基于生物信息學(xué)分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃連解毒湯干預(yù)動脈粥樣硬化斑塊破裂的作用機制①

李曉輝 彭廣操 李興淵 王建茹（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為一種慢性進(jìn)行性血管疾病，其發(fā)生發(fā)展涉及內(nèi)皮功能障礙、炎癥損傷、脂質(zhì)浸潤和纖維帽破裂等多種病理因素。歷經(jīng)幾十年的緩慢發(fā)展，動脈斑塊可能會突然繼發(fā)血栓，或斑塊出血，常表現(xiàn)為急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）。而導(dǎo)致ACS的罪魁禍?zhǔn)资遣环€(wěn)定斑塊破裂。2004年共識聲明中首先提出了導(dǎo)致ACS的血栓斑塊為“斑塊破裂”，并指出其是一種具有嚴(yán)重?fù)p傷的斑塊，在纖維帽中具有真正的缺陷或間隙，將富含脂質(zhì)的動脈粥樣化核心與流動的血液分離，從而暴露出斑塊的血栓形成核心［1］。研究發(fā)現(xiàn)，全球1 847例致命性動脈血栓中有73%存在斑塊破裂［2］。目前導(dǎo)致斑塊破裂的機制尚不明確，以斑塊破裂為導(dǎo)向的治療效果欠佳，所以識別不穩(wěn)定斑塊破裂的靶基因及機制，對于防治斑塊破裂、形成血栓，預(yù)防急性心血管事件的發(fā)生具有重要意義。

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多途徑和多效應(yīng)的特點，在治療復(fù)雜性疾病方面表現(xiàn)出療效確切、毒副作用小的優(yōu)勢，但其作用機制研究是一直以來的重點和難點。黃連解毒湯（Huanglian Jiedu Decoction，HLJDD）出自《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味藥物組成。本方苦寒直折，具有清熱解毒之功。研究證實，HLJDD聯(lián)合常規(guī)西藥能明顯改善急性心肌梗死介入術(shù)后患者心絞痛癥狀，顯著降低超敏肌鈣蛋白Ⅰ（hypersensitivity troponinⅠ，hs-TnⅠ）、N末端B型腦鈉鈦前體（N-terminal Bbrain natriuretic peptide，NT-proBNP）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）、血小板聚集功能測定、血清磷脂酶A2及冠脈校正TIMI幀數(shù)水平，抑制巨噬細(xì)胞極化，有效減少心肌損傷改善心肌功能，且安全性較好［3-4］；還可顯著改善ACS患者PCI術(shù)后內(nèi)皮功能（VEGF、NO），降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立［5］。提示HLJDD可延緩或抑制斑塊破裂，但其作用機制不明顯，限制了其在臨床的應(yīng)用與發(fā)展。

近年來，利用生物信息學(xué)方法對芯片基因表達(dá)數(shù)據(jù)和高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種疾病的研究。穩(wěn)健排序整合（robust rank aggregation，RRA）方法可用于各種排序基因列表的比較，可有效避免在篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的過程中因樣本數(shù)有限、技術(shù)平臺差異等因素對研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚的情況［6-7］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于目標(biāo)分子、生物功能和生物活性化合物產(chǎn)生復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，符合中藥復(fù)方的天然特征，不僅能夠從分子水平上系統(tǒng)地闡明中藥復(fù)方的作用機制；還可以對中藥復(fù)方做出整體性預(yù)判和前瞻性預(yù)測，以彌補分子生物學(xué)的局限性［8］。目前已有諸多學(xué)者成功地將其應(yīng)用于闡釋中藥復(fù)方治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機制的研究中?；谝陨系恼J(rèn)識，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法探索具有解毒功效的HLJDD延緩或抑制AS由穩(wěn)定斑塊到破裂過程的作用機制，以期為后續(xù)的研究提供一定參考；同時，以方測證，以證驗因，在一定程度上可闡述AS中醫(yī)“毒損脈絡(luò)”“毒致易損斑塊”的科學(xué)內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)的來源從GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和ArrayExpress數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）中下載含有人頸AS穩(wěn)定和破裂斑塊組織相關(guān)的數(shù)據(jù)集，詳見表1。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理和DEGs的篩選 以E-MTAB-2055和GSE41571為基因芯片數(shù)據(jù)集，利用perl腳本對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，將探針矩陣轉(zhuǎn)化為基因矩陣；然后，利用avereps函數(shù)對基因?qū)?yīng)多個探針取均值，利用normalizeBetweenArrays函數(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正，若基因表達(dá)數(shù)值較大，則需取log2；最后，利用limma包篩選DEGs。GSE120521為轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，利用avereps函數(shù)對重復(fù)基因名取均值后，利用wilcoxTest篩選DEGs。以|log（fold change，F(xiàn)C）|＞1和P＜0.05為閾值對3個數(shù)據(jù)集的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析。

表1 數(shù)據(jù)集的詳細(xì)信息Tab.1 Details of data set

1.3 RRA法整合分析芯片數(shù)據(jù)利用穩(wěn)健排序整合RRA包對3個數(shù)據(jù)集中的DEGs進(jìn)行整合，以|log2FC|＞1和P＜0.05為條件篩選穩(wěn)健DEGs，然后利用pheatmap包繪制P值Top 20的上調(diào)和下調(diào)基因的熱圖。

1.4 HLJDD相關(guān)活性成分及作用靶點的篩選在TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中，輸入HLJDD中4味中藥名稱，即黃連、黃柏、黃芩、梔子，搜索得到各藥化學(xué)成分，通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug likeness，DL）≥0.18對4味中藥所含的所有化合物進(jìn)行篩選，獲取其活性成分；同時，在該數(shù)據(jù)庫中獲取相應(yīng)活性成分的作用靶點。在PubChem數(shù)據(jù)庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取HLJDD的活性成分的Canonical SMILES結(jié)構(gòu)；然后，在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch/）中對HLJDD活性成分的作用靶點進(jìn)行預(yù)測，并剔除Probability=0的靶點。整合所有活性成分的作用靶點，即為HLJDD的作用靶點。

1.5 HLJDD-AS交集DEGs的獲取及HLJDD調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將1.3中的穩(wěn)健DEGs與1.4中的HLJDD作用靶點取交集，并繪制韋恩圖，這些交集靶點即為HLJDD延緩或抑制AS斑塊破裂的DEGs；然后，用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建中藥-成分-靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.6 功能富集分析為了探究穩(wěn)健DEGs和HLJDD-AS交集DEGs可能的功能作用，利用cluster-Profiler和enrichplot包對其進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并利用ggplot2和GOplot包進(jìn)行可視化。

1.7 交集DEGs的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析將HLJDD-AS交集DEGs上傳至STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），互作得分設(shè)置為最高置信度≥0.400，進(jìn)行PPI分析，并用Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化。

1.8 Hub基因的篩選和Module分析利用MCODE插件 以 默認(rèn)參數(shù)（degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100，k-score=2）為標(biāo)準(zhǔn)對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行Module分析，篩選最重要的子模塊。Hub基因由CytoHubba插件中的MCC、DMNC、EPC、Degree、MNC算法排序前10的基因的重疊基因組成。

1.9 分子對接 將Hub基因與其所對應(yīng)HLJDD的活性成分進(jìn)行分子對接。首先，從PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb/）中檢索人源核心靶點的PDB ID號，用PyMOL去除水分子、配體等，Auto dock Tools加氫，然后轉(zhuǎn)換成pdbqt格式。其次，從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載活性成分的分子結(jié)構(gòu)，用ChemBio3D軟件進(jìn)行優(yōu)化。最后，利用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對接，獲取結(jié)合能值，對接結(jié)果采用Discovery Studio Visualizer 4.5軟件進(jìn)行可視化。結(jié)合能數(shù)值為負(fù)則提示活性成分與Hub基因可自由結(jié)合，數(shù)值越小說明對接體系越穩(wěn)定，對接結(jié)果越可靠，本研究設(shè)定小于-5 kcal/mol的結(jié)合能代表結(jié)合具有顯著性，以此佐證活性成分與核心靶點之間作用關(guān)系的可信度。

2 結(jié)果

2.1 各數(shù)據(jù)集DEGs的篩選差異分析的結(jié)果顯示，E-MTAB-2055篩選出1 152個DEGs，其中上調(diào)572個，下調(diào)580個；GSE41571篩選出558個DEGs，其 中 上調(diào)126個，下調(diào)432個；GSE120521篩 選 出1 974個DEGs，其中上調(diào)1 152個，下調(diào)822個。圖1為3個數(shù)據(jù)集的火山圖和熱圖。

2.2 穩(wěn)健DEGs的篩選及其富集分析RRA方法對3數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析后，共篩選出864個穩(wěn)健DEGs，其中上調(diào)453個，下調(diào)411個。圖2A為前20個上調(diào)和下調(diào)穩(wěn)健DEGs的熱圖。GO分析結(jié)果顯示，依據(jù)P＜0.05確定了793個GO條目；生物學(xué)過程（biological process，BP）條目為620條，主要涉及中性粒細(xì)胞的脫顆粒、活化、遷移、趨化作用、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、白細(xì)胞遷移等；分子功能（molecular function，MF）條目為64條，主要涉及膠原結(jié)合區(qū)、受體配體活性、趨化因子的活性等；細(xì)胞組分條目（cellular component，CC）為109條，主要涉及含細(xì)胞外基質(zhì)的膠原、溶酶體腔、三級顆粒膜等（圖2B）。KEGG分析結(jié)果顯示，依據(jù)P＜0.05共映射出56條信號通路，包括吞噬體、溶酶體、細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、PPAR信號通路、細(xì)胞黏附分子等（圖2C）。

2.3 HLJDD活性成分及其作用靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以O(shè)B≥30%、DL≥18%為條件進(jìn)行篩選，黃芩獲得36個活性成分，黃連為14個，黃柏為37個，梔子為15個，合并去重后為84個（表2）。將HLJDD的84個活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點預(yù)測，剔除重復(fù)項后共獲得928個。

2.4 HLJDD-AS交集DEGs的獲取及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將RRA方法鑒定出的864個穩(wěn)健DEGs，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測的HLJDD的928個作用靶點取交集，結(jié)果共有42個交集DEGs，其中上調(diào)32個，下調(diào)10個（圖3）；即HLJDD通過抑制32個上調(diào)DEGs表達(dá)，促進(jìn)10個下調(diào)DEGs表達(dá)，延緩或抑制AS由穩(wěn)定斑塊向破裂斑塊進(jìn)展（圖4、表3）。

圖1 各數(shù)據(jù)集的火山圖和熱圖Fig.1 Volcano maps and heat maps of each data set

圖2 穩(wěn)健DEGs及其富集分析Fig.2 Robust DEGs and its enrichment analysis

表2 HLJDD“中藥-活性成分-預(yù)測靶點”基本信息Tab.2 Basic information of HLJDD'Traditional Chinese Medicine-Active Ingredients-Predictive Target'

圖3 HLJDD作用靶點與穩(wěn)健DEGs交集基因的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of intersection genes between targets of HLJDD and robust DEGs

2.5 交集DEGs的功能富集分析GO分析結(jié)果顯示，依據(jù)P＜0.05確定了392個GO條目，主要涉及膠原蛋白的分解代謝、組織重構(gòu)、中性粒細(xì)胞的脫顆粒、活化、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)分解等（圖5A）。KEGG分析結(jié)果顯示，依據(jù)P＜0.05共映射出25條信號通路，主要包括溶酶體、鈣信號通路、PPAR信號通路、補體與凝血級聯(lián)反應(yīng)等（圖5B）。

2.6 交集DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、Hub基因的篩選和Module分析將交集DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PPI分析后，再用Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。如圖6A所示，該網(wǎng)絡(luò)包括35個節(jié)點、1 058條邊。通過MCC、DMNC、EPC、Degree、MNC算法，共篩選出7個Hub基因，模塊分析共篩選出2個子模塊，其中大部分Hub基因在模塊1中（圖6B～D）。

2.7 分子對接結(jié)果為了驗證HLJDD調(diào)控交集DEGs的可能性，本研究將Hub基因與其所對應(yīng)的活性成分進(jìn)行了分子對接。結(jié)果表明，提取出來的36對“活性成分-作用靶點”關(guān)系對中，HLJDD活性成分與7個Hub基因均存在不同程度的結(jié)合，結(jié)合自由能均小于-5 kcal/mol，提示兩者之間具有良好的親和力，結(jié)果具有一定的可信度（表4）?，F(xiàn)將結(jié)合能小于-10對接結(jié)果進(jìn)行可視化展示，見圖7。

圖4 HLJDD干預(yù)AS的“中藥-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of'Traditional Chinese Medicine-Ingredients-Target-Disease'of HLJDD Intervening AS

圖5 交集DEGs的功能富集分析Fig.5 Functional enrichment analysis of intersection DEGs

圖6 交集DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、Hub基因的篩選和Module分析Fig.6 PPI network construction，Hub gene screening and Module analysis of intersection DEGs

表3 HLJDD調(diào)控交集DEGs在AS進(jìn)展中的作用Tab.3 Role of HLJDD in regulating and intersecting DEGs in progress of AS

表4 HLJDD活性成分與作用靶點分子對接的結(jié)果Tab.4 Results of docking of active components of HLJDD with target molecules

圖7 對接結(jié)果模擬圖Fig.7 Simulation diagram of docking result

3 討論

AS是多種心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)。所以AS的發(fā)生發(fā)展機制一直是研究熱點，尤其斑塊破裂的發(fā)生機制。隨著基因芯片和高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，對于斑塊破裂的作用及機制的相關(guān)研究日漸深入。鑒于動脈斑塊由穩(wěn)定到破裂的發(fā)生機制的復(fù)雜性，篩選出與斑塊破裂相關(guān)的有價值的差異基因?qū)τ谧R別診斷、治療及預(yù)后尤為必要。

本研究通過RRA法整合3個數(shù)據(jù)集后，共篩選出864個穩(wěn)健DEGs，其中上調(diào)453個，下調(diào)411個。這些穩(wěn)健DEGs主要通過補體和凝血級聯(lián)信號通路、鐵死亡、IL-17信號通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、溶酶體途徑、PPAR信號通路、抗原處理和呈遞、TGF-β信號通路等參與斑塊破裂的病程變化。與斑塊破裂相關(guān)的重要穩(wěn)健DEGs中，目前有研究證實補體C1q子成分A（C1QA）、補體C1q子成分B（C1QB）等作為補體系統(tǒng)的一部分，當(dāng)補體C1q水平的顯著降低時可能是導(dǎo)致AS斑塊不穩(wěn)定或破裂的一個促成因素［9］，但其通過與ApoE形成復(fù)合物可以減輕無法解決的炎癥［10］；血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HMOX1）與纖維帽較薄和血栓形成破裂斑塊有關(guān)［11］；基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平與斑塊穩(wěn)定程度及斑塊纖維帽厚度呈負(fù)相關(guān)［12］，其中基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）通過炎癥反應(yīng)在介導(dǎo)斑塊破裂中發(fā)揮重要作用［13］；纖維帽中G蛋白信號通路調(diào)節(jié)蛋白5（G protein signaling pathway 5，RGS5）的缺失促進(jìn)了斑塊破裂的進(jìn)程［14］；脂肪細(xì)胞增強結(jié)合蛋白1（adipocyte enhancer binding protein 1，AEBP1）是一種新型巨噬細(xì)胞促炎介質(zhì)，可以通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤加速AS病程變化［15］。與斑塊破裂相關(guān)的信號通路中，研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡是一種主要由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，抑制鐵死亡能夠減輕內(nèi)皮細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化和內(nèi)皮功能障礙，減輕AS程度［16］；脂質(zhì)過氧化和鐵沉積是晚期AS斑塊的共同特征，故推測鐵死亡參與了斑塊不穩(wěn)定的發(fā)展進(jìn)程。IL-17是由T細(xì)胞或一個獨特的輔助性T細(xì)胞亞群產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可通過增加血管平滑肌細(xì)胞的凋亡水平，促進(jìn)易損斑塊的破裂［17］；過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）是核受體超家族的成員，作為配體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)通過AMPK-PPARα通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化參與了AS斑塊穩(wěn)定性調(diào)節(jié)［18］；TANG等［19］研究發(fā)現(xiàn)通過加劇TGF-β/ROCK1調(diào)節(jié)的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)展，亦可以導(dǎo)致頸動脈斑塊的脆弱性。此外，有報道指出在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和Ⅰ型糖尿病患者中，AS負(fù)擔(dān)和斑塊破裂的脆弱性增加［20-21］。總之，以上相關(guān)文獻(xiàn)的報道從側(cè)面證實了本研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)從微觀層面可以闡釋出斑塊破裂的發(fā)生機制與重要相關(guān)基因，而傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)有別于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的精準(zhǔn)分子致病理論。AS屬于發(fā)生在脈管上的病變，因于“毒邪最易腐筋傷脈”，與AS斑塊破潰、出血及大量炎癥因子浸潤等病理變化有關(guān)，故現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為斑塊破裂的致病因素乃是中醫(yī)“毒”邪［22］。既有“毒者，邪氣蘊結(jié)不解之謂”；又有“其久心痛者，是心之支別絡(luò)脈，為風(fēng)邪冷熱所乘痛也，故成疹不死，發(fā)作有時，經(jīng)久不瘥也?！笨芍拘坝袃?nèi)毒與外毒之分，而現(xiàn)代醫(yī)家偏向于AS的發(fā)生與內(nèi)毒緊密相關(guān)。內(nèi)毒主要因臟腑功能失衡，氣血紊亂，使得機體內(nèi)代謝產(chǎn)物不能及時重新利用或排出，累積日久，敗壞形體而化生。如陳可冀院士根據(jù)中醫(yī)關(guān)于瘀、毒致病特點，具有廣泛性、頑固性、趨內(nèi)性、趨本性、兼夾性等，類似于AS易損斑塊炎性反應(yīng)及血栓的形成，提出“瘀毒致易損斑塊”的觀點［23-24］。王永炎院士根據(jù)“毒損絡(luò)脈”的理論學(xué)說及病程進(jìn)展，將病絡(luò)分為絡(luò)弛、絡(luò)結(jié)、絡(luò)破三種狀態(tài)，其中絡(luò)破即為斑塊破裂，指絡(luò)壁受損，脈中血液溢出的病理狀態(tài)［25-26］。此外，蘇文全等［27］已提出了相似學(xué)說“脈郁毒損”，即脈郁生毒、毒損脈絡(luò)，指出毒損是AS病程中發(fā)展變化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同醫(yī)家根據(jù)AS的病機演變提出了瘀毒、痰毒、熱毒學(xué)說，而熱毒是促進(jìn)斑塊破裂的病機基礎(chǔ)［28］。故有學(xué)者倡導(dǎo)在動脈斑塊破裂之際應(yīng)加重清熱解毒通脈之品［29］。

將HLJDD與穩(wěn)健DEGs取交集靶點，發(fā)現(xiàn)HLJDD通過抑制32個上調(diào)DEGs的表達(dá)，促進(jìn)10個下調(diào)DEGs的表達(dá)，延緩或抑制AS由穩(wěn)定斑塊向破裂斑塊的進(jìn)展。經(jīng)GO富集及KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)HLJDD可通過調(diào)節(jié)膠原代謝、組織重構(gòu)、免疫反應(yīng)、血液循環(huán)調(diào)節(jié)等，參與鈣信號通路、細(xì)胞凋亡、流體剪應(yīng)力與AS、PPAR信號通路及Apelin信號通路等信號途徑。目前研究證實抑制KCa3.1通道可以有效延緩動脈斑塊破裂的進(jìn)展［30］；Apelin-APJ信號參與調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎斑塊穩(wěn)定性介質(zhì)水平的改變［20］。此外，研究發(fā)現(xiàn)與無斑塊破裂動脈相比，有斑塊破裂的動脈組織中存在高壁剪切應(yīng)力（wall shear stress，WSS），其導(dǎo)致斑塊破裂的機制可能與誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞行為的特異性改變及加劇炎癥和刺激AS脂質(zhì)核心有關(guān)［31-32］。這些不僅補充了HLJDD對斑塊破裂的治療靶點，還展示出其以多環(huán)節(jié)、多途徑方式參與斑塊破裂的調(diào)節(jié)作用，同時以方測證，以證驗因，上述靶點和功能富集結(jié)果可能是AS中醫(yī)“毒損脈絡(luò)”“毒致易損斑塊”的科學(xué)內(nèi)涵，為進(jìn)一步中醫(yī)學(xué)從毒論治AS提供了客觀依據(jù)。

經(jīng)Hub基因的篩選分析，推測HLJDD主要通過下調(diào)基因MMP8、CTSD、SPP1、PLAU、CTSB、CTSS、CTSL，發(fā)揮抑制或緩解斑塊破裂病理過程。其中基質(zhì)金屬蛋白酶8（matrix metalloproteinase 8，MMP8）不僅參與膠原降解，提高斑塊易損指數(shù)，還被鑒定為防止斑塊破裂的良好靶標(biāo)［33-34］。CTSD、CTSB、CTSS、CTSL屬于組織蛋白酶，通過凝血、免疫反應(yīng)、補體激活、脂肪生成、凋亡等一系列途徑，對改善AS進(jìn)展或斑塊破裂發(fā)揮至關(guān)重要的作用［35-36］。重組人分泌型磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）又稱骨橋蛋白，是一種分泌型多功能糖蛋白，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，參與礦物質(zhì)沉積和斑塊鈣化生物過程，研究發(fā)現(xiàn)SPP1在破裂斑塊中的表達(dá)比穩(wěn)定斑塊中更為顯著［37］。尿激酶-纖溶酶原激活物（urokinase-plasminogen activator，PLAU），亦稱為uPA，是一種絲氨酸蛋白水解酶，通過調(diào)控巨噬細(xì)胞浸潤參與AS斑塊破裂［38］。目前研究證實HLJDD通過降解膠原纖維、改善血液流變學(xué)紊亂、促進(jìn)膽固醇流出及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥浸潤等延 緩AS進(jìn) 程［39-42］。基 于Hub基 因 的 篩 選 可 知，HLJDD不僅可以通過下調(diào)這些關(guān)鍵靶點改善斑塊破裂病理變化，還進(jìn)一步深化了HLJDD穩(wěn)定斑塊及延緩斑塊破裂的分子機制。

通過分子對接技術(shù)進(jìn)一步預(yù)測Hub基因與其所對應(yīng)的活性成分的結(jié)合關(guān)系，結(jié)果顯示36對“活性成分-靶點蛋白”關(guān)系對的結(jié)合自由能均小于-5.0 kcal/mol，這提示HLJDD活性成分與斑塊破裂的潛在靶點之間具有良好的結(jié)合力；其中kihadanin A、蕓香堿（rutaecarpine）、（R）-氫化小檗堿［（R）-Canadine］、（S）-氫化小檗堿［（S）-Canadine］、棕櫚酸酯A（Palmidin A）與其對應(yīng)靶點蛋白CTSB、CTSS、CTSL、MMP8的結(jié)合自由能均小于-10 kcal/mol，表現(xiàn)出最強的結(jié)合能力，具有進(jìn)一步深入開發(fā)研究的價值。

本研究運用生物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)了在AS由穩(wěn)定斑塊發(fā)展至破裂斑塊過程中的一些DEGs以及HLJDD發(fā)揮延緩或抑制功效的作用機制，但仍有一些局限性。本文雖運用RRA法分析了多個數(shù)據(jù)集，但由于數(shù)據(jù)庫中可獲得的數(shù)據(jù)集有限，同時每個數(shù)據(jù)集中滿足研究條件的樣本較少，最終導(dǎo)致本研究納入的樣本量有限；生信預(yù)測的結(jié)果雖進(jìn)行了分子對接實驗的驗證，但其結(jié)果仍需要進(jìn)一步在后續(xù)的研 究 中 進(jìn) 行 佐 證。總 之，MMP8、CTSD、SPP1、PLAU、CTSB、CTSS、CTSL在AS破裂斑塊中發(fā)揮著重要作用，HLJDD可通過抑制其表達(dá)來延緩或抑制AS由穩(wěn)定斑塊發(fā)展至破裂斑塊，研究結(jié)果可為進(jìn)一步探討AS破裂斑塊的分子機制以及HLJDD干預(yù)其進(jìn)展提供新的思路和切入點，并為中醫(yī)從毒論治AS易損斑塊提供一定的科學(xué)依據(jù)。