氮素水平對(duì)潮土氨氧化微生物和硝化作用的影響

陳照明，王 強(qiáng)，*，李燕麗，張金萍，3，馮 江，劉 濤，俞巧鋼，馬軍偉

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021； 2.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434023； 3.浙江農(nóng)林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 311300)

硝化作用是土壤中重要的氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程之一，可以將銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮。硝化作用不僅會(huì)影響土壤氮素的生物有效性，同時(shí)還與農(nóng)業(yè)面源污染、溫室氣體排放相關(guān)聯(lián)。例如，硝態(tài)氮在土壤中具有較高的移動(dòng)性，易通過(guò)淋溶而造成損失，還會(huì)污染地下水。氨氧化是硝化作用的第一步，也是其限速步驟。氨氧化作用主要由氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)參與完成。此外，新近發(fā)現(xiàn)的全程氨氧化微生物可同時(shí)執(zhí)行氨氧化與亞硝酸鹽氧化過(guò)程，也是土壤硝化作用的重要參與者。研究表明，多種因素能夠影響土壤硝化作用，如土壤pH、濕度、溫度、土壤類型和施肥管理等。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與氮肥

供試土壤采自江蘇省泰州市姜堰區(qū)(32°31′N(xiāo)，120°9′E)，土壤類型為潮土。采樣地屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年均降水量991.7 mm，年平均氣溫14.5 ℃。于水稻收獲后，采集0～20 cm的耕層土壤，挑去作物殘?jiān)褪瘔K后，放置于室內(nèi)自然風(fēng)干，過(guò)2 mm的篩，備用。經(jīng)測(cè)定，耕層土壤的基本理化性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)含量22.60 g·kg，全氮含量1.64 g·kg，有效磷含量16.63 mg·kg，速效鉀含量85.40 mg·kg，pH值8.57。

供試氮肥分別為尿素(N含量46.7%)和硫酸銨(N含量21.2%)，均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)置與樣品采集

1.3 土壤pH值和無(wú)機(jī)氮含量測(cè)定

采用pHSJ-6L型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測(cè)定土壤pH值(浸提液的水土體積質(zhì)量比為2.5∶1)。

1.4 土壤總DNA提取和定量PCR

稱取0.5 g(干重)土樣，用FastDNA SPIN kit for DNA試劑盒(MP Biomedicals，美國(guó))，按照說(shuō)明書(shū)上的方法提取土壤總DNA，用NanoDrop One微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國(guó))測(cè)定提取得到的總DNA的濃度和純度。將提取的土壤總DNA保存在-20 ℃冰箱里，備用。

采用CFX96 Optical Real-Time Detection System(Bio-Rad Laboratories，美國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)。用于氨氧化細(xì)菌qRT-PCR的引物分別為amoA-1F(GCGGGTTTCTACTGGTGGT)和amoA-2R(CCCCTTCGGGAAAGCCTTCTTC)，用于氨氧化古菌qPCR的引物分別為crenamoA23f(ATGGTCTGGCTWAGACG)和crenamoA616r(GCCATCCATCTGTATGTCCA)。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL SYBR Premix Ex(Takara Biotechnology，日本)，各0.3 μL的正向和反向引物，1 μL的模板，8.4 μL滅菌水。陰性對(duì)照以滅菌水作為模板。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤pH的動(dòng)態(tài)變化

添加氮肥顯著(<0.05)降低了土壤pH值，且土壤pH值隨氮素水平的升高而降低(圖1)。但對(duì)于N0處理，培養(yǎng)過(guò)程中，土壤pH值基本保持穩(wěn)定(8.50～8.54)。

圖1 不同尿素(a)或硫酸銨(b)濃度下土壤pH值的變化Fig.1 Dynamic of soil pH under addition of different amounts of urea (a) or ammonium sulfate (b)

尿素施入土壤后，土壤pH值下降，其中N150、N300和N600處理的土壤pH值在第7天就已經(jīng)降到最低值，7 d以后，這3個(gè)處理的土壤pH值趨于穩(wěn)定；然而，N1200處理的土壤pH值隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)降低。

硫酸銨施入土壤后，土壤pH值快速下降，且隨氮素水平的升高而降低。除N1200處理外，其余施氮處理的土壤pH值均在第7天時(shí)達(dá)到最小值，之后基本保持平穩(wěn)；而N1200處理在第14天時(shí)土壤pH值才降到最低值。

至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，無(wú)論是施用尿素還是硫酸銨，不同氮水平處理的土壤pH值均表現(xiàn)為N0>N150>N300>N600>N1200。

2.2 土壤和含量的動(dòng)態(tài)變化

圖2 尿素(a， c)或硫酸銨(b， d)處理下土壤和含量(c， d)的變化Fig.2 Dynamics of contents (c， d) in soils under urea (a， c) or ammonium sulfate (b， d) treatments

2.3 氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌amoA基因拷貝數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

在培養(yǎng)過(guò)程中，N0處理的AOA基因拷貝數(shù)從4.32×10g增加到6.71×10g(圖3)。與N0處理相比，添加尿素或者硫酸銨并沒(méi)有顯著促進(jìn)氨氧化古菌的數(shù)量增長(zhǎng)，尿素處理的AOA基因拷貝數(shù)為3.07×10～6.35×10g；而硫酸銨處理的AOA基因拷貝數(shù)為4.17×10～7.18×10g(圖3)。

圖3 尿素(a、c)或硫酸銨(b、d)處理下土壤氨氧化古菌(a、b)和氨氧化細(xì)菌(c、d)amoA基因拷貝數(shù)的變化Fig.3 Dynamics of amoA gene copies of ammonia oxidizing archaea (AOA) (a， b) and ammonia oxidizing bacteria (AOB) (c， d) in soils under urea (a， c) or ammonium sulfate (b， d) treatments

在培養(yǎng)過(guò)程中，N0處理的AOB基因拷貝數(shù)變化不大(5.07×10～6.60×10g)。但是，施用氮肥促進(jìn)了AOB數(shù)量的增長(zhǎng)。添加尿素培養(yǎng)7、14、28 d后，AOB基因的拷貝數(shù)分別比培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)增加了3.5～20.1、2.03～15.2、2.93～17.0倍。添加硫酸銨后，N150、N300、N600、N1200處理的AOB基因拷貝數(shù)從初始的5.07×10分別增加到11.2×10、25.1×10、38.6×10、88.6×10g?？偟膩?lái)看，無(wú)論是添加尿素還是硫酸銨，在同一時(shí)間點(diǎn)，AOB基因拷貝數(shù)均隨著氮水平的升高而增加，但相同氮水平下尿素處理的要高于硫酸銨處理。

2.4 土壤含量與AOB和AOA amoA基因拷貝數(shù)的相關(guān)關(guān)系

圖4 尿素(a、b)或硫酸銨(c、d)處理下土壤含量與氨氧化古菌(a、c)和氨氧化細(xì)菌(b、d)amoA基因拷貝數(shù)的相關(guān)關(guān)系Fig.4 Relationship of soil content with amoA gene copies of ammonia oxidizing archaea (AOA) (a， c) and ammonia oxidizing bacteria (AOB) (b， d) in soils under urea (a， b) or ammonium sulfate (c， d) treatments

2.5 土壤平均凈硝化速率

與N0處理(凈硝化速率1.61 mg·kg·d，以N計(jì)，下同)相比，施用尿素或硫酸銨均可顯著(<0.05)增加土壤凈硝化速率(圖5)。添加尿素后，N150、N300、N600和N1200處理的平均凈硝化速率分別為6.49、10.30、19.65、39.28 mg·kg·d，分別是N0處理的4.0、6.4、12.2和24.4倍。添加硫酸銨后，N150～N1200處理的平均凈硝化速率分別為5.39、8.28、15.54、29.31 mg·kg·d，分別是N0處理的3.3、5.1、9.6和18.2倍。

柱上無(wú)相同字母的表示同一肥料下不同處理間差異顯著(P<0.05)。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P <0.05 under addition of either urea or ammonium sulfate.圖5 不同尿素或硫酸銨濃度對(duì)潮土平均凈硝化速率的影響Fig.5 Effects of different amounts of urea or ammonium sulfate on average net nitrification rate of fluvo-aquic soil

3 討論

本研究表明，不管是施用尿素還是硫酸銨，均是AOB而不是AOA在潮土硝化作用中起主導(dǎo)作用。AOB基因拷貝數(shù)和平均凈硝化速率均隨氮素水平提高而增加，且高氮(1 200 mg·kg)對(duì)潮土的硝化作用沒(méi)有顯著抑制作用。施用尿素較硫酸銨可通過(guò)提高AOB豐度，從而提高潮土的平均凈硝化速率。今后，還需進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)氮肥集中施用下氮素?fù)p失相關(guān)機(jī)理的研究，以期提出更加集約高效的農(nóng)田氮素管理方式。