董艷璐,張戰(zhàn)利,吳江波,陳 瑋,袁向群,李怡萍

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 楊凌712100;2.陜西省植物保護(hù)工作總站,西安 710003;3.宜川縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心,陜西 宜川716200)

梨星毛蟲Illiberis pruni屬鱗翅目,斑蛾科,又名梨葉斑蛾、餃子蟲、囊粘蟲等。梨星毛蟲在中國(guó)廣泛分布,各果品產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍,常見的危害嚴(yán)重地區(qū)有陜西、山東、河北等地。除危害梨樹外,蘋果、桃、李、杏等果樹也是其主要寄主[1]。該蟲是典型的食葉害蟲,以幼蟲成群取食果樹葉片,也可鉆蛀果樹的嫩芽、花蕾、果實(shí)危害。為害葉片時(shí),其吐絲將蟲體包裹進(jìn)葉片內(nèi),形似餃子,被取食葉片變黃、焦枯,發(fā)生嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致園中果樹葉片大面積脫落,從而使果樹光合作用減弱,降低果樹的樹勢(shì),影響果樹產(chǎn)量[2-3]。

在昆蟲中,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收主要在中腸進(jìn)行,中腸有多種消化酶,包括絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶[4-5]等,其中,絲氨酸蛋白酶家族是大多數(shù)昆蟲消化作用的關(guān)鍵參與者,屬重要的蛋白水解酶[6-7]。對(duì)鱗翅目害蟲中腸蛋白酶的研究主要集中在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶上,二者是最重要的絲氨酸蛋白酶[8]。蛋白酶抑制劑在一些動(dòng)物、植物和微生物中參與昆蟲的相互作用,常用于研究昆蟲蛋白酶活性。抑制作用取決于抑制劑的類型、濃度、抑制劑與酶的比例等[9]。植物中的絲氨酸蛋白酶抑制劑在抑制昆蟲蛋白酶方面起主要作用,并已用于防治害蟲[10]。Broadway等[11]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯蛋白酶抑制劑Pl-2(馬鈴薯抑制劑Ⅱ)在低濃度時(shí)可抑制甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼蟲腸道中的大部分胰蛋白酶活性。Mcmanus等[12]發(fā)現(xiàn)50 mg/L的STI對(duì)斜紋夜蛾Spodoptera litura幼蟲胰蛋白酶活性的抑制率高達(dá)88%。然而,迄今為止,關(guān)于梨星毛蟲中腸蛋白酶的研究鮮有報(bào)道。

目前對(duì)于梨星毛蟲的防治主要是化學(xué)防治,化學(xué)農(nóng)藥的使用帶來了“3R”等問題,因此,尋找一種新的綠色防控技術(shù)迫在眉睫。本研究測(cè)定梨星毛蟲幼蟲不同齡期中腸總蛋白酶、強(qiáng)堿性胰蛋白酶、弱堿性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性,在最適齡期(4齡)下,測(cè)定不同激活劑和抑制劑對(duì)梨星毛蟲中腸蛋白酶活性的影響。研究結(jié)果為以昆蟲中腸蛋白酶為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥的研發(fā)和轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

梨星毛蟲幼蟲預(yù)試驗(yàn)由張戰(zhàn)利和吳江波提供,正式試驗(yàn)幼蟲采自西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)海棠樹。采集的幼蟲直接用于試驗(yàn)測(cè)定,以30只幼蟲為樣品,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2 主要試劑

牛血清白蛋白(BSA)由美國(guó)Equitech-Bio公司提供。甲基磺酰-L-苯丙氨酸氯甲酮(Tosylphenylalanine chloromethyl-ketone,TPCK)、氨苯磺胺偶氮酪蛋白(Azocasein)、Nα-p-甲苯磺?；?L-精氨酸甲酯(Tert-amyl methyl ether,TAME)、大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean trypsin inhibitor,STI)、N-苯甲?；?L-酪氨酸乙酯(Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester,BTEE)、苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、Na-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺(Na-benzoyl-DLarginine pnitroanilide,BAPNA)、甲基磺酰-L-賴氨酸氯甲酮(N-tosyl-L-lysyl chloromethyl-ketone,TLCK)均由美國(guó)Sigma Aldrich公司提供。乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、乙二醇二乙醚二氨四乙酸[Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid,EGTA]由美國(guó)英杰公司提供。

1.3 方法

1.3.1 中腸酶液的制備 取2～5齡梨星毛蟲幼蟲,用預(yù)冷的0.15 mol/L NaCl溶液沖洗蟲體,并在冰上快速解剖,收集其中腸。將收集樣品用生物組織研磨機(jī)在4 ℃勻漿,隨后在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min,收集上清液作為中腸蛋白酶粗提物。

1.3.2 中腸酶液蛋白濃度的測(cè)定 參照Bradford[13]方法,選取BSA(牛血清白蛋白)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,使用BCA(Bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒測(cè)定提取物中蛋白質(zhì)的濃度。利用酶標(biāo)儀測(cè)得吸光度,為保證樣品的吸光度值在特定范圍內(nèi)(標(biāo)準(zhǔn)曲線的1/2～2/3),將提取的中腸酶液稀釋至相同濃度,隨后檢測(cè)蛋白酶活性。

1.3.3 不同齡期幼蟲中腸蛋白酶活性的測(cè)定參照趙愛平等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)處理設(shè)定3組重復(fù)。

總蛋白酶活性測(cè)定:以20 mg/m L 的偶氮酪蛋白作為反應(yīng)底物,用0.15 mol/L 的NaCl溶液進(jìn)行配制。先后分別在1.5 m L的離心管中加入10μL的中腸酶液、90μL的0.1 mol/L反應(yīng)緩沖液Tris-HCl和100μL的偶氮酪蛋白溶液。隨后將混合液置于37 ℃恒溫水浴中孵育2 h,而后加入150μL預(yù)冷的20%(質(zhì)量與體積比)三氯乙酸終止酶促反應(yīng)。將最終反應(yīng)液在4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min。收集上清液200μL并加入到96孔板中,立即使用酶標(biāo)儀在415 nm處測(cè)量吸光度。

強(qiáng)堿性胰蛋白酶活性測(cè)定:以20 mg/m L 的BAPNA 作為反應(yīng)底物,用二甲基亞砜進(jìn)行底物溶液的配制。向96孔板中先分別加入90μL 0.1 mol/L KH2PO4/NaOH 緩沖液,再各加入10μL中腸酶液,最后加入100μL 20 mg/m L BAPNA底物。37 ℃下反應(yīng)20 min,在405 nm 處測(cè)定吸光值。

弱堿性胰蛋白酶活性測(cè)定:以2 mmol/L 的TAME 作為反應(yīng)底物,用0.15 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行配制。反應(yīng)體系同上,使用酶標(biāo)儀在247 nm 處測(cè)定吸光值。

胰凝乳蛋白酶活性測(cè)定:以1 mmol/L 的BTEE 作為反應(yīng)底物,用10%(體積比)的甲醇0.15 mol/L NaCl溶液配制。反應(yīng)過程同上,在256 nm 處測(cè)定吸光值。

1.3.4 抑制劑及激活劑對(duì)中腸蛋白酶活性的影響 激活劑種類及濃度分別為:5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MgCl2、5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L CaCl2、5 mmol/L EDTA、10 mmol/L EDTA、5 mmol/L EGTA、10 mmol/L EGTA。抑制劑種類及濃度分別為5 mmol/L DTT、10 mmol/L DTT、5 mmol/L PMSF、10 mmol/L PMSF、2 mmol/L TPCK、4 mmol/L TPCK、1 mmol/L TLCK、2 mmol/L TLCK、5 μg/m L STI、10μg/m L STI、5 mmol/L IAA、10 mmol/L IAA。dd H2O 作為對(duì)照,每組處理重復(fù)3次。總反應(yīng)體系包括100μL 反應(yīng)底物、10μL 抑制劑、10μL 中腸酶溶液、80μL 反應(yīng)緩沖液,隨后在30°C孵育15 min,用酶標(biāo)儀在不同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。其中,特異性底物、緩沖液和波長(zhǎng)均參照“1.3.3”中的方法。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 基于方差的正態(tài)性和同質(zhì)性假設(shè),對(duì)對(duì)照組和處理組之間的統(tǒng)計(jì)差異進(jìn)行方差分析,然后用LSD 和Tukey’s檢驗(yàn)其5%的顯著性。對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS Statistics 26.0和Origin 8.5進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同齡期梨星毛蟲幼蟲中腸蛋白酶活性

4種中腸蛋白酶活性在梨星毛蟲幼蟲不同齡期間差異顯著,且均在4 齡具有最高酶活性(圖1)。由圖1-A 可知,梨星毛蟲幼蟲中腸總蛋白酶在4齡具有最高活性,其次是5齡,且2齡幼蟲總蛋白酶活性顯著低于4齡。強(qiáng)堿性胰蛋白酶在梨星毛蟲幼蟲不同齡期間,其活性整體呈先上升后降低的趨勢(shì),在4齡時(shí)具有最高值,且顯著高于2齡酶活性(圖1-B)。弱堿性胰蛋白酶也在4齡具有最高酶活性,其次是3齡,2齡酶活性最低(圖1-C)。胰凝乳蛋白酶活性整體高于其余3種蛋白酶,在2.1～2.4 OD/(min·mg)范圍內(nèi)波動(dòng),變化趨勢(shì)和弱堿性胰蛋白酶相同,酶活性在4齡最大(圖1-D)?？梢?梨星毛蟲4齡幼蟲中腸總蛋白酶、強(qiáng)堿性胰蛋白酶、弱堿性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具有最高活性,2齡幼蟲的活性最低。

2.2 不同激活劑和抑制劑對(duì)中腸蛋白酶活性的影響

測(cè)定蛋白酶抑制劑和激活劑對(duì)梨星毛蟲4齡幼蟲中腸蛋白酶活性的影響,結(jié)果表明:總蛋白酶、強(qiáng)堿性胰蛋白酶、弱堿性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性差異較大,且激活劑一般對(duì)蛋白酶產(chǎn)生促進(jìn)作用,而抑制劑則對(duì)蛋白酶產(chǎn)生抑制作用,但當(dāng)濃度發(fā)生變化或作用對(duì)象不同時(shí),激活劑可能起到抑制作用,抑制劑也可能起到激活作用。

與對(duì)照組相比,各處理組對(duì)總蛋白酶活性均起到激活作用(圖2-A)。激活作用較好的處理組分別是10 mmol/L EGTA、2 mmol/L TPCK、5 mmol/L DTT。且除處理組DTT 與TPCK 外,其他試劑均為高濃度的激活作用大于低濃度,其中EGTA 處理組中,不同濃度的激活效果差異最大。

強(qiáng)堿性胰蛋白酶測(cè)定結(jié)果表明,對(duì)其產(chǎn)生抑制作用的試劑由強(qiáng)到弱依次為5 mmol/L CaCl2、5 mmol/L EGTA、10 mmol/L PMSF、5 mmol/L PMSF、10 mmol/L EGTA(圖2-B)。其余試劑均對(duì)強(qiáng)堿性胰蛋白酶產(chǎn)生激活作用,激活作用最強(qiáng)的為5 mmol/L DTT 和10 mmol/L DTT。研究中還發(fā)現(xiàn),CaCl2在高濃度時(shí)表現(xiàn)激活作用,低濃度時(shí)則表現(xiàn)抑制作用,與之相反的是IAA,在低濃度表現(xiàn)激活作用,在高濃度則與對(duì)照組差異不大。

除5 mmol/L DTT 外,其余所有試劑均對(duì)弱堿性胰蛋白酶產(chǎn)生激活作用(圖2-C)。激活作用較好的依次為4 mmol/L TPCK、2 mmol/L TLCK、1 mmol/L TLCK、10 mmol/L IAA、2 mmol/L TPCK。5 mmol/L EGTA、5 mmol/L DTT 和5 mmol/L PMSF 處理組與對(duì)照組激活作用差異不顯著。其次,除EGTA 的兩個(gè)處理組外,其余處理組都隨著濃度的增大,弱堿性胰蛋白酶活性增大,即濃度越大激活作用越強(qiáng)。

對(duì)于胰凝乳蛋白酶活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn),僅EGTA 與DTT 的兩個(gè)處理組對(duì)胰凝乳蛋白酶具有抑制作用,其中高濃度的10 mmol/L EGTA 抑制效果最顯著,DTT 則是低濃度處理組的抑制效果較好(圖2-D)。激活作用效果較好的依次為,4 mmol/L TPCK、2 mmol/L TPCK、2 mmol/L TLCK、10 mmol/L IAA、10 mmol/L CaCl2。其中TPCK 處理組具有較高的激活作用。

經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn),所有試劑對(duì)總蛋白酶均表現(xiàn)激活作用,CaCl2、PMSF、EGTA 對(duì)強(qiáng)堿性胰蛋白酶均有抑制作用,其中效果最佳的為5 mmol/L CaCl2,在弱堿性胰蛋白酶活性研究中發(fā)現(xiàn),僅有5 mmol/L DTT 具有抑制作用,EGTA 和DTT對(duì)胰凝乳蛋白酶均有抑制效果,抑制活性最高的為10 mmol/L EGTA。

3 討論

由于昆蟲在不同發(fā)育階段的生理代謝具有差異性,進(jìn)而表現(xiàn)為中腸蛋白酶活性也具有一定差異[15]。樊艷平等[16]測(cè)定了不同齡期的綠豆象Callosobruchus chinensis幼蟲中腸各種蛋白酶的活性,發(fā)現(xiàn)隨齡期的升高,酶活性越大。曾紀(jì)嵐等[17]的研究表明:4種中腸蛋白酶(總蛋白酶、強(qiáng)堿性胰蛋白酶、弱堿性胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)活性隨甜菜夜蛾幼蟲齡期的升高而降低,這與樊艷平等[16]的報(bào)道不同。本研究結(jié)果表明,梨星毛蟲幼蟲在4齡時(shí)中腸蛋白酶活性最高,2齡最低,與曾紀(jì)嵐等[17]的研究結(jié)果一致。梨星毛蟲幼蟲在4齡生長(zhǎng)發(fā)育較為旺盛,具有較強(qiáng)的取食能力,進(jìn)而消化酶活性較高,因此4齡中腸蛋白酶活性均高于其他齡期。5齡幼蟲準(zhǔn)備進(jìn)入化蛹階段,取食量有所下降,導(dǎo)致其生理代謝活動(dòng)減弱,中腸蛋白酶活性降低。以上結(jié)果說明梨星毛蟲幼蟲中腸蛋白酶活性的變化與其生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。

不同蛋白酶抑制劑對(duì)昆蟲中腸蛋白酶抑制作用差異顯著。有研究表明[18],不同抑制劑對(duì)稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis幼蟲蛋白酶活性的抑制作用不同,PMSF、TLCK、E-64、Pepstatin A、Leupeptin抑制總蛋白酶活性;PMSF 顯著降低胰凝乳蛋白酶活性;EDTA、PMSF、TPCK、TLCK、E-64顯著降低胰蛋白酶活性。在研究不同蛋白酶抑制劑對(duì)小菜蛾P(guān)lutella x ylostella中腸蛋白酶活性影響時(shí)發(fā)現(xiàn)[19],CaCl2、EDTA 和EGTA 僅抑制胰蛋白酶;PMSF、TLCK、TPCK、STI和PMSF 抑制總蛋白酶、強(qiáng)堿性胰蛋白酶、弱堿性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;TLCK 抑制總蛋白酶和強(qiáng)堿性胰蛋白酶,而TPCK 只激活強(qiáng)堿性胰蛋白酶的活性;STI對(duì)所有的蛋白酶都有抑制作用。本研究中大部分試劑對(duì)梨星毛蟲4齡幼蟲中腸蛋白酶起激活作用,僅少部分試劑具有抑制作用。所有試劑對(duì)總蛋白酶均表現(xiàn)為激活作用,對(duì)強(qiáng)堿性胰蛋白酶抑制作用最高的為5 mmol/L CaCl2,僅有5 mmol/L DTT 對(duì)弱堿性胰蛋白酶有抑制作用,對(duì)胰凝乳蛋白酶抑制效果最佳的為10 mmol/L EGTA。本研究與前人結(jié)果差異原因可能是梨星毛蟲的中腸蛋白酶對(duì)抑制劑具有選擇性,即某種抑制劑對(duì)其他昆蟲具有抑制作用,但對(duì)梨星毛蟲卻具有激活作用。另外,也可能與昆蟲對(duì)抑制劑的敏感程度有關(guān)。有研究者[20-21]發(fā)現(xiàn),只有斜紋夜蛾的1齡幼蟲在飼喂含有大豆胰蛋白酶抑制劑的飼料時(shí)生長(zhǎng)速度降低,但整體發(fā)育僅延遲大約1 d,同樣,在對(duì)馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata的研究中也發(fā)現(xiàn),僅有1齡、2齡幼蟲對(duì)水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑敏感。

同種抑制劑在不同濃度抑制作用差異較大。對(duì)美洲條螟Diatraea saccharalis的研究表明,隨著抑制劑Ap TI濃度的增加,胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性均呈下降趨勢(shì)[22]。本研究發(fā)現(xiàn),在總蛋白酶中,除處理組DTT 與TPCK 外,其他試劑均為高濃度的激活作用大于低濃度;在強(qiáng)堿性胰蛋白酶中,CaCl2在高濃度時(shí)表現(xiàn)激活作用,低濃度時(shí)則表現(xiàn)抑制作用,與之相反的是試劑IAA 在低濃度表現(xiàn)激活作用,在高濃度則與對(duì)照組差異不大。其差異原因可能在于不同昆蟲間具有物種差異性,且不同抑制劑處理組的抑制活性本身差異較大,不同濃度作用于昆蟲中腸蛋白酶時(shí)就會(huì)產(chǎn)生不同的作用效果。本研究結(jié)果顯示:低濃度的CaCl2對(duì)強(qiáng)堿性胰蛋白酶有較強(qiáng)的抑制作用,高濃度CaCl2則起激活作用。可能與不同濃度下鈣離子與目標(biāo)蛋白酶活性位點(diǎn)的結(jié)合情況不同有關(guān)。

由于昆蟲在進(jìn)化過程中形成了不同的取食習(xí)性,因此,發(fā)揮主要功能的中腸蛋白酶也具有差異。例如,鞘翅目和半翅目?jī)A向于利用半胱氨酸蛋白酶,而膜翅目、雙翅目、鱗翅目和直翅目?jī)A向于利用絲氨酸蛋白酶[23]。本研究結(jié)果表明,強(qiáng)堿性胰蛋白酶的活性在梨星毛蟲幼蟲各齡期整體偏高,說明梨星毛蟲主要傾向于利用強(qiáng)堿性胰蛋白酶進(jìn)行消化吸收。

4 結(jié)論

本研究測(cè)定出梨星毛蟲幼蟲4齡的中腸蛋白酶具有最高酶活性,在此齡期進(jìn)行抑制劑篩選發(fā)現(xiàn),不同濃度及種類試劑對(duì)4種中腸蛋白酶活性影響差異顯著,所有試劑對(duì)總蛋白酶均表現(xiàn)為激活作用,5 mmol/L CaCl2對(duì)強(qiáng)堿性胰蛋白酶抑制作用最高,僅5 mmol/L DTT 對(duì)弱堿性胰蛋白酶有抑制作用,對(duì)胰凝乳蛋白酶抑制效果最佳的為10 mmol/L EGTA。本試驗(yàn)為后續(xù)抑制劑對(duì)梨星毛蟲的體內(nèi)活性作用的研究提供了參考依據(jù),便于明確抑制劑對(duì)梨星毛蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響,為以中腸蛋白酶為靶標(biāo),研發(fā)含抑制劑的生物源藥劑或轉(zhuǎn)基因作物的綠色防控提供參考。