孫 鍇，武曉宇，聶子涵，樊 攀，劉志平

（東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040）

丁酸梭菌（）是芽孢桿菌科梭菌屬的革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2013年發(fā)布的2045號(hào)公告《飼料添加劑品種名錄（2013）》中將丁酸梭菌列為可用作微生物添加劑的菌種。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌不僅能分泌丁酸等有機(jī)酸，自身還具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、提高動(dòng)物體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、增強(qiáng)機(jī)體免疫和抗氧化功能等效果；在提高禽畜生產(chǎn)性能、提高動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)和動(dòng)物機(jī)體健康水平等方面有積極作用；且因丁酸梭菌對(duì)外界環(huán)境具有較好的抵抗力，比乳酸菌更能適應(yīng)飼糧加工儲(chǔ)存環(huán)境。丁酸梭菌作為一種應(yīng)用潛力較高的益生菌，具有良好的開(kāi)發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值。

近年來(lái)，研究人員已經(jīng)就丁酸梭菌在生產(chǎn)實(shí)踐中的作用機(jī)制和應(yīng)用效果展開(kāi)了多項(xiàng)研究，但在實(shí)際生產(chǎn)中的具體效果結(jié)論不一，試驗(yàn)對(duì)象的選擇也不夠全面。本研究以貉為對(duì)象，通過(guò)飼喂添加丁酸梭菌的無(wú)抗日糧，研究其對(duì)貉生長(zhǎng)性能、血液指標(biāo)和抗氧化能力的影響，并探討其中的機(jī)制，為丁酸梭菌作為飼料添加劑在禽畜生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

生長(zhǎng)期烏蘇里貉30只，公母各半，日齡（110日齡左右）、體重［（5.88±0.70）kg］相近，健康狀況良好，由哈爾濱市永勝毛皮養(yǎng)殖基地提供。

1.2 主要試劑

丁酸梭菌制劑，活菌數(shù)≥5.0×10CFU／g，大澤農(nóng)生物科技有限公司提供。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（CHO）測(cè)定試劑盒，均購(gòu)于北京中生北控生物科技有限公司；血清丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

2020年9月13日—11月12日（60 d），試驗(yàn)在哈爾濱市永勝毛皮養(yǎng)殖基地進(jìn)行。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，將30只烏蘇里貉隨機(jī)分為3組，每組10只，對(duì)照組飼喂不添加益生菌、抗生素等制劑的基礎(chǔ)日糧，1，2組分別在基礎(chǔ)日糧中添加1.25×10CFU／kg和2.50×10CFU／kg丁酸梭菌。基礎(chǔ)日糧采用某廠貉用生長(zhǎng)期配合干料和冬毛期配合干料，營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。貉均飼養(yǎng)于同一實(shí)驗(yàn)棟舍，單只籠養(yǎng)給料，以減少飼養(yǎng)環(huán)境差異。每天07：00和16：00喂料2次。每天記錄貉的健康狀況，記錄貉死淘狀況。貉自由采食、飲水，按照常規(guī)飼養(yǎng)管理和免疫程序進(jìn)行飼養(yǎng)和免疫。

表1 基礎(chǔ)日糧的營(yíng)養(yǎng)成分Tab.1 Nutritional composition of basic diet %

1.4 測(cè)定項(xiàng)目

1.4.1 體重 試驗(yàn)第1，15，30，45，60天晨飼前用地秤測(cè)定每只貉體重，根據(jù)第1，30，60天的體重?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算試驗(yàn)1～30 d、31～60 d和試驗(yàn)全期總增重、平均日增重。

1.4.2 腹瀉率 每天觀察貉糞便狀況，記錄是否腹瀉，糞便評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：糞便呈條形或顆粒狀，1分；糞便較軟、能成型，2分；拉稀、糞便不成型，3分。3分記為腹瀉。腹瀉率計(jì)算公式：腹瀉率（%）＝（腹瀉貉數(shù)×腹瀉天數(shù)）／（試驗(yàn)貉數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)）×100%。

1.4.3 血清生化指標(biāo)、抗氧化指標(biāo) 在第60天飼喂后，用一次性靜脈采血針和真空采血管在每只貉后肢外側(cè)跗關(guān)節(jié)上方采血2 mL，室溫靜置，待析出血清后，用離心機(jī)3 000 r／min離心10 min，取上層血清，-20℃冷凍保存，待測(cè)血清生化指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)。采用日立3100全自動(dòng)生化分析儀通過(guò)比色法測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、三酰甘油、總膽固醇含量，具體操作方法參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定血清丙二醛含量，采用微量酶標(biāo)法測(cè)定還原型谷胱甘肽活性，采用ABTS法測(cè)定總抗氧化能力，具體操作方法參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行初步處理，用SPSS21.0軟件中的One-Way ANOVA過(guò)程進(jìn)行單因素變量分析，數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）形式表示，＜0.01表示差異極顯著，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對(duì)貉生長(zhǎng)性能和糞便狀況的影響

丁酸梭菌對(duì)試驗(yàn)期貉的增重均有顯著影響，1，2組貉1～60 d平均日增重極顯著高于對(duì)照組（＜0.01），其中2組增重效果最佳；1，2組貉的糞便狀況也有了顯著改善（＜0.05）；1，2組腹瀉率比對(duì)照組分別降低20.00%和31.09%。見(jiàn)表2。

表2 貉生長(zhǎng)性能和糞便狀況及腹瀉率測(cè)定結(jié)果Tab.2 Growth performance，fecal condition and diarrhea rate of raccoon dog

2.2 丁酸梭菌對(duì)貉血清生化指標(biāo)的影響

1，2組貉血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著低于對(duì)照組（＜0.01），1，2組之間差異不顯著（＞0.05）；1，2組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、總膽固醇含量、三酰甘油含量均與對(duì)照組差異不顯著（＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 貉血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of serum biochemical indexes of raccoon dogs

2.3 丁酸梭菌對(duì)貉血清抗氧化指標(biāo)的影響

1，2組貉血清中丙二醛、還原性谷胱甘肽含量和總抗氧化能力均與對(duì)照組差異不顯著（＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 貉血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination results of serum antioxidant indexes of raccoon dogs

3 討論

3.1 丁酸梭菌對(duì)貉生長(zhǎng)性能的影響

丁酸梭菌能夠改善腸道菌群，也能加強(qiáng)機(jī)體對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，提高飼料利用率，進(jìn)而提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能。賈聰慧等發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加丁酸梭菌能夠顯著提高肉雞生長(zhǎng)各階段體重、平均日增重和平均采食量。李玉鵬等報(bào)道，日糧中添加5×10CFU／g丁酸梭菌，斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量顯著提升、料重比下降。在本試驗(yàn)中，日糧中添加丁酸梭菌極顯著提高了育成期貉平均日增重，且2組提升幅度比1組更高。這與其他研究者的試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明丁酸梭菌能夠緩解因環(huán)境變化導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激，提高育成期貉的生長(zhǎng)性能。丁酸梭菌能夠提高貉的生長(zhǎng)性能，一方面是因?yàn)檫M(jìn)入消化道后，能夠刺激分泌淀粉酶、蛋白酶等具有活性的胞外酶，這些胞外酶能夠促進(jìn)消化道對(duì)飼糧中營(yíng)養(yǎng)成分的降解，提高機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收，從而提高飼料利用率，提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能；另一方面，丁酸梭菌具有降解飼糧中抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用，能夠改善機(jī)體對(duì)飼糧中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收利用，從而提高動(dòng)物體的生長(zhǎng)性能。

應(yīng)激反應(yīng)會(huì)損傷貉消化道黏膜結(jié)構(gòu)并對(duì)微生態(tài)平衡產(chǎn)生負(fù)面作用，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化水平的下降并引起腹瀉，妨礙正常生長(zhǎng)發(fā)育。丁酸梭菌在進(jìn)入消化道內(nèi)后會(huì)發(fā)揮其生物頡頏作用，阻礙有害菌和腐敗菌在消化道內(nèi)定植生長(zhǎng)，促進(jìn)其他有益菌群的生長(zhǎng)定植，從而調(diào)節(jié)腸道平衡、降低動(dòng)物腹瀉率。肖雪梅等研究表明，在日糧中添加1 kg／t丁酸鈉和250 g／t丁酸梭菌混合制劑的飼料，斷奶期仔豬消化道微生態(tài)環(huán)境有了明顯改善，腹瀉率有所下降。M.M.Hossain等在肉雞飼料中添加不同劑量的丁酸梭菌，屠宰后測(cè)定腸道菌群，結(jié)果表明，對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉雞腸道中大腸桿菌等有害菌水平顯著降低，而乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌菌落數(shù)量明顯增加；隨著劑量的升高丁酸梭菌對(duì)有害菌的抑制效果也隨之增強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加不同劑量的丁酸梭菌均有降低貉腹瀉率的效果，1，2組貉的腹瀉率與對(duì)照組相比分別降低了20.00%和31.09%，糞便狀況也有所改善。說(shuō)明丁酸梭菌具有調(diào)整腸道狀況、降低貉腹瀉率的作用。究其原因，首先，丁酸梭菌在腸道定植后能夠促進(jìn)淀粉酶、纖維素酶等活性酶的分泌，將飼糧中的多糖水解成寡糖，為益生菌的發(fā)酵提供底物，從而促使有益菌生長(zhǎng)定植，并且能夠分泌出丁酸等有機(jī)酸，調(diào)節(jié)腸道pH值，抑制大腸桿菌等有害菌在腸道中的定植生長(zhǎng)；其次，丁酸梭菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸中，丁酸具有降低乙?；富钚缘淖饔茫~酸能夠通過(guò)參與基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)程調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)，從而起到預(yù)防和治療腹瀉的效果。

3.2 丁酸梭菌對(duì)血清生化指標(biāo)的影響

谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是指示肝臟受損情況的重要指標(biāo)，如果肝臟細(xì)胞因應(yīng)激反應(yīng)等因素而受到損傷，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性會(huì)增加。血清總膽固醇是指示機(jī)體脂類代謝情況的指標(biāo)，也能反映機(jī)體的應(yīng)激狀況，在機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)脂類運(yùn)輸受阻，從而導(dǎo)致血清總膽固醇含量增加。三酰甘油作為在機(jī)體中含量最高的脂類，是機(jī)體生成細(xì)胞膜、膽汁和維生素D的重要材料，還能通過(guò)分解為機(jī)體組織供能。三酰甘油作為指示機(jī)體脂類代謝水平的重要指標(biāo)，如果含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致機(jī)體一系列疾病的發(fā)生，含量降低則代表機(jī)體出現(xiàn)了如寄生蟲(chóng)感染、營(yíng)養(yǎng)不良、代謝障礙等健康問(wèn)題。本試驗(yàn)中，在日糧中添加丁酸梭菌的1，2組貉血清總膽固醇水平與對(duì)照組相比有所下降，而血清三酰甘油水平在正常范圍內(nèi)略微上升，說(shuō)明丁酸梭菌能夠在一定程度上減輕貉因外界應(yīng)激導(dǎo)致的脂類代謝阻礙，從而改善營(yíng)養(yǎng)狀況、提高動(dòng)物體脂類代謝水平。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性本次測(cè)定數(shù)值異常，分析可能是由于操作不當(dāng)導(dǎo)致血細(xì)胞破裂，引發(fā)溶血，血液細(xì)胞內(nèi)大量活性較高的酶流入血清，導(dǎo)致血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶數(shù)值異常偏高。

3.3 丁酸梭菌對(duì)血清抗氧化指標(biāo)的影響

動(dòng)物體防御系統(tǒng)中抗氧化水平的高低是判斷動(dòng)物體健康水平的重要指標(biāo)。通常條件下，在機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的支持下，動(dòng)物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清理始終維持在一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)動(dòng)物因遭受疾病或者外界刺激侵?jǐn)_而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化物和氧化性自由基過(guò)量時(shí)，就會(huì)使機(jī)體受到氧化損傷。丙二醛是脂質(zhì)氧化的最終產(chǎn)物，能夠反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化率和強(qiáng)度，也能間接反映組織細(xì)胞損傷程度。還原型谷胱甘肽作為一種抗氧化劑，能夠保護(hù)蛋白質(zhì)和酶分子中的巰基不被自由基等氧化，能夠維持機(jī)體內(nèi)重要蛋白質(zhì)和酶的活性，是反映機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)?？偪寡趸芰κ欠从硻C(jī)體抗氧化功能的綜合指標(biāo)。研究表明，在飼糧中添加丁酸梭菌，會(huì)導(dǎo)致肉雞血清丙二醛含量降低、還原型谷胱甘肽含量顯著增加，并且試驗(yàn)期第21，42天肉雞肝臟和消化道抗氧化能力也有顯著提高。本試驗(yàn)中，在日糧中添加丁酸梭菌，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組貉血清丙二醛和還原型谷胱甘肽含量變化不顯著。推測(cè)是在血清樣品采集時(shí)貉已發(fā)育成熟，機(jī)體抗氧化能力完備，丁酸梭菌提高動(dòng)物體抗氧化性的效果不明顯；但1，2組貉血清總抗氧化能力水平在數(shù)值上略高于對(duì)照組，表明丁酸梭菌在緩解育成期貉因外界應(yīng)激而導(dǎo)致的抗氧化能力下降方面有一定的作用。有研究表明，丁酸梭菌能夠提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力，這可能與丁酸梭菌代謝物中的丁酸和氫氣有關(guān)，丁酸和氫氣具有增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性的作用；丁酸具有提高腸黏膜內(nèi)還原型谷胱甘肽含量的作用，還能降低尿酸含量、提高機(jī)體結(jié)腸黏膜的抗氧化性；氫氣能夠通過(guò)清除機(jī)體內(nèi)氧化性自由基，減輕機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)。

4 結(jié)論

在貉飼糧中添加1.25×10CFU／kg和2.50×10CFU／kg丁酸梭菌能夠有效提高貉日增重，降低腹瀉率，對(duì)緩解環(huán)境應(yīng)激、提高機(jī)體抗氧化能力有一定作用。