田守潤(rùn)，勾艷芳，王錦哲，樊芮伽，唐歷波

1.海南醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，海南 ?？?570145；

2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)院，海南 ?？?570145

肝是機(jī)體中最大的消化腺，由肝細(xì)胞和多種不同種類的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成[1]，承擔(dān)著重要的生理功能，肝細(xì)胞是肝組織的基本單位，占肝臟總質(zhì)量的60%～80%[2]，是肝臟完成生理功能的基礎(chǔ)[3]。肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)具有一定的歷史。目前，原代肝細(xì)胞分離提取方法主要有組織塊法、膠原酶原位灌注法、Seglen兩步膠原酶灌注法[4]。國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣的方法是Seglen兩步灌注法[5]分離培養(yǎng)原代肝細(xì)胞，可分離成體肝組織細(xì)胞，為肝細(xì)胞分離培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)，但步驟繁瑣，一般實(shí)驗(yàn)室難于完成。王珊等[6]比較了3種不同培養(yǎng)條件下原代小鼠肝細(xì)胞的形態(tài)以及肝細(xì)胞功能，尋找出了適合于原代小鼠肝細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，即：發(fā)現(xiàn)了小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)基中加入二甲基亞砜(DMSO)對(duì)于維持肝細(xì)胞的形態(tài)和功能有促進(jìn)作用，為體外原代肝細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立和優(yōu)化提供了實(shí)用的方法。但是由于可重復(fù)性差以及個(gè)體差異性而無(wú)法全面推廣。因此，如何找到一種簡(jiǎn)便且普及較好方法有待研究。小鼠肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定是肝組織工程的基礎(chǔ)，在人工肝構(gòu)建、體外藥物測(cè)試模型構(gòu)建以及3D打印可移植肝組織等方面具有重要作用。許多實(shí)驗(yàn)室在經(jīng)典的兩步法培養(yǎng)肝細(xì)胞的基礎(chǔ)上不斷簡(jiǎn)化優(yōu)化培養(yǎng)方法[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用簡(jiǎn)單的膠原酶分離法，對(duì)培養(yǎng)的肝細(xì)胞克隆進(jìn)行篩選，分離得到小鼠肝細(xì)胞克隆，免疫組化鑒定結(jié)果表明，利用簡(jiǎn)易膠原酶消化法可獲得原代肝細(xì)胞，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器及材料高糖-DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，北京)，Ⅰ型膠原酶(Sigma公司，布宜諾斯艾利斯，阿根廷)，12、96孔培養(yǎng)板(NUNC公司，丹麥)，小鼠抗大鼠CK-19熒光抗體(1∶10 BOSTER公司，美國(guó))，WST-1試劑盒(Abcam公司，英國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國(guó))。實(shí)驗(yàn)材料為2～3日齡小鼠，雌雄不限，由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法將1日齡小鼠用70%酒精浸泡1 min消毒，移入超凈臺(tái)，在培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪碎小鼠肝臟，生理鹽水沖洗血液至組織發(fā)白，在冰浴條件下放置于預(yù)冷的磷酸鹽緩沖(PBS)溶液中剪碎肝組織至勻漿狀，PBS沖洗兩次，加入3倍體積的0.1%膠原酶Ⅰ，37℃下消化1 h，加入含10%的胎牛血清(FBS)高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打成懸液200目篩網(wǎng)，1 000 r/min離心5 min，沉淀用培養(yǎng)液重懸，按104/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。3 d后達(dá)80%密度時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 免疫化學(xué)染色鑒定小鼠肝細(xì)胞將培養(yǎng)3～4代的細(xì)胞收集，按106/mL濃度接種至小腸黏膜脫細(xì)胞基質(zhì)膜上，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗3次，滴加CK-19熒光抗體室溫下染色30 min傾去存留的熒光抗體，PBS清洗3次，在熒光顯微鏡下鏡檢觀察。

1.2.3 細(xì)胞成活率及生長(zhǎng)曲線測(cè)定0.4%臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)分離肝細(xì)胞的成活率，倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)未染色的活細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例即為細(xì)胞成活率。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定：利用24孔板分別接種原代肝細(xì)胞，分別培養(yǎng)1～14 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取三孔棄去培養(yǎng)基，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基加20 μL WST-1，培養(yǎng)2 h，每孔吸取180 μL至96孔板，在酶標(biāo)儀中450 nm下得到吸光度值A(chǔ)450，該吸光度值與細(xì)胞增殖數(shù)成正比，從而得到肝細(xì)胞增殖曲線。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代肝細(xì)胞鏡下觀察初次分離的原代肝細(xì)胞呈卵圓形，核大，邊緣清晰透亮(圖1)，48 h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞變成長(zhǎng)梭形(圖2、圖3)，5～7 d達(dá)到80%生長(zhǎng)密度，細(xì)胞呈鋪路石狀排列(圖4)。8 d后有死細(xì)胞產(chǎn)生并漂浮在培養(yǎng)液中。

圖1 原代分離小鼠肝細(xì)胞(400×)

圖2 48 h肝卵圓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)(400×)

圖3 貼壁生長(zhǎng)肝細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形(400×)

圖4 7 d肝細(xì)胞呈鋪路石狀排列(400×)

2.2 小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)成活率臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)表明，1 g小鼠肝臟可分離肝細(xì)胞1.2×105，原代分離活細(xì)胞比例為72%。

2.3 原代肝細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)通過(guò)生長(zhǎng)曲線繪制可知，原代肝細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，有一個(gè)快速增長(zhǎng)期，一般在5～7 d后達(dá)到增殖高峰，隨后增殖能力逐漸下降(圖5)，若繼代培養(yǎng)，可恢復(fù)增殖能力，一般3～5代增殖能力最強(qiáng)。

圖5 小鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制

2.4 小鼠肝細(xì)胞與膜復(fù)合將3～5代肝細(xì)胞按1×106個(gè)/mL細(xì)胞濃度以滴加法滴注到豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)膜(以下簡(jiǎn)稱：SIS)，按0.1 mL/cm2將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞與SIS復(fù)合，肝細(xì)胞在膜上能夠分裂增殖(圖6、圖7)。免疫熒光染色表明，小鼠肝細(xì)胞可以在SIS膜上生長(zhǎng)(圖8)。

圖6 肝細(xì)胞與SIS復(fù)合(40×)

圖7 肝細(xì)胞在SIS上分裂增殖(40×)

圖8 CK-19免疫熒光染色，示肝細(xì)胞在SIS膜上生長(zhǎng)(40×)

3 討論

中國(guó)是肝病大國(guó)，包括乙肝、肝癌、肝損傷等引發(fā)的急性肝衰竭威脅著人類的健康。分離培養(yǎng)肝細(xì)胞是肝組織工程及人工肝系統(tǒng)制備的基礎(chǔ)。小鼠是模式生物，體外分離培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)、毒理學(xué)、異種人工肝系統(tǒng)研制以及藥理學(xué)等方面具有重要意義。肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法多種多樣，其中，經(jīng)典的膠原酶兩步灌流法是肝細(xì)胞分離培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。但此法的缺點(diǎn)是所需膠原酶量大、成本高。一次性灌注消化一只成年大鼠肝臟需要75～100 mg膠原酶，浪費(fèi)嚴(yán)重，而且需要蠕動(dòng)泵[10-12]等，同時(shí)由于處理時(shí)間長(zhǎng)，容易出現(xiàn)返流而造成培養(yǎng)污染，獲得的分裂細(xì)胞為處于靜息期的肝成體細(xì)胞，分裂傳代能力有限，限制了該方法的廣泛利用[13]。李素婷等[14]采用組織塊方法分離培養(yǎng)小鼠肝組織細(xì)胞，肝細(xì)胞從組織塊周邊爬出，成活率較高，操作方法簡(jiǎn)單，但細(xì)胞爬出困難，數(shù)量有限，細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)，難以形成細(xì)胞的群落效應(yīng)?，F(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的Wnt信號(hào)通路中有19種蛋白參與了細(xì)胞生長(zhǎng)分化和胚胎形成及腫瘤發(fā)生過(guò)程[15]。彭利等[16]證實(shí)Wnt3a能夠誘導(dǎo)HP14-19向成熟肝細(xì)胞分化。為肝細(xì)胞原代培養(yǎng)提供了又一新進(jìn)展。因此，運(yùn)用CK19免疫熒光可以鑒定肝細(xì)胞向成熟化分化的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)采用眼科剪在冰浴條件下剪碎肝組織，用膠原酶消化組織并釋放出肝細(xì)胞，方法簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，同時(shí)細(xì)胞存活率較高，適合于一般實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)肝細(xì)胞。但缺陷也是顯而易見(jiàn)的：酶消化時(shí)間難以掌握，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易造成細(xì)胞的損傷死亡，時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞難以從組織中解離出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)與經(jīng)典的兩步灌流法相比，雖然細(xì)胞純度和細(xì)胞存活率都較低，但對(duì)普通實(shí)驗(yàn)室分離肝細(xì)胞是一個(gè)很好的選擇方法。

新生小鼠肝組織含有多種類型細(xì)胞，血細(xì)胞會(huì)影響肝細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，在冰浴上剪碎組織塊后通過(guò)簡(jiǎn)單的離心處理，即可分離脫除肝組織中的血細(xì)胞。眼科剪的剪切力會(huì)對(duì)部分細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用，但剪切主要破壞細(xì)胞外基質(zhì)，更有利于肝卵圓細(xì)胞從組織中釋放出來(lái)。肝組織中細(xì)胞種類較多，包括各種類型肝干細(xì)胞、肝星形膠質(zhì)細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞。分離純化肝干細(xì)胞方法有許多種，包括物理機(jī)械分離法、密度梯度離心法、免疫磁珠分離法以及熒光流式細(xì)胞分選法。本實(shí)驗(yàn)采用物理機(jī)械分離法去除造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，利用貼壁快慢差異，并結(jié)合克隆篩選分離肝卵圓細(xì)胞，不斷傳代培養(yǎng)，雜細(xì)胞越來(lái)越少。利用CK-19免疫熒光染色證明分離到的克隆為肝卵圓細(xì)胞。

離體培養(yǎng)肝卵圓細(xì)胞具有接觸抑制現(xiàn)象，并形成鋪路石形狀。而本實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)分裂期的肝細(xì)胞接種至SIS膜上，使細(xì)胞能夠分裂生長(zhǎng)并形成立體結(jié)構(gòu)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，肝細(xì)胞在SIS膜上能夠正常分裂并形成細(xì)胞克隆。細(xì)胞在膜上生長(zhǎng)并在三維立體空間中建立相互聯(lián)系是形成組織的前提，在骨組織工程研究中有一個(gè)“膜誘導(dǎo)再生理論”明確指出膜在形成組織中的作用[17]，而組織的形成本質(zhì)上是細(xì)胞的有序行為。生命科學(xué)的一大基礎(chǔ)難題就是有序性形成的機(jī)制，在分子水平，不同的生物大分子通過(guò)自組裝或分子間相互作用形成功能性分子；在細(xì)胞水平，通過(guò)細(xì)胞間通訊形成有功能的組織；而在生物個(gè)體水平，通過(guò)信息的交流和控制實(shí)現(xiàn)了生物的社會(huì)性。因此，體外在膜上開(kāi)展細(xì)胞間相互作用有助于揭示組織形成的奧秘。