rates; B. Necrosis rates. *.P<0.05, **.P<0.01圖6 過表達(dá)miR-483-3p抑制BCG感染的細(xì)胞壞死Fig.6 Overexpression of miR-483-3p inhibits BCG-infected cell necrosis

3 討 論

目前，結(jié)核病還是世界上非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，發(fā)病率不斷上升，在其發(fā)展到中晚期，可造成嚴(yán)重的組織損傷和壞死，直接威脅患者的生命健康。大量研究證實(shí)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌(Mtb)感染的影響，但其調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。巨噬細(xì)胞是宿主免疫防御的前哨，Mtb作為一種胞內(nèi)寄生菌，感染巨噬細(xì)胞后會(huì)觸發(fā)一系列信號(hào)事件，為了自身利益而劫持宿主的先天免疫途徑，影響細(xì)胞凋亡、自噬和壞死等過程，而壞死的發(fā)生有助于Mtb從巨噬細(xì)胞中逃逸，進(jìn)而擴(kuò)散感染。過表達(dá)的miRNA-1281靶向親環(huán)蛋白-D(CyPD)，保護(hù)人類巨噬細(xì)胞免受Mtb的侵害誘導(dǎo)程序性壞死和細(xì)胞凋亡。因此，壞死發(fā)生與否、病菌能否存活是眾多調(diào)控因子博弈的結(jié)果，其間機(jī)制繁復(fù)，迄今尚不完全明晰。

近年來，隨著對(duì)LncRNA的深入研究，其已是感染性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，并且其作為miRNA的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA(ceRNA)，抑制miRNA的表達(dá)來影響miRNA靶基因的調(diào)控，從而參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的自噬、凋亡、炎癥和壞死等生物學(xué)過程。此外，LncRNA與miRNAs參與了Mtb與其宿主之間復(fù)雜的相互作用，后者決定了感染過程。例如，miR-342-3p通過SOCS6增加炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)抗Mtb免疫。miR-483-3p廣泛參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。研究顯示，在胰腺癌和直腸癌中可檢測(cè)到miR-483-3p高表達(dá)，并且發(fā)揮促癌因子的作用。另外，miR-483-3p在重癥肺炎患兒血清中高表達(dá)，并且其通過靶向IGF-1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞損傷和炎癥因子過度釋放。本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA NR_003508與miR-483-3p之間存在結(jié)合位點(diǎn)，通過雙熒光素酶報(bào)告技術(shù)證實(shí)LncRNA NR_003508與miR-483-3p特異性結(jié)合。此外，BCG感染巨噬細(xì)胞后會(huì)上調(diào)LncRNA NR_003508的表達(dá)，而降低miR-483-3p的表達(dá)，并且敲低LncRNA NR_003508會(huì)促進(jìn)miR-483-3p的表達(dá)，表明兩者之間存在負(fù)相關(guān)性。因此，LncRNA NR_003508可以通過與miR-483-3p特異性結(jié)合而起到海綿吸附的作用。

MLKL已被證明參與結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。據(jù)報(bào)道，在強(qiáng)毒Mtb (H37Rv)感染巨噬細(xì)胞的過程中，敲減MLKL的表達(dá)顯著減少了H37Rv感染的巨噬細(xì)胞壞死。此外，本項(xiàng)目組前期工作已證實(shí)BCG可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞壞死的發(fā)生。在本研究中，利用生物信息學(xué)分析顯示是miR-483-3p的靶基因，并且BCG感染顯著上調(diào)MLKL的表達(dá)，而過表達(dá)miR-483-3p可降低MLKL的表達(dá)水平，結(jié)果表明，miR-483-3p可以調(diào)節(jié)MLKL的翻譯。同時(shí)，過表達(dá)miR-483-3p降低了BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死率。以上結(jié)果顯示，miR-483-3p可能通過調(diào)節(jié)MLKL的表達(dá)，從而影響B(tài)CG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞壞死。本研究以此嘗試從LncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解釋結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞壞死的作用機(jī)制，初步證實(shí)了LncRNA NR_003508在BCG感染巨噬細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞壞死的調(diào)控作用，研究結(jié)果將為Mtb致病機(jī)制的解讀提供新的視角與理論依據(jù)。接下來，本研究將對(duì)基因過表達(dá)、敲除試驗(yàn)以及動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證，以期深入探討LncRNA NR_003508和miR-483-3p在巨噬細(xì)胞壞死中的功能和作用機(jī)制。

4 結(jié) 論

BCG感染促進(jìn)了巨噬細(xì)胞內(nèi)LncRNA NR_003508的表達(dá)，并且誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞壞死。在BCG感染巨噬細(xì)胞過程中，LncRNA NR_003508通過海綿吸附miR-483-3p，從而調(diào)控MLKL的表達(dá)，最終促進(jìn)巨噬細(xì)胞壞死。