金寶霞，王偉杰，朱曉林，王 賢，魏小紅

(甘肅農業(yè)大學 生命科學技術學院，甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州， 730070)

番茄(Mill)為一年生草本植物，屬茄科(Solanacea)番茄屬，是一種重要的經(jīng)濟作物和轉基因模式植物。近年來，利用轉基因技術進行分子育種成為番茄種質資源創(chuàng)新的重要途徑，而番茄高效離體再生體系的建立是進行遺傳轉化的重要前提。植物離體培養(yǎng)主要經(jīng)過脫分化和再分化2個關鍵步驟，生長素和細胞分裂素是誘導外植體分化的關鍵因素，兩者配合使用能夠提高植株的再生率和轉化率。番茄離體再生試驗中關于外植體脫分化、再分化的研究大多集中于篩選外植體、優(yōu)化培養(yǎng)基激素類型和比例等應用方面。

近幾年來，在現(xiàn)代分子生物學研究的推動下，外植體脫分化、再分化的內在調控機制相繼在擬南芥、大豆、茶樹、蘋果等植物中被報道。擬南芥中已鑒定出多個與激素調控脫分化、再分化相關的基因，如LBD轉錄因子(16、17、18和29)、AP2/ERF轉錄因子(1、2、3和4)等調控脫分化過程發(fā)生。ART1轉錄因子、AP2/ERF轉錄因子(1、2、26和)和1基因等調控擬南芥再分化過程。LBD轉錄因子在生長素存在條件下誘導脫分化，生長素通過增強擬南芥bZIP家族成員AtbZIP59蛋白與LBD蛋白的互作，直接調控下游靶基因-的表達促進愈傷組織的形成。AP2/ERF是創(chuàng)傷響應通路的中心調控因子，1在創(chuàng)傷部位通過B類細胞分裂素響應子ARR1和ARR12信號通路促進細胞脫分化。1編碼AP2/EREBP結構域，在細胞分裂素存在條件下過表達1可大幅提高擬南芥根外植體的芽再生效率。26表達量在芽再生初期增加，將該基因敲除后芽的再生率降低，說明其可以促進擬南芥芽再生。1基因部分功能的缺失對擬南芥不定芽形成具有抑制作用，但對細胞分裂素和生長素沒有顯示相關作用。大豆芽誘導試驗中，RAV2-like轉錄因子同系物的表達也受到細胞分裂素的誘導，因此或許能夠通過細胞分裂素促進不定芽的再生。上述研究通過轉錄組分析發(fā)現(xiàn)大量差異表達基因與植物激素信號轉導通路密切相關，推測植物激素參與調控植物組織再生。

擬南芥作為保守模式植物，其脫分化與再分化關鍵調控基因對其他植物離體再生的分子機制研究具有重大指導意義。到目前為止，番茄中關于不同激素類型與濃度配比調控外植體脫分化、再分化分子機制的研究還未見報道。因此，本試驗以品質優(yōu)良的櫻桃番茄J6為材料，篩選番茄中與擬南芥同源的脫分化、再分化基因序列，使用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術分析不同激素組合處理下子葉和下胚軸2種外植體在脫分化、再分化過程中的基因表達量，同時結合脫分化率、再分化率對離體再生機制進行關聯(lián)分析，為櫻桃番茄離體再生體系的完善探索新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

櫻桃番茄材料J6由甘肅張掖益新泉蔬菜育種公司饋贈。

1.2 試劑與儀器

吲哚-3-乙酸(IAA，貨號B21810)、玉米素(ZT，貨號B25447)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA，貨號B24213)，所有激素純度均為分析標準品，HPLC≥98%，均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 無菌苗獲得與外植體切取

J6種子清水浸泡12 h后在超凈工作臺用75%乙醇浸泡30 s，然后用10% NaClO溶液消毒10 min，用無菌水沖洗3次后吸干水分，接種于MS基本培養(yǎng)基。取9 d苗齡無菌苗的子葉和下胚軸為外植體。子葉切取方法：剪去子葉尖端和基部，將子葉橫切為0.5 cm×0.5 cm的方塊，葉片正面向上接種于脫分化誘導培養(yǎng)基。下胚軸切取方法：將下胚軸剪成約0.5 cm長的莖段，接種于脫分化誘導培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：光周期為16 h光照/8 h黑暗，相對空氣濕度為60%左右，溫度為25.0 ℃，光照強度為2 000 lx，暗培養(yǎng)光照為0 lx。

1.3.2 脫分化與再分化基因的篩選與引物設計

查閱文獻確定擬南芥中的關鍵脫分化基因和再分化基因，然后分別在番茄基因組中進行同源比對找到相關轉錄因子；根據(jù)轉錄因子名稱在https：//www.arabidopsis.org/(擬南芥官網(wǎng))中查詢得到該轉錄因子蛋白序列；根據(jù)轉錄因子蛋白序列在https：//www.string-db.org/(蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫)中進行比對得到番茄中對應的同源基因名稱，并在番茄CDS數(shù)據(jù)庫進行比對，分別得到脫分化基因序列和再分化基因序列；將基因序列輸入NCBI—primer BLAST進行引物設計。基因注冊號與引物序列見表1。

表1 番茄脫分化與再分化基因引物信息

1.3.3 不同激素組合對外植體的培養(yǎng)

剪取子葉和下胚軸，分別在以下3種激素組合的MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。A組：2 mg·L6-BA+0/0.1/0.2/0.3 mg·LIAA(依次編號為A1、A2、A3、A4)；B組：2 mg·LZT+0/0.1/0.2/0.3 mg·LIAA(依次編號為B1、B2、B3、B4)；CK：不加任何激素。激素類型與濃度選擇參照文獻[2-6]。每個培養(yǎng)皿中接20個外植體，每個處理設置3個重復。以10 d為周期，觀察外植體誘導情況，計算第10天(脫分化前期)和第20天(脫分化后期)脫分化率，第60天的再分化率。每隔15 d進行繼代培養(yǎng)。

脫分化率(%)=產生愈傷組織外植體總數(shù)/接種的外植體數(shù)×100；

再分化率(%)=產生不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100。

1.3.4 RNA提取

采用AG RNAex Pro RNA提取試劑盒(艾科瑞生物公司)提取RNA。

1.3.5 cDNA合成

采用Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ(艾科瑞生物公司)的操作步驟進行cDNA合成。

1.3.6 qRT-PCR

采用2×SYBR Green qPCR Master Mix(None ROX)(武漢賽維爾生物科技有限公司)試劑盒進行qRT-PCR實驗。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013、SPSS 22軟件進行數(shù)據(jù)分析，基因相對表達量采用2-ΔΔC法計算。

2 結果與分析

2.1 不同激素組合對子葉、下胚軸脫分化的影響

J6外植體在脫分化第10天形成初期愈傷組織，第10天到第20天完成愈傷組織生長并為不定芽的發(fā)生做準備。由圖1可知，接種第10天，CK處理的子葉和下胚軸外植體沒有明顯變化(圖1-A、圖1-B)，其余處理的子葉外植體葉片顏色變淡，呈淺綠色，葉片邊緣切口輕微卷起并出現(xiàn)現(xiàn)白色愈傷組織團(圖1-C)；下胚軸呈透明淡綠色胚狀體，切口的一端或兩端出現(xiàn)膨大(圖1-D)。培養(yǎng)至第20天，CK處理的子葉和下胚軸依然無明顯變化，未分化出愈傷組織；B1處理的子葉愈傷組織呈黃綠色并零星出現(xiàn)綠色芽點(圖1-E)，其他處理的子葉愈傷組織膨大增厚，葉片卷曲更加明顯；下胚軸愈傷組織變粗，質地更為疏松，邊緣有白色小突起(圖1-F)。

A，CK處理10 d的子葉；B，CK處理10 d的下胚軸；C，A2處理10 d子葉；D，B1處理10 d下胚軸；E，B1處理20 d子葉；F，B1處理20 d下胚軸。A， The cotyledons of 10 days under CK treatment； B， The hypocotyls of 10 days under CK treatment； C， The cotyledons of 10 days under A2 treatment； D， The hypocotyls of 10 days under B1 treatment； E， The cotyledons of 20 days under B1 treatment； F， The hypocotyls of 20 days under B1 treatment.圖1 不同激素組合下子葉和下胚軸的脫分化情況Fig.1 Dedifferentiation of cotyledons and hypocotyls under different hormone combinations

采用不同激素組合對子葉和下胚軸進行脫分化誘導，結果(表2)表明，激素類型不影響子葉的脫分化率，培養(yǎng)至第10天，所有處理的子葉脫分化率已達到100%；在第10天，A組的下胚軸脫分化率優(yōu)于B組。A組合中，下胚軸在A2處理下脫分化率最高，為88.33%；B組合中，脫分化率在B2、B4處理下最高，均為65.00%。培養(yǎng)至第20天，下胚軸脫分化率增加不超過3.34百分點。

表2 不同激素組合對J6子葉、下胚軸脫分化率的影響

2.2 不同激素組合對子葉、下胚軸再分化的影響

由圖2可知，外植體培養(yǎng)至第60天，CK的部分下胚軸未通過愈傷組織的分化而直接長出嫩芽(并非不定芽)，并伴隨大量根的生長(圖2-A)；適宜激素組合處理的子葉愈傷組織生長為綠色球狀，表面組織較為松軟，長出的獨立不定芽數(shù)量更多更健壯，畸形芽數(shù)量少(圖2-B)；子葉和下胚軸未分化芽的外植體表面僵硬，底部與培養(yǎng)基接觸部分發(fā)生褐化，誘導再分化的效果較差(圖2-C、2-D)。通過比較再分化率和不定芽生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)子葉比下胚軸更適合誘導再分化。

A，CK處理60 d的下胚軸；B，B1處理60 d的子葉；C，B4處理60 d的子葉；D，A3處理60 d的下胚軸。A， The hypocotyls of 60 days under CK treatment； B， The cotyledons of 60 days under B1 treatment； C， The cotyledons of 60 days under B4 treatment； D， The hypocotyls of 60 days under A3 treatment.圖2 不同激素處理下子葉和下胚軸的再分化情況Fig.2 Redifferentiation of cotyledons and hypocotyls treated with different hormone combinations

采用不同激素組合對子葉和下胚軸進行再分化誘導，由表3可知，子葉在B組處理下的再分化率明顯優(yōu)于A組，并且2種組合處理下的再分化率隨IAA濃度升高而逐漸降低。A組中，子葉在A1處理下再分化率最高為22%；B組中，其再分化率在B1和B2處理下達到最高，分別為67.00%和58.00%，無顯著性差異。下胚軸在不同激素組合的再分化率顯著低于子葉，其再分化率在A3組合處理下最高，僅為15%。因此，選擇子葉作為外植體材料，在激素組合2.0 mg·LZT+0/0.1 mg·LIAA (B1和B2處理)處理的離體再生效果最好。

表3 不同激素組合對J6子葉、下胚軸再分化率的影響

2.3 子葉、下胚軸脫分化基因表達量

2.3.1 子葉脫分化基因表達量

將子葉作為外植體，第10天，脫分化基因Solyc09g066260.3.1、Solyc06g083930.2.1、Solyc01g091420.2.1、Solyc04g072900.1.1、Solyc12g056980.1.1和Solyc04g054910.3.1在A組的表達量較B組更高(圖3)。A組中，所有脫分化基因的表達量均顯著上調，表達量為CK的5.56～64.60倍；B組中，僅基因Solyc09g066260.3.1、Solyc06g083930.2.1和Solyc04g072900.1.1在B4處理下表達量上調，為CK的5.03～10.20倍。第20天(圖4)，B組處理的基因表達量較A組明顯上調。A組中，所有基因表達量僅在A4處理上調，為CK的7.48～35.20倍；B組中，基因Solyc06g083930.2.1、Solyc01g091420.2.1和Solyc04g072900.1.1在B2處理下高表達，分別為CK的12.12～44.05倍；基因Solyc09g066260.3.1、Solyc12g056980.1.1和Solyc04g054910.3.1在B3處理下表達量大幅上調，為CK的17.40～29.21倍。

編號1-6分別代表Solyc09g066260.3.1、Solyc06g083930.2.1、Solyc01g091420.2.1、Solyc04g072900.1.1、Solyc12g056980.1.1和Solyc04g054910.3.1。柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。1-6 represented Solyc09g066260.3.1， Solyc06g083930.2.1， Solyc01g091420.2.1， Solyc04g072900.1.1， Solyc12g056980.1.1 and Solyc04g054910.3.1， respectively. Data marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖3 不同激素組合第10天子葉愈傷組織中脫分化基因的相對表達量Fig.3 Relative expression level of dedifferentiated genes in callus of cotyledons treated with different hormone combinations at the 10th day

圖4 不同激素處理第20天子葉愈傷組織中脫分化基因的相對表達量Fig.4 Relative expression level of dedifferentiated genes in callus of cotyledons treated with different hormone combinations at the 20th day

將脫分化情況與相關基因表達量結合進行分析，脫分化第10天，子葉脫分化率在不同激素組合下無差異，均達到100%，脫分化基因在A組處理下的表達量均顯著上調；而在B組處理下，僅Solyc09g066260.3.1、Solyc06g083930.2.和Solyc04g072900.1.1基因在B4處理下表達上調。推測脫分化率與基因表達無明顯聯(lián)系，說明子葉在脫分化前期(第10天)可能不受到脫分化基因的調控。脫分化第20天，B組處理的子葉愈傷組織形態(tài)更利于不定芽分化與生長，脫分化基因Solyc01g091420.2.1、Solyc04g072900.1.1和Solyc04g054910.3.1的表達量在B1和B2組合下顯著上調，表明這3個脫分化基因對脫分化后期愈傷生長可能產生重要影響。

2.3.2 下胚軸脫分化基因表達量

以下胚軸為外植體，第10天，A組處理的脫分化基因Solyc09g066260.3.1、Solyc06g083930.2.1、Solyc01g091420.2.1、Solyc04g072900.1.1、Solyc-12g056980.1.1和Solyc04g054910.3.1表達量顯著上調(圖5)。Solyc09g066260.3.1、Solyc06g0-83930.2.1、Solyc01g091420.2.1、Solyc04g072900.1.1和Solyc12g056980.1.1隨IAA濃度升高呈先升高后下降的趨勢，其中，Solyc04g072900.1.1在A2處理下表達量最高，為CK的14.37倍；Solyc09g066260.3.1、Solyc06g083930.2.1、Solyc-01g091420.2.1和Solyc12g056980.1.1在A3處理下表達量達到最高，為CK的17.19～43.35倍；Solyc04g054910.3.1表達量在A4處理下最高，為CK組的25.23倍。B組處理下，僅Solyc09g066260.3.1、Solyc06g083930.2.1、Solyc-04g072900.1.1和Solyc04g054910.3.1在B2、B3處理下表達量上調，為CK的1.36～6.32倍。第20天，A組中Solyc09g066260.3.1、Solyc06g0839-30.2.1、Solyc01g091420.2.1、Solyc12g056980.1.1和Solyc04g054910.3.1分別在不同處理下表達量上調，為CK的1.06～5.29倍；B組中，6個脫分化基因表達量均在B2處理中上調，為CK的4.5～23.35倍；Solyc09g066260.3.1、Solyc06g08-3930.2.1和Solyc04g072900.1.1在B3處理中的表達量上調，為CK的2.03～6.55倍(圖6)。

圖5 不同激素處理第10天下胚軸愈傷組織中脫分化基因的相對表達量Fig.5 Relative expression level of dedifferentiated genes in callus of hypocotyls treated with different hormone combinations at the 10th day

圖6 不同激素處理第20天下胚軸愈傷組織中脫分化基因的相對表達量Fig.6 Relative expression level of dedifferentiated genes in callus of hypocotyls treated with different hormone combinations at the 20th day

結合脫分化情況與相關基因表達量分析可知，脫分化第10天，下胚軸在A組的脫分化率和脫分化基因表達量顯著高于B組，表明其在脫分化前期可能受到脫分化基因的正調控。脫分化第20天，下胚軸在不同激素組合下愈傷組織形態(tài)均無明顯差異，脫分化基因僅在B2處理下顯著上調。表明下胚軸愈傷組織形態(tài)與脫分化基因表達沒有關聯(lián)，激素對脫分化后期生長和脫分化基因表達沒有產生影響。

2.4 再分化基因表達量

2.4.1 子葉再分化基因表達量

子葉再分化第60天，A組處理下，再分化基因Solyc05g013540.1.1、Solyc03g082980.3.1、Solyc12g042210.2.1、Solyc02g022850.1.1、Solyc-08g066840.3.1和Solyc10g052510.2.1僅在A3處理中表達量上調，為CK的1.82～14.71倍，其余處理變化均不顯著；B組處理下，基因表達量均顯著上調，其中Solyc05g013540.1.1、Solyc03g082980.3.1、Solyc12g042210.2.1、Solyc08g066840.3.1和Solycv1-0g052510.2.1表達量隨IAA濃度升高呈先升高后下降的趨勢，在B2處理中達到最高，分別為CK的29.60、6.56、13.37、18.83和34.41倍；Solyc02g022850.1.1在B1處理中表達量最高，為CK的46.59倍(圖7)。

編號7-12分別代表Solyc05g013540.1.1、Solyc03g082980.3.1、Solyc12g042210.2.1、Solyc02g022850.1.1、Solyc08g066840.3.1和Solyc10g052510.2.1。下同。7-12 represented Solyc05g013540.1.1， Solyc03g082980.3.1， Solyc12g042210.2.1， Solyc02g022850.1.1， Solyc08g066840.3.1 and Solyc10g052510.2.1， respectively. The same as below.圖7 不同激素處理第60天子葉愈傷組織中再分化基因的相對表達量Fig.7 Relative expression level of redifferentiation genes in callus of cotyledons treated with different hormone combinations at the 60th day

將再分化率與再分化基因表達量結合分析發(fā)現(xiàn)，子葉在B組合中的再分化率和再分化基因表達量均顯著高于A組。其中，子葉在B1、B2處理中不定芽生長情況更佳，且基因Solyc05g013540.1.1、Solyc02g022850.1.1和Solyc10g052510.2.1表達量顯著上調，表明上述3個基因對子葉再分化可能具有重要作用。

2.4.2 下胚軸再分化基因表達量

由圖8可以看出，下胚軸再分化第60天，A組中再分化基因表達量較低；B組中基因表達量在B1、B2處理中顯著上調，其中B2處理的表達量最高，為CK的6.05～23.67倍。

圖8 不同激素處理第60天下胚軸愈傷組織再分化基因的相對表達量Fig.8 Relative expression level of redifferentiation genes in callus of hypocotyls treated with different hormone combinations at the 60th day

結合下胚軸再分化率與再分化基因表達量可知，再分化率在所有處理中均較低，再分化基因表達量只在B1、B2處理中上調，表明激素對下胚軸再分化過程和再分化基因的表達沒有影響。

3 結論與討論

細胞分裂素和生長素配合使用誘導分化的效果好于單個激素誘導，因此篩選外源激素的種類和比例是提高外植體分化效率的關鍵。本研究中，以番茄材料J6子葉為外植體，在ZT+IAA組合下誘導脫分化、再分化的效果顯著好于6-BA+IAA組合，其中，在低濃度IAA條件下，即含2.0 mg·LZT+0/0.1 mg·LIAA的MS培養(yǎng)基更適合番茄離體再生。劉煒煒等在對加工番茄子葉進行離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，不同激素組合對誘導形成愈傷組織形態(tài)和不定芽存在差異，而對其出愈率沒有影響，本研究結果與此一致。王全華等、陳麗萍等在番茄離體再生試驗中發(fā)現(xiàn)，ZT誘導產生不定芽的效果明顯優(yōu)于6-BA，在MS+2.0 mg·LZT+0.5 mg·LIAA和MS+2.0 mg·LZT+0.2 mg·LIAA處理下不定芽誘導率最高，本研究結果與此相似。謝雯琦等選用不同濃度的細胞分裂素6-BA和ZT分別與生長素IAA組合，對黃櫻桃-2號子葉進行愈傷組織和再生芽的誘導，發(fā)現(xiàn)MS+2.5 mg·L6-BA+0.2 mg·LIAA培養(yǎng)基效果最佳。說明不同番茄品種誘導外植體分化的最佳激素組合不盡一致。

在外植體離體再生過程中，大多數(shù)研究僅關注激素在脫分化、再分化階段發(fā)揮的功能，但很少有人研究相關基因表達的差異。近些年來，陸續(xù)有研究在擬南芥、大豆、茶樹等植物中分離鑒定了與脫分化、再分化相關的轉錄因子，并進行了功能驗證。對擬南芥脫分化、再分化階段差異表達基因進行功能分析發(fā)現(xiàn)，生長素和細胞分裂素的合成、代謝途徑的差異表達基因最為豐富。大豆基因同系物在不同植物之間具有功能保守性，并且在細胞分裂素存在下可以促進植物不定芽的再生。Fan等研究表明，16、17、18、29可以誘導不同器官、組織產生愈傷組織，這些基因的異位表達可以使外植體在沒有添加外源激素的情況下起始愈傷組織的形成。茶樹組織脫分化與再分化過程中5、18、29和18等與生長素、細胞分裂素相關基因的表迖量產生了顯著變化。不同濃度的生長素和細胞分裂素對組織培養(yǎng)中的激素調控通路是否有影響還尚不清楚。本研究對最適激素組合下離體再生過程與相關基因表達量結合分析發(fā)現(xiàn)，子葉脫分化后期愈傷組織形態(tài)生長可能受到脫分化基因Solyc01g091420.2.1、Solyc04g072900.1.1和Solyc04g054910.3.1的正向調控，推測這3個基因分別是番茄LBD轉錄因子家族和AP2/ERF轉錄因子家族中調控脫分化過程發(fā)生的重要成員；再分化過程可能受到再分化基因Solyc05g013540.1.1、Solyc02g022850.1.1和Solyc10g052510.2.1的正調控，上述3個基因分別與AP2/ERF轉錄因子、1基因和ART1轉錄因子為同源基因，推測它們是番茄中促進不定芽形成的重要基因。此外，下胚軸脫分化前期受到脫分化基因(Solyc09g066260.3.1、Solyc06g083930.2.1、Solyc01g091420.2.1、Solyc-04g072900.1.1、Solyc12g056980.1.1和Solyc04-g054910.3.1)的正調控；而脫分化后期生長情況和再分化效果較差，相關基因表達量也較低，推測激素對下胚軸離體再生過程和相關基因表達也有影響。有研究表明，不同植物之間、同種植物不同品種間，以及不同外植體間的脫分化、再分化能力差別較大，這些差異主要與植物基因型有關。因此，推測J6番茄下胚軸再分化效果差可能主要由內源基因決定，外源激素類型與濃度對調控再分化基因表達的影響較小。

本研究結果表明，番茄材料J6的子葉比下胚軸更適合離體再生培養(yǎng)，且誘導分化的最佳激素組合為2 mg·LZT+0/0.1 mg·LIAA。試驗所選的脫分化和再分化基因在不同外植體的脫分化時期、再分化時期均有不同程度的表達，推測脫分化和再分化同源基因在不同植物間具有功能保守性，為深入研究激素調控番茄脫分化、再分化發(fā)生的分子機制，以及建立更加高效的離體再生體系提供了理論依據(jù)。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)了與番茄離體再生可能密切相關的幾個脫分化和再分化基因，可在后續(xù)研究中通過這些基因的沉默或過表達試驗進一步證實它們對番茄離體再生的影響，同時也為離體再生的分子機制研究提供了新的思路。