李 辰 張?zhí)熹h 聞 愚 王云龍 包武陽

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院普外1科，南陽 473058）

結(jié)腸癌（colon cancer，CC）是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和致死率極高，早期不易被發(fā)現(xiàn)，晚期無特效治療藥物，嚴(yán)重威脅人類生命健康［1］。神經(jīng)纖毛蛋白1（neuropilin-1，NRP1）是血管內(nèi)皮生長因子家族成員的共同受體，對腫瘤血管新生、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移性傳播具有重要作用。研究表明，NRP1在肺癌、胰腺癌、CC等多種癌癥中高表達(dá)［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是由一段長度為20～24個(gè)堿基組成的內(nèi)源性非編碼小RNA，可與靶向基因的3"UTR區(qū)域配對結(jié)合，抑制目標(biāo)mRNA和蛋白表達(dá)，參與靶向基因表達(dá)的調(diào)控［3］。研究表明，miRNA具有多種生物學(xué)功能，在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)［4-5］。miR-212是miRNA中的一員，定位于人17號(hào)染色體，在肺癌細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用［6-7］。但miR-212在CC中的研究鮮見報(bào)道，因此，本文通過RT-PCR檢測miR-212在SW480細(xì)胞中的表達(dá)水平，利用生物信息學(xué)手段預(yù)測miR-212的靶基因NRP1，并以熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，檢測miR-212對NRP1表達(dá)水平的影響，初步闡明miR-212調(diào)控CC SW480腫瘤干細(xì)胞樣特性和免疫應(yīng)答的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人CC細(xì)胞SW480購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清（FBS）、胰酶和RPMI1640培養(yǎng)基購自美 國Gibco公 司；miR-212-5p、miR-NC、pcDNANRP1購自美國Ambion公司；Trizol試劑和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量PCR熒光染料Sybergreen購自TaKaRa生物有限公司；熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；一抗、二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無菌離心管，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種至細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后換液，細(xì)胞融合度達(dá)到85%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取生長至對數(shù)期的SW480細(xì)胞，加入胰酶消化，待消化完全后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)基接種至培養(yǎng)板，37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度在60%～70%時(shí)，將miR-NC（miR-NC組）、miR-212-5p（miR-212-5p組）、pcDNA-NRP1（NRP1組）、miR-212-5p+pcDNA-NRP1（miR-212-5p+NRP1組）與不完全培養(yǎng)基混合后加入SW480細(xì)胞，接種至24孔板表面，37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，RT-PCR檢測miR-212-5p和NRP1 mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測NRP1蛋白表達(dá)水平。

1.2.3 熒光素酶實(shí)驗(yàn)TargetScan靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-212-5p可能的靶基因，結(jié)果顯示，NRP1可能是其下游靶基因。提示NRP1 mRNA的3"UTR位點(diǎn)2 092～2 099是miR-212-5p的結(jié)合位點(diǎn)，體外合成該位點(diǎn)DNA片段，克隆至雙熒光素啟動(dòng)子載體Luc-NRP1 3"UTR wt和Luc-NRP1 3"UTR mut。將hsa-miR-212-5p與Luc-NRP1 3"UTR wt和Luc-NRP1 3"UTR mut共同轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性。

1.2.4 流式分選收集貼壁培養(yǎng)的SW480細(xì)胞，PBS洗2～3次，100μl流式細(xì)胞分選技術(shù)緩沖液重懸，設(shè)立miR-NC組（miR-NC組）、miR-212-5p組（miR-212-5p組）、pcDNA-NRP1組（NRP1組）、miR-212-5p+pcDNA-NRP1組（miR-212-5p+NRP1組），對照組加入CD44-PE和CD44-FTTC單陽性對照，陰性對照組加入相應(yīng)抗體，實(shí)驗(yàn)組加入CD44-PE和CD44-FTTC，于4℃下避光孵育，每隔10 min混懸1次細(xì)胞，0.5 h后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 Western blot使用胰酶消化細(xì)胞，采用RIPA蛋白裂解液于冰上提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗（SOX2、LGR5），4℃孵育搖床過夜?；厥找豢?，加入按比例稀釋的HRP標(biāo)記的對應(yīng)二抗，室溫孵育120 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光法于暗室下曝光顯影（GAPDH作內(nèi)參）。將膠片進(jìn)行掃描存檔，Photoshop整理去色，Alpha軟件分享光密度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 ELISA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞于4℃、1 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定TNF-α、IL-6、IL-4含量。

1.2.7 RT-PCR將細(xì)胞樣品用液氮研磨成粉末，Trizol法提取總RNA，檢測RNA濃度和純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃10 s，60℃5 s循環(huán)40次。各引物序列：hsa-miR-212-5p正向引物5"-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3"，反向引物5"-ACCTTGGCTCTAGACTGCTTACT-3"；pc-DNA-NRP1正向引物5"-CCCCAAACCACTGATAACTCG-3"，反向引物5"-AGACACCATACCCAACATTCC-3"；GAPDH正 向引物5"-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3"，反向引物5"-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3"；U6正向引物5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，反向引物5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。以目的基因和GAPDH或U6比值表示mRNA或miRNA表達(dá)水平，采用ΔΔCt法分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料表示為±s。多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-212-5p抑制NRP1表達(dá)與空白對照組（Control組）相比，陰性對照組（miR-NC組）miR-212-5p和NRP1表達(dá)水平無明顯差異，轉(zhuǎn)染miR-212-5p可顯著上調(diào)SW480細(xì)胞中miR-212-5p水平，下調(diào)NRP1 mRNA水平（P＜0.05），見圖1。提示miR-212-5p抑制SW480細(xì)胞NRP1表達(dá)。

2.2 miR-212-5p靶向基因NRP1的驗(yàn)證生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測miR-212-5p靶向NRP1基因，熒光素酶實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖2A所示，has-miR-212-5p可與基因NRP1 3"URT區(qū)結(jié)合。miR-212-5p抑制野生型Luc-NRP1 3"UTR熒光素酶活性，而當(dāng)靶點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，miR-212-5p不具有抑制作用（圖2B）。提示NRP1是miR-212-5p的靶向基因。

圖1 miR-212-5p對SW480細(xì) 胞miR-212-5p和NRP1 mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effects of miR-212-5p on expressions of miR-212-5p and NRP1 mRNA in SW480 cells

圖2 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-212-5p靶向NRP1基因Fig.2 Luciferase experiment verifies miR-212-5p targeting NRP1 gene

2.3 miR-212-5p對NRP1表達(dá)的影響 與Control組相比，轉(zhuǎn)染miR-212-5p后，SW480細(xì)胞中miR-212-5p水平明顯升高，NRP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與NRP1組相比，聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-212-5p和pcDNA-NRP1后，miR-212-5p水平明顯升高（P＜0.05），NRP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見圖3。結(jié)果再次說明miR-212-5p可抑制NRP1的表達(dá)。

2.4 miR-212-5p調(diào)節(jié)SW480腫瘤干細(xì)胞樣特性流式細(xì)胞術(shù)篩選干細(xì)胞陽性標(biāo)記（CD44），結(jié)果顯示，與Control組相比，miR-212-5p顯著下調(diào)CD44+陽性比例（P＜0.05），NRP1上調(diào)CD44+比例（P＜0.05）；與NRP1組相比，轉(zhuǎn)染miR-212-5p+NRP1后，CD44+明顯被抑制（P＜0.05），見圖4A。Western blot檢測干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2和LGR5蛋白表達(dá)，與Control組相比，SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-212-5p后，SOX2和LGR5蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與NRP1組相比，聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-212-5p+NRP1后，SOX2和LGR5蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖4B。提示miR-212-5p通過靶向NRP1調(diào)節(jié)SW480腫瘤干細(xì)胞樣特性。

2.5 miR-212-5p調(diào)節(jié)SW480細(xì)胞免疫應(yīng)答與Control組相比，轉(zhuǎn)染miR-212-5p可顯著上調(diào)促炎因子IL-6和TNF-α表達(dá)（P＜0.05），下調(diào)抗炎因子IL-4表達(dá)（P＜0.05）。與NRP1組相比，聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-212-5p和NRP1后，IL-6和TNF-α表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），IL-4表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見圖5。結(jié)果說明miR-212-5p通過靶向NRP1調(diào)節(jié)SW480細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

圖3 miR-212-5p對NRP1表達(dá)的影響Fig.3 Effect of miR-212-5p on expression of NRP1

圖4 miR-212-5p調(diào)節(jié)SW480腫瘤干細(xì)胞樣特性Fig.4 miR-212-5p regulates tumor stem cell-like properties of SW480

圖5 SW480腫瘤干細(xì)胞中免疫調(diào)節(jié)因子表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of immunoregulatory factors in SW480 tumor stem cells

3 討論

CC的發(fā)生發(fā)展依賴于癌基因與抑癌基因等多種因素的共同作用，其機(jī)制復(fù)雜多變［8］。因此，探尋CC的發(fā)病機(jī)制和關(guān)鍵調(diào)控因子對其臨床上的診斷和治療具有重要意義。miRNA通過與靶基因的mRNA結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-212在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，miR-212通過靶向SOX4 mRNA的3"UTR區(qū)抑制結(jié)直腸癌遷移、侵襲和EMT過程，miR-212通過靶向TBX15抑制透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的惡性行為，miR-212通過靶向c-Met促成垂體腺瘤細(xì)胞異常增殖和侵襲等［10-14］。NRP1在多種腫瘤細(xì)胞功能和腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中發(fā)揮作用，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要促進(jìn)因子［15］。NRP1作為NRP家族成員，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮組織，與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）相互作用調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和干細(xì)胞增殖過程［16-17］。

本研究通過TargetScan靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-212的靶基因，并檢測miR-212對NRP1表達(dá)的影響，探究miR-212是否通過靶向調(diào)控NRP1的表達(dá)在CC中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NRP1是miR-212的靶基因，轉(zhuǎn)染miR-212可顯著抑制NRP1 mRNA和蛋白表達(dá)。提示miR-212可能通過靶向抑制NRP1的表達(dá)在CC中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤惡化的標(biāo)志性細(xì)胞，具有無限增殖和自我更新的能力，在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖過程中發(fā)揮重要作用。SOX2是維持胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞樣特性的轉(zhuǎn)錄因子，研究表明，SOX2可能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3和caspase-9表達(dá)維持腫瘤干細(xì)胞干性［18］。LGR5是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，具有自我更新和多向分化潛能，通過參與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用［19］。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)分選干細(xì)胞陽性標(biāo)記CD44陽性比例，免疫印跡檢測SOX2和LGR5蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-212后，CD44+比例、SOX2和LGR5蛋白表達(dá)明顯減少，同時(shí)，因NRP1上調(diào)的SOX2和LGR5蛋白表達(dá)也被miR-212抑制。提示miR-212通過靶向調(diào)控NRP1表達(dá)調(diào)節(jié)SW480腫瘤干細(xì)胞樣特性。

炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答是腫瘤惡化程度的重要指標(biāo)，炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞和免疫抑制因子會(huì)破壞免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定，使機(jī)體正常細(xì)胞免疫系統(tǒng)紊亂并最終走向死亡［20］。IL-6、TNF-α、IL-4是細(xì)胞炎癥和免疫反應(yīng)的重要調(diào)控因子，研究表明，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程中，IL-6和TNF-α表達(dá)量增加可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)［21］。本研究檢測腫瘤細(xì) 胞 上清液中IL-6、TNF-α、IL-4蛋白含 量和mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-212可顯著上調(diào)IL-6和TNF-α表達(dá)，下調(diào)IL-4 mRNA和蛋白表達(dá)，聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-212和NRP1可明顯抑制NRP1對腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答的保護(hù)作用。提示miR-212通過靶向抑制NRP1的表達(dá)調(diào)節(jié)SW480細(xì)胞免疫應(yīng)答，并進(jìn)一步誘導(dǎo)CC細(xì)胞死亡。

綜上所述，miR-212可能通過靶向抑制NRP1表達(dá)，調(diào)節(jié)SW480腫瘤干細(xì)胞樣特性和免疫應(yīng)答。本研究從細(xì)胞水平初步探究miR-212在SW480腫瘤干細(xì)胞樣特性和免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究組計(jì)劃構(gòu)建移植瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步探討miR-212在體內(nèi)的作用。