西洋參枯萎病病原分離與鑒定

趙璟琛,伏松平,胡加怡,田小曼,王 強,商文靜

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室,陜西楊凌 712100;2.天水市植保植檢站,甘肅天水 741020;3.福建農(nóng)林大學(xué) 植物保護學(xué)院,福州 350002;4.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

西洋參(Panax quinquefoliusL.),又名花旗參、美國人參,為五加科人參屬多年生草本植物,其根、莖、葉和果實均可入藥,是2015版中國藥典收載植物種質(zhì),并于2021年進入藥食同源的名貴作物序列試點[1]。西洋參具有抗腫瘤、降血糖血脂、抗疲勞和提高免疫力等多種藥理活性,有極高的藥用和保健價值,被譽為“綠色黃金”[2]。西洋參原產(chǎn)于北美洲加拿大和美國的五大湖地區(qū),1980年在中國東北、華北、西北、華南、西南等地引種成功后,國內(nèi)西洋參產(chǎn)業(yè)不斷壯大,并逐漸形成吉林省撫松縣、山東省文登市和陜西省留壩縣三大主要西洋參優(yōu)勢栽培區(qū),特別是留壩西洋參被譽為“最接近原產(chǎn)地品質(zhì)”產(chǎn)品[1,3-6]。

2020-2021年,在對陜西省留壩縣和太白縣西洋參病害的常規(guī)調(diào)查中發(fā)現(xiàn),部分地塊西洋參植株地上部生長勢衰弱,葉片逐漸由外向內(nèi)褪綠變黃萎蔫,莖稈瘦弱黃化,參根表皮無明顯病變,但解剖后維管束變黃,根據(jù)田間癥狀表現(xiàn)高度懷疑為一種新型土傳西洋參病害,嚴重地塊發(fā)病株率達60%。西洋參生產(chǎn)和加工是留壩縣支柱產(chǎn)業(yè),也是當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶脫貧致富的主要途徑,基于土傳病害對西洋參產(chǎn)量和品質(zhì)的潛在威脅,加之土傳病害亦是引起西洋參連作障礙的主要原因,故準確鑒定該病病原種類、明確田間發(fā)生特點和規(guī)律,對預(yù)防和消減西洋參連作障礙具有重要意義。為此,筆者及其研究團隊對該病害進行系統(tǒng)調(diào)查探究,以期為該病害的田間診斷和防治提供參考?，F(xiàn)將主要結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集

2020年7月至2021年10月,多次對陜西省留壩縣、太白縣西洋參種植區(qū)發(fā)病地塊進行調(diào)查,記錄發(fā)病情況。采集具典型癥狀植株標本,記錄采樣時間、地點等信息并編號,帶回實驗室,4 ℃保藏供試。

1.2 病原菌的分離與純化

采用常規(guī)組織分離法進行病原菌分離與純化[7]。流水沖洗去除標本表面灰塵和泥土,用滅菌濾紙吸干表面殘留的水分,室溫下陰干。切取5 mm×5 mm 的發(fā)病組織塊,75%乙醇溶液消毒45 s,無菌水漂洗1 min共3次,無菌濾紙吸干組織塊表面水分,放入PDA 培養(yǎng)基(含鏈霉素50 μg/m L)上,倒置于25 ℃黑暗培養(yǎng)。待組織塊邊緣有菌落長出,挑取菌落邊緣菌絲,接種于新的PDA 培養(yǎng)基平板上進行純化。單孢純化后的病原菌培養(yǎng)物保存于-20 ℃,備用。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將供試病原菌純培養(yǎng)物制作為常規(guī)水裝片,顯微鏡下觀察鑒定供試菌的屬、種,測量孢子形態(tài)及大小,并記錄菌落形態(tài)、顏色、繁殖體形態(tài)等。挑取直徑5 mm 的供試菌株單孢培養(yǎng)物菌餅置于PDA 平板上,25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后觀察病原菌的培養(yǎng)性狀,采用十字交叉法測定菌落直徑,試驗重復(fù)3次。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

取100μL 單孢純化后的供試分離菌孢子懸浮液涂布于鋪有玻璃紙的PDA 培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)7 d 后收集菌絲,采用CTAB 法提取菌株DNA,經(jīng)Nanodrop 2000檢測合格后,于-20 ℃下保存,備用。

參考Fan等[8]方法對代表菌株YL002基因組DNA 進行PCR 擴增,引物采用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)間隔區(qū)r DNA-ITS基因、翻譯延伸因子TEF1-α基因和RNA 聚合酶最大亞基RPB1基因引物(表1)。PCR 擴 增25 μL,反 應(yīng) 體 系 為:引 物(10 μmol/L)各0.5μL,10×TransTaq-T Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L d NTPs 2μL,TransTaq-TDNApolymerase 0.25 μL,模 板 DNA (50 ng/μL)1μL,dd H2O 18.25μL。PCR 擴增程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,55 ℃退火1 min(r DNA-ITS與RPB1),72 ℃延伸1.5 min,35個循環(huán);72 ℃延伸8 min,4 ℃保存,其中TEF1-α基因PCR 擴增程序的退火溫度為56 ℃,其余擴增條件相同。PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收純化后送至北京擎科生物技術(shù)有限公司西安分公司測序。

表1 供試病原鑒定所用PCR 引物Table 1 PCR primers for pathogenic identification of Fusarium wilt

對測序結(jié)果在NCBI的BLAST 中進行同源性比對分析。利用MEGA-X 軟件通過最大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹,同時對構(gòu)建的系統(tǒng)樹作自展檢驗(Bootstrap test)以獲得分支的支持率,自展檢驗中重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000 次。以大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)作為外群參考序列。

1.5 回接試驗與致病菌的再分離

回接植物材料為兩年生且長勢一致的健康西洋參植株。將供試代表性菌株YL002制備成濃度為1.0×106個/m L的孢子懸浮液,分別采用灌根法和傷根法進行回接試驗,具體方法參考Lai等[11]略有改動,無菌水接種處理為空白對照,每組處理重復(fù)3次。接種后的供試植株置于23±5 ℃的溫室中培養(yǎng),光周期為14 h,50 d后觀察記錄植株發(fā)病情況。采用常規(guī)組織分離法對回接發(fā)病的植株及參根進行再分離,將再分離得到的菌株在PDA 培養(yǎng)基上進行純化,并與原接種菌進行形態(tài)學(xué)比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 西洋參枯萎病田間發(fā)生情況及癥狀

2020-2021年,對陜西省留壩縣和太白縣西洋參主要種植區(qū)的西洋參枯萎病發(fā)生情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn),各主要種植區(qū)西洋參枯萎病零星發(fā)生,部分地區(qū)特別是連作參田發(fā)病較為嚴重,發(fā)病率可達30%以上。發(fā)病初期受害植株地上部生長勢衰弱,植株矮小,葉色淡白,葉緣變黃萎蔫并逐漸向內(nèi)部擴展,參根瘦弱萎細,無明顯腐爛或壞死,參根剖面維管束變黃。發(fā)病后期受害植株枯萎,葉片完全褪綠且皺縮卷曲,質(zhì)地較脆,但不脫落(圖1-B),參根皮層壞死,維管束呈棕褐色或黃褐色(圖1-D)。

圖1 西洋參枯萎病癥狀Fig.1 Symptoms of Panax quiquefolium wilt

2.2 西洋參枯萎病病原菌形態(tài)特征

從發(fā)病西洋參根部病健交界處分離到的5個菌株(編號為YL001～YL005),其菌落和形態(tài)學(xué)特征無明顯差異。

代表菌株YL002在PDA 平板上生長良好,培養(yǎng)5 d菌落直徑可達68～71 mm,菌落圓形,白色或淺黃色,底部有淺紫色色素形成;菌絲疏松絮狀,氣生菌絲茂盛發(fā)達(圖2-A,2-B);分生孢子梗菌絲狀,頂生或側(cè)生分生孢子;小型分生孢子無色透明,圓柱形或長橢圓形,0～1 個隔膜,大小為1～2μm ×4～13μm,數(shù)量較多(圖2-C);大型分生孢子無色透明,呈鐮刀形,有2～3個隔膜,大小為3～5μm×12～35μm,數(shù)量較少(圖2-C)。菌絲老熟后產(chǎn)生厚垣孢子,褐色圓形,表面光滑,直徑平均為3.5μm(圖2-D)。根據(jù)以上形態(tài)特征,參考Booth的鐮胞菌屬分類系統(tǒng)[12],初步將供試菌鑒定為尖孢鐮胞菌(Fusarium oxysporum)。

圖2 西洋參枯萎病病原菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of isolates from Panax quiquefolium wilt

2.3 西洋參枯萎病病原菌回接

供試菌株YL002回接后,均可產(chǎn)生典型西洋參枯萎病癥狀,與田間癥狀基本一致。接種50 d后西洋參植株葉片邊緣變黃萎蔫,葉片不脫落,維管束發(fā)生褐變,對照組西洋參均未發(fā)病。對發(fā)病參根進行再分離,分離物與接種菌株有相同的形態(tài)學(xué)特征,表明供試菌株為西洋參枯萎病的致病病原菌。

2.4 菌株YL002分子生物學(xué)鑒定

以供試菌株YL002基因組DNA 為模,使用ITS1/ITS4、EF1/EF2 和Fa/G2R 引 物 分 別 對rDNA-ITS、TEF1-α和RPB1基因進行PCR 擴增,分別得到大小為540、720 和1 600 bp片段。BLAST 比對分析后利用MEGA-X 軟件構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,基于不同擴增引物獲得的YL002 序列與尖孢鐮刀菌F.oxysporum均在同一發(fā)育分支,且序列相似性高達100%(圖3)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、回接結(jié)果以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,確定引起西洋參枯萎病的病原菌為尖孢鐮胞菌F.oxysporum。

圖3 基于供試菌株r DNA-ITS、TEF1-α 及RPB1 序列的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of YL002 based on rDNA-ITS,TEF1-αand RPB1 sequence

3 討論

半知菌類鐮胞菌屬(Fusariumspp.)真菌在西洋參上的危害多有報道,Zamir等[13]發(fā)現(xiàn)引起英國哥倫比亞地區(qū)西洋參根腐病的4種主要鐮胞菌(F.solani、F.oxysporum、F.avenaceum及F.equiseti)中F.solani的致病性最高。隨后,Lee[14]對韓國西洋參根腐病植株的根部及其周圍土壤中分離得到的115株分離菌株進行鑒定,并發(fā)現(xiàn)其中鐮刀菌數(shù)目最多,且主要為F.solani、F.oxysporum及F.moniliforme。Fan 等[8]首次發(fā)現(xiàn)F.redolens亦能引起西洋參根腐病的發(fā)生,且該菌在5～40℃的條件下均能生長,對大多數(shù)碳源、氮源均可利用,更適宜于在西洋參根際微酸環(huán)境下生長,可能成為從西洋參種子層積處理到收獲全程潛在病原菌,是引起西洋參連作障礙形成的主要土傳病原菌之一。

本研究通過田間癥狀觀察、病原菌分離、柯赫氏法則驗證、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)分析,對采自陜西省西洋參主產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)西洋參枯萎癥狀的樣本進行病原分離與鑒定,結(jié)果表明,分離純化得到的供試菌均可侵染西洋參植株引起枯萎病典型癥狀,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、真菌r DNA-ITS位點、TEF1-α和RPB1基因序列分析,供試病原菌被鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum,該病被定名為西洋參枯萎病,為新記錄西洋參病害。西洋參枯萎病癥狀和由同為F.solani引起的西洋參根腐病有較大區(qū)別,西洋參枯萎病發(fā)病植株地上部分?？菸蛄愕~片不脫落,地下參根癥狀也較輕,僅參根皮層出現(xiàn)小面積水漬狀病斑,維管束變黃。而西洋參根腐病地上部分癥狀常表現(xiàn)為植株矮小,葉片枯萎脫落只剩莖稈,地下部參根表皮濕腐,維管束變褐,嚴重情況下整個參根變黑腐爛消失。

F.oxysporum是一種嚴重影響植物產(chǎn)量和品質(zhì)的土傳病原真菌,且其寄主范圍極為廣泛,可引起150多種植物枯萎病和根腐病的發(fā)生[15-16]。由于尖孢鐮刀菌具有高度的寄主?；?其致病性也因寄主、環(huán)境等的變化發(fā)生顯著差異,目前,關(guān)于F.oxysporum致病性差異研究主要集中在番茄、香蕉和擬南芥等寄主植物上,而豆科作物、十字花科和五加科植物等具有重要經(jīng)濟價值的寄主植物在這方面研究尚少[17],特別是其在侵染引起西洋參枯萎病和根腐病上的致病性差異研究有待深入。