花椒樹(shù)腐朽病病原菌鑒定及其生防菌劑篩選

梁巧蘭,魏列新,徐秉良,吳 瓊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)

花椒Zanthoxylum bungeanumMaxim 是蕓香科Rutaceae花椒屬ZanthoxylumL.多年生香料和油料樹(shù)種,葉片和果實(shí)都有揮發(fā)性油和脂肪,可作食物香料和香精原料,具有一定的醫(yī)療作用[1-2],并可用于糧食貯存期間病害防治及制作香皂、肥皂和工業(yè)油漆等的原料[3-5];花椒樹(shù)根系發(fā)達(dá),能夠固土和耐干旱,是優(yōu)勢(shì)生態(tài)林經(jīng)濟(jì)樹(shù)種之一[6]。因其良好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益,花椒已成為甘肅經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)[7]。近年來(lái),隨著花椒產(chǎn)業(yè)和種植面積的不斷發(fā)展,花椒病害發(fā)生嚴(yán)重,已成為限制花椒生產(chǎn)的主要因素。2018年5月,在甘肅省永靖縣三塬鎮(zhèn)調(diào)查發(fā)現(xiàn),花椒主要病害有干腐病、流膠病和腐朽病等,其中腐朽病發(fā)生最重[8]。已有報(bào)道表明,花椒樹(shù)腐朽病是由裂褶菌(Schizophyllum commune)引起的[9-10],該菌可引起花椒樹(shù)樹(shù)皮腐爛,而對(duì)于樹(shù)桿上無(wú)子實(shí)體的潰瘍斑是否由裂褶菌侵染所致及其生物學(xué)特性和生物防治等尚未見(jiàn)系統(tǒng)研究。為此,對(duì)引起甘肅省花椒樹(shù)腐朽病病原物進(jìn)行分離純化鑒定及生物學(xué)特性研究;同時(shí)針對(duì)病原菌進(jìn)行生物農(nóng)藥室內(nèi)篩選,旨在探明引起花椒樹(shù)腐朽病病原菌種類(lèi)及影響發(fā)病的因素;同時(shí),為指導(dǎo)利用生物農(nóng)藥有效防治花椒病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 花椒病害發(fā)生情況調(diào)查及病樣采集

2018年5月7-12日,在甘肅省永靖縣三塬鎮(zhèn)花椒園內(nèi),采用5點(diǎn)取樣調(diào)查法,依據(jù)表1分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11],按照東、西、南、北4個(gè)方向分別對(duì)花椒樹(shù)主桿及枝條上腐朽病病害發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查,每個(gè)點(diǎn)調(diào)查10株,共調(diào)查50株,每個(gè)方向調(diào)查3個(gè)枝條,采用“十字”交叉法測(cè)量病斑長(zhǎng)徑和短徑,按下列公式計(jì)算發(fā)病株率和病情指數(shù)。同時(shí),采集病樣帶回實(shí)驗(yàn)室,備用。

表1 花椒樹(shù)腐朽病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grading standard of decay disease on Zanthoxylum bungeanum

發(fā)病率=病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=∑(病級(jí)株數(shù)×代表數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高級(jí)代表數(shù)值)×100

1.2 病原菌分離純化及鑒定

1.2.1 病原菌分離純化 將采集具有子實(shí)體的腐朽病枝條和具有腐爛病斑、無(wú)子實(shí)體的花椒樹(shù)枝條分別放置在不同容器中,用清水沖洗干凈,再用流水沖洗2 h,沖掉表面腐生菌,然后用0.1%升汞溶液表面消毒30 s,無(wú)菌水清洗后,取子實(shí)體、腐爛病斑邊緣樹(shù)皮分別放在鋪有3層無(wú)菌濕濾紙的培養(yǎng)皿里,置于25 ℃、L/D 為12 h/12 h(2 200 lx)光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng),直至子實(shí)體、樹(shù)皮上長(zhǎng)出菌絲,挑取菌絲接種到PDA 培養(yǎng)基,待長(zhǎng)出菌絲后,及時(shí)挑取菌絲塊轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上純化培養(yǎng),連續(xù)純化3次后,將子實(shí)體彈射在培養(yǎng)皿蓋上的孢子用滅菌水洗下懸浮在離心管中,通過(guò)顯微鏡觀察將孢子懸浮液濃度調(diào)整為1×105個(gè)/m L),將孢子懸浮液稀釋100 倍后倒入2%瓊脂培養(yǎng)基表面(厚度0.5mm),轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿當(dāng)孢子懸浮液布滿整個(gè)表面后,將多余的孢子懸浮液倒掉,用滅菌的解剖刀將瓊脂培養(yǎng)基切割成1 mm×1 mm 大小的瓊脂塊,然后將瓊脂塊挑到滅菌的載玻片上,置于顯微鏡下進(jìn)行觀察,將有單個(gè)孢子的瓊脂塊接種在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行單孢分離培養(yǎng)[12],觀察菌落形態(tài)并將單孢分離純化的菌落4 ℃斜面保存,備用。

1.2.2 分離物致病性測(cè)定 參考周儀等[13]及張祥林等[14]的方法,略有改進(jìn),從生長(zhǎng)健康的花椒樹(shù)上剪取長(zhǎng)20 cm、直徑1 cm 左右枝條,用自來(lái)水沖洗干凈后,分成2組,每組20根,共40根,其中1組用燒紅的鐵釘對(duì)枝條進(jìn)行燙傷處理,另1組不做燙傷處理,在超凈工作臺(tái)上用75%酒精對(duì)3組枝條進(jìn)行表面消毒后分別接種病斑分離的菌餅、孢子(孢子獲得和濃度同“1.2.1”)和子實(shí)體分離菌餅,以接種PDA 培養(yǎng)基為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)5次,枝條兩端用無(wú)菌濕棉球保濕,然后放入墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)條件同“1.2.1”。定期觀察接種枝條的發(fā)病狀況,對(duì)所有接種發(fā)病的枝條從病斑處分離病原菌,并觀察培養(yǎng)形態(tài)、菌絲和孢子與原分離菌是否一致。

1.2.3 病原菌鑒定 采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩種方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。通過(guò)觀察菌落形狀、菌絲和孢子形態(tài)結(jié)構(gòu),結(jié)合《植物病原真菌學(xué)》[15]進(jìn)行病原菌鑒定。

按照真菌DNA 提取試劑盒說(shuō)明,以菌絲為材料提取DNA,利用真菌通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn) 行ITS序列擴(kuò)增,PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μL):12.5μL mix,9.5μL dd H2O,1μL上游引物,1μL下游引物,1μL cDNA 模板。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃初始變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30 個(gè)循環(huán),再72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由西安擎科有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在GenBank 上進(jìn)行Blastn 同源性比對(duì),利用MEGA7軟件采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并分析結(jié)果[16]。

1.3 病原菌生物學(xué)特性

1.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)花椒腐朽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)[12]。在PDA 組成的基礎(chǔ)上分別用花椒樹(shù)皮、花椒葉、花椒枝條各200 g,代替200 g馬鈴薯,制作成花椒樹(shù)皮、花椒葉及花椒枝條煎汁培養(yǎng)基,高溫滅菌后倒入滅菌培養(yǎng)皿中,冷卻凝固后,分別接入用直徑為5 mm 打孔器在病原菌菌落邊緣打取的菌餅,每個(gè)處理重復(fù)3次,放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,4 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況,“十字”交叉法測(cè)定菌落直徑。

1.3.2 不同溫度對(duì)花椒樹(shù)腐朽病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 選用“1.3.1”中病原菌生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基,制備成平板并接種病原菌(方法同“1.3.1”),然 后 分 別 放 置 于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的培養(yǎng)箱中,4 d后“燙十字”燙交叉法測(cè)菌落直徑。

1.3.3 不同濕度對(duì)花椒樹(shù)腐朽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 使用“1.3.1”中病原菌生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基,制備成平板,并接種病原菌(方法同“1.3.1”),放置于25 ℃、相對(duì)濕度為50%、60%、70%、80%、90%光照培養(yǎng)箱中,每個(gè)處理重復(fù)3 次,4 d后采用“燙十字”燙交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3.4 不同p H 對(duì)花椒腐朽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 分別用濃度為0.1 mol/L 的HCl和NaOH 溶液調(diào)節(jié),制成p H 分別為5、6、7、8、9、10的平板,接種病原菌(方法同“1.3.1”),置于25 ℃、適宜相對(duì)濕度、光照度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4 d后“燙十字”燙交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3.5 裂褶菌對(duì)花椒樹(shù)的侵染過(guò)程 分別選用菌蓋培養(yǎng)的菌絲、病斑分離菌的菌絲和孢子(孢子獲得和濃度同“1.2.1”),通過(guò)有傷接種健康的花椒枝條后,置于溫度30 ℃、相對(duì)濕度70%的培養(yǎng)箱中,逐天觀察發(fā)病情況。

1.4 花椒樹(shù)腐朽病病原菌室內(nèi)生物農(nóng)藥篩選及毒力測(cè)定

1.4.1 幾種生物農(nóng)藥對(duì)裂褶菌抑制作用測(cè)定采用生長(zhǎng)速率法,將藥劑的推薦濃度擴(kuò)大50 倍(表2)用無(wú)菌水配制成溶液,取1 m L藥劑加到滅菌冷卻至45 ℃左右的49 m L PDA 培養(yǎng)基中,搖勻,倒入4 個(gè)培養(yǎng)皿中制成含藥培養(yǎng)基,以只加1 m L無(wú)菌水的PDA 培養(yǎng)基為對(duì)照,然后接種病原菌,置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4 d后“燙十字”燙交叉法測(cè)量菌落直徑,并按下式計(jì)算藥劑抑菌率,供試藥劑種類(lèi)及濃度見(jiàn)表2。

表2 供試藥劑及推薦使用濃度Table 2 Tested fungicide and its recommended concentration

抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-5 mm)×100%

1.4.2 幾種藥劑對(duì)裂褶菌室內(nèi)活性測(cè)定 參考?xì)⒕鷦┦覂?nèi)毒力測(cè)定方法,以各藥劑推薦濃度為最高濃度,按照對(duì)半稀釋法用滅菌水將上述供試藥劑分別稀釋成5個(gè)濃度梯度,采用“1.4.1”中的方法制備不同濃度含毒PDA 平板,接菌培養(yǎng)、測(cè)量菌落直徑,計(jì)算藥劑抑菌率,然后將藥劑濃度轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)值,為橫坐標(biāo),再將抑菌率轉(zhuǎn)化為機(jī)率值,為縱坐標(biāo),求出毒力回歸方程和EC50。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2010和MEGA7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒病害發(fā)生情況調(diào)查

調(diào)查發(fā)現(xiàn)甘肅省永靖縣三塬鎮(zhèn)花椒園區(qū)內(nèi)花椒樹(shù)腐朽病發(fā)生嚴(yán)重,發(fā)病病株率高達(dá)77.50%,病情指數(shù)為29.00,該病害主要危害花椒樹(shù)主干,尤其在疏剪、除孽后的傷口、枝干壁裂和芽眼處,受害部位的樹(shù)皮開(kāi)始慢慢開(kāi)裂、脫落、腐朽、直至裸露,枝干由外向內(nèi)不斷干枯腐爛,形成大小不一的潰瘍斑,最大的潰瘍斑長(zhǎng)度可達(dá)120 cm,危害嚴(yán)重的枝條整枝枯死,上面布滿白色或灰白色的蘑菇狀子實(shí)體,呈重疊狀群生于樹(shù)桿皮層上;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有的椒樹(shù)枝條也出現(xiàn)潰瘍斑,但其上并沒(méi)有裂褶菌的子實(shí)體(圖1)。在剪鋸口、昆蟲(chóng)危害孔處長(zhǎng)滿子實(shí)體,有的未見(jiàn)子實(shí)體,但樹(shù)皮腐朽脫落,露出木質(zhì)部,形成大小不一的長(zhǎng)條狀潰瘍斑,導(dǎo)致樹(shù)勢(shì)衰弱,品質(zhì)下降,產(chǎn)量降低,樹(shù)體老化,壽命縮短,嚴(yán)重時(shí)椒樹(shù)干枯死亡。

圖1 花椒樹(shù)腐朽病癥狀Fig.1 Symptoms of decay disease of Zanthoxylum bungeanum tree

2.2 花椒樹(shù)腐朽病病原菌分離純化及鑒定

2.2.1 分離純化 花椒枝條上裂褶菌子實(shí)體經(jīng)保濕培養(yǎng)獲得純化菌(圖2-A);從沒(méi)有子實(shí)體的花椒枝條潰瘍斑上共分離純化到3種菌,經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察,分別是腐皮鐮刀菌(Fusarium solaniMart.)、鏈格孢(Alternaria alternata)和一種未知菌(編號(hào)為Z1),其分離頻率分別為20%、25%和80%。Z1單孢分離純化菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)菌落初期呈白色,輻射狀向外生長(zhǎng),并伴有蘑菇的氣味,培養(yǎng)一段時(shí)間后菌落表面產(chǎn)生大小不等的菌絲柱,在其頂部產(chǎn)生扇形的子實(shí)體,培養(yǎng)后期在子實(shí)體頂部培養(yǎng)皿蓋上產(chǎn)生與子實(shí)體菌蓋大小相同的淡黃色孢子印(圖2-B)。

圖2 病原物形態(tài)圖Fig.2 Morphology of pathogens

2.2.2 Z1分離菌致病性 經(jīng)致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn),分離菌Z1菌絲、孢子懸浮液接種于有傷口的花椒枝條上第5天時(shí)均能夠侵染發(fā)病,且癥狀和裂褶菌子實(shí)體上分離到的菌絲的致病癥狀相同,將發(fā)病枝條上的菌絲清洗干凈后,從枝條的病健交界處分離到與最初分離的Z1、裂褶菌子實(shí)體分離菌相同的病原菌(圖3-A,3-B,3-C),無(wú)傷接種第5天時(shí)均未發(fā)病。

圖3 分離菌Z1致病性測(cè)定Fig.3 Pathogenicity test of Z1 strain isolated from Zanthoxylum bungeanum tree

2.2.3 病原菌Z1的鑒定 Z1病原菌在PDA 上為輻射狀白色菌落,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加菌落上產(chǎn)生大小不等且傾斜向上生長(zhǎng)的菌絲柱,菌絲柱頂端有凹陷小孔,呈珊瑚狀,頂端慢慢膨大,在邊緣形成幾條菌褶,最后頂端張開(kāi),形成長(zhǎng)約0.4～1.4 cm、寬約0.2～1.4 cm 菌褶朝上的子實(shí)體,菌蓋圓形或扇形,外緣向內(nèi)卷,有多個(gè)裂瓣,初形成時(shí)菌褶較密,等長(zhǎng)或不等長(zhǎng),從基部輻射而出,呈白或灰白色,后期變?yōu)樯詈稚?、灰褐色或黃褐色(圖4-A～4-G),并在菌蓋上部的培養(yǎng)皿蓋上彈射出與其相同大小的擔(dān)孢子堆,孢子印白色(圖4-H),孢子形態(tài)為單孢無(wú)色,棍棒狀,一端有一斜角,大小為11.81μm×6.62μm(圖4-I);挑取菌絲進(jìn)行顯微觀察,菌絲有隔、分支狀,粗細(xì)不一,在近隔膜處形成鎖狀聯(lián)合,菌絲外著生小梗細(xì)棍棒狀,為針狀體,未見(jiàn)分生孢子,偶見(jiàn)菌絲膨大;菌絲粗細(xì)不均(圖4-J～4-L);發(fā)現(xiàn)該菌根據(jù)病原菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀,將引起花椒枯枝病的病原菌初步鑒定為裂褶菌Schizophyllum communeFranch.。

圖4 Z1菌株形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristics of Z1 strain

通過(guò)PCR 擴(kuò)增得到1條長(zhǎng)度為602 bp的片段,通過(guò)序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)Z1 分離菌與裂褶菌Schizophyllum communeFranch的同源性達(dá)到99%,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,進(jìn)一步將該菌鑒定為擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycotina)、層 菌 綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、裂褶菌科(Schizophyllaceae)、裂褶菌屬(Schizophyllumsp.)、裂 褶 菌(Schizphylhls commneFranch),GenBank序列號(hào)為MT251888.1(圖5)。

圖5 花椒樹(shù)腐朽病病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of pathogen of Zanthoxylum bungeanum tree decay disease

2.3 花椒樹(shù)腐朽病病原菌生物學(xué)特性

2.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)裂褶菌生長(zhǎng)的影響 裂褶菌在不同種類(lèi)培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng),且生長(zhǎng)速度存在明顯差異。其中在花椒枝條煎汁培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)最快,第4天時(shí)菌落直徑最大,為67.2 mm;PDA 培養(yǎng)基和花椒葉煎汁培養(yǎng)基次之,菌落直徑分別為58.3 mm 和58.0 mm,花椒樹(shù)皮煎汁培養(yǎng)基生長(zhǎng)最慢,菌落直徑僅為44.3 mm,除PDA培養(yǎng)基和花椒葉煎汁培養(yǎng)基菌落直徑之間差異不顯著外,其他培養(yǎng)基菌落直徑之間差異極顯著(圖6)。

圖6 裂褶菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Fig.6 Growth of S.commune on different medium

2.3.2 溫度對(duì)裂褶菌生長(zhǎng)的影響 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)狀況影響顯著,在15～35℃裂褶菌均可生長(zhǎng),且在10～30℃,菌落生長(zhǎng)速度與溫度成正比,溫度越高菌落生長(zhǎng)越快,不同溫度下培養(yǎng)4 d時(shí),10 ℃下菌落直徑僅為10.7 mm,30 ℃下菌落直徑最大,為58.7 mm,其他溫度的菌落直徑介于二者之間,且存在極顯著差異;當(dāng)溫度超過(guò)最適溫度(30 ℃)后,菌落生長(zhǎng)速度開(kāi)始下降,35 ℃的菌落直徑為41.3mm,與20 ℃的菌落直徑之間異顯著差(圖7)。

圖7 不同溫度下裂褶菌生長(zhǎng)情況Fig.7 Growth of S.commune under different temperatures

2.3.3 濕度對(duì)裂褶菌生長(zhǎng)的影響 裂褶菌在相對(duì)濕度為50%～90%時(shí)均能生長(zhǎng),當(dāng)相對(duì)濕度在50%～70%時(shí),菌落生長(zhǎng)速度隨著濕度的增加而增大,且在相對(duì)濕度為70%時(shí)菌落生長(zhǎng)最快,直徑最大,為58.6mm,在相對(duì)濕度在70%～90%時(shí),菌落生長(zhǎng)速度隨濕度的增加而減小;除相對(duì)濕度為60%和80%時(shí)菌落直徑之間差異顯著外,其余相對(duì)濕度下菌落直徑之間均存在極顯著差異(圖8)。

圖8 不同濕度下裂褶菌生長(zhǎng)情況Fig.8 Growth of S.commune under different humidity

2.3.4 p H 對(duì)裂褶菌生長(zhǎng)的影響 裂褶菌在p H為5～10的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng),在p H 為7的培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)最快,第4 天菌落直徑為34.0 mm;p H 為10時(shí),菌落生長(zhǎng)最慢,其直徑為21.0 cm,其余p H 條件下菌落直徑介于二者之間,除p H 為6和7時(shí)菌落直徑之間差異不顯著外,與其他p H 條件下的菌落直徑之間差異極顯著(圖9)。

圖9 不同p H 條件下裂褶菌生長(zhǎng)情況Fig.9 Growth of S.commune under under different p H conditions

2.3.5 裂褶菌對(duì)花椒樹(shù)的侵染過(guò)程 觀察置于溫度30 ℃、相對(duì)濕度70%的培養(yǎng)箱中的有傷接種菌蓋培養(yǎng)的菌絲、病斑分離菌的菌絲和孢子的花椒枝條,發(fā)現(xiàn)在該適宜條件下2 d后裂褶菌兩種菌絲接種的部位均產(chǎn)生茂密的白色菌絲且菌絲向無(wú)傷的樹(shù)皮擴(kuò)展,5 d后菌絲擴(kuò)展至整個(gè)枝條,15 d后菌絲更加茂密,且菌絲柱產(chǎn)生,25 d后菌絲柱進(jìn)一步形成子實(shí)體原基;而接種孢子懸浮液的枝條2 d后僅在接種部位產(chǎn)生稀疏的菌絲,5 d后菌絲向四周擴(kuò)展,擴(kuò)展面積為接種面積的1.5倍,15 d后菌絲擴(kuò)展至整個(gè)枝條,有少量的菌絲柱產(chǎn)生,25 d后菌絲茂密,菌絲柱變大,但未見(jiàn)子實(shí)體原基(圖10)。

圖10 花椒樹(shù)腐朽病病原菌侵染過(guò)程Fig.10 Infection process of S.commune on Zanthoxylum bungeanum tree

2.4 室內(nèi)生物藥劑篩選及活性測(cè)定

研究結(jié)果表明,4種生物農(nóng)藥對(duì)裂褶菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用,在推薦使用濃度下6%寡糖鏈蛋白、哈茨木霉和深綠木霉的抑菌率分別為99.99%、100%和100%,與1 500 g/m L 80%嘧霉胺的抑菌率相同,且高于667 g/m L 30%氟菌唑的抑菌率;1 000億/g枯草芽孢桿菌的抑菌率較低,為83.39%,毒力測(cè)定結(jié)果表明,80%嘧霉胺活性最強(qiáng),EC50值為30.45μg/m L,1 000億/g枯草芽孢桿菌的活性最低,為486.46μg/m L,其他3種生物農(nóng)藥和30%氟菌唑的EC50值介于二者之間(表3,表4)。

表3 4種生物農(nóng)藥對(duì)裂褶菌抑制作用Table 3 Inhibition of four kinds of biological pesticides on S.commune

表4 4種生物農(nóng)藥對(duì)裂褶菌的活性測(cè)定Table 4 Activity determination of four biological pesticides against S.commune

3 討論

通過(guò)對(duì)花椒樹(shù)腐朽病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn),該病原菌菌落的形狀、顏色、菌絲的菌鎖結(jié)構(gòu)和針狀體、孢子及子實(shí)體以及分子鑒定均表明該菌為裂褶菌Schizophyllum communeFranch;在自然寄主及人工培養(yǎng)基上S.communeFr.均為有性型,未發(fā)現(xiàn)無(wú)性型。裂褶菌是一種兼性寄生真菌,既能腐朽枯立木和倒木,也能侵染活立木[17]。在傷口處和主桿有腐爛斑的地方侵染率極高[18],可以引起木材白色腐朽[19-21]、蘋(píng)果樹(shù)腐爛病、桃樹(shù)腐朽病,發(fā)病率高達(dá)100%,且樹(shù)齡越長(zhǎng)發(fā)病率越高[22];本研究也發(fā)現(xiàn)該病原菌在樹(shù)勢(shì)弱、剪鋸口和腐爛斑多的花椒樹(shù)主桿和大枝上發(fā)生嚴(yán)重。

目前,對(duì)于花椒樹(shù)腐朽病主要采用化學(xué)農(nóng)藥通過(guò)防治天牛等蛀桿昆蟲(chóng),減少傷口,減輕該病害的發(fā)生,在防治核桃裂褶菌病害時(shí),主要采用涂抹劑防治核桃潰瘍病的發(fā)生,尚未見(jiàn)直接針對(duì)裂褶菌進(jìn)行防治的化學(xué)藥劑和生物藥劑的研究報(bào)道[8,17],選用生物藥劑防治花椒樹(shù)腐朽病對(duì)減輕裂褶菌的危害,降低化學(xué)農(nóng)藥殘留污染、提高花椒品質(zhì)具有重要意義,在室內(nèi)篩選出對(duì)花椒樹(shù)腐朽病菌具抑菌作用且與兩種化學(xué)農(nóng)藥80%嘧霉胺和30%氟菌唑相同或略高,抑菌活性較高的3種生物農(nóng)藥,分別為6%寡糖鏈蛋白、哈茨木霉和深綠木霉。但是,本研究?jī)H對(duì)分離獲得的主要分離菌進(jìn)行了致病性測(cè)定,而對(duì)另外兩種菌是否具有致病性,與裂褶菌之間的協(xié)同關(guān)系,以及3種生物藥劑在田間對(duì)花椒樹(shù)腐朽病的防治等問(wèn)題尚未涉及,還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

花椒樹(shù)樹(shù)桿腐朽病在甘肅省永靖縣三塬鎮(zhèn)10 a樹(shù)齡的花椒樹(shù)上發(fā)生嚴(yán)重,平均發(fā)病率約為77.50%,病情指數(shù)為29.00,枝條上枯斑面積最大可達(dá)240 cm2,將引起該病害的主要病原菌鑒定為Schizophyllum communeFranch,病原菌生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基為花椒枝條煎汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,最適條件為30 ℃、相對(duì)濕度70%、p H7,菌絲比孢子侵染寄主快10 d,在菌絲侵染寄主第15天時(shí)產(chǎn)生菌絲柱,第25天時(shí)菌絲柱進(jìn)一步形成子實(shí)體原基,接著產(chǎn)生子實(shí)體;篩選出3種對(duì)Schizophyllum communeFr.抑菌活性較高的生物農(nóng)藥——6%寡糖鏈蛋白、哈茨木霉和深綠木霉。