張曉霞，陳勝玲，朱枝群，康春濤，徐建中

1.江蘇星海生物科技有限公司，江蘇 鹽城 224233；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院/工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

0 引言

L-賴氨酸是八大必需氨基酸之一，動(dòng)物和人自身均無法合成。L-賴氨酸廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料中，可平衡飼料中氨基酸的組成，提高動(dòng)物對(duì)氨基酸的攝取和代謝，促進(jìn)家畜、家禽、魚類等的生長發(fā)育，進(jìn)而提高飼料蛋白質(zhì)的利用率，節(jié)約生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染。谷類賴氨酸在加工過程中極易被破壞，致使飼料中的L-賴氨酸得率極低，故L-賴氨酸被稱為第一限制性氨基酸[1]。目前，全球L-賴氨酸年產(chǎn)量估計(jì)為2.2×106t，并以每年10%左右的速度增長，在世界范圍內(nèi)是除L-谷氨酸之外的第二大氨基酸[2]。目前，工業(yè)上用于發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的菌種主要有大腸桿菌(Escherichiacoli)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)。然而，將E.coli和C.glutamicum直接應(yīng)用于動(dòng)物飼料存在含內(nèi)毒素、適口性差等缺陷。自2013年起，國家規(guī)定的飼料添加劑目錄里已明文規(guī)定飼料級(jí)L-賴氨酸中不得含有E.coli，而市場上主要L-賴氨酸產(chǎn)品中L-賴氨酸的純度一般為65%或70%[3]。因此，亟需開發(fā)具有食品安全性的微生物底盤細(xì)胞用于發(fā)酵生產(chǎn)飼用L-賴氨酸。

益生菌因其綠色、無殘留、無污染的特性成為替代抗生素的最佳選擇之一，受到國內(nèi)外學(xué)者和飼料生產(chǎn)企業(yè)的廣泛關(guān)注[4]。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是芽孢桿菌屬的一種，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)、美國飼料管制協(xié)會(huì)(AAFCO)和我國農(nóng)業(yè)部認(rèn)定為飼料安全性菌株，廣泛應(yīng)用于飼料生產(chǎn)中[5]。B.subtilis產(chǎn)生的枯草菌素、多黏菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)對(duì)致病菌或易造成內(nèi)源性感染的條件致病菌具有明顯抑制作用[6]。同時(shí)，B.subtilis合成的消化性酶類(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶等)可降解飼料中的復(fù)雜碳水化合物，提高飼料消化率，提升動(dòng)物生長性能[7]。此外，B.subtilis能刺激動(dòng)物免疫器官的生長發(fā)育，激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力[8]。有研究[9]表明，B.subtilis可使生豬日增重提高6%～7%，飼料轉(zhuǎn)化率提高3%～4%，也能提高肉雞的抗氧化能力，進(jìn)而提高肉雞生長性能。此外，為了有效提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，通過紫外誘變或其他代謝方法改造B.subtilis，選育具有高產(chǎn)消化性酶類的突變菌株已成為B.subtilis發(fā)酵飼料的發(fā)展趨勢[10]。雖然B.subtilis作為益生菌廣泛用于飼料生產(chǎn)，但該菌株不能有效積累L-賴氨酸[11]，為了同時(shí)滿足家畜或家禽對(duì)L-賴氨酸和B.subtilis的需求，需要在飼料中同時(shí)添加上述兩種物質(zhì)，這不僅造成飼料生產(chǎn)工藝復(fù)雜化，還在一定程度上增加了企業(yè)生產(chǎn)成本。因此，實(shí)現(xiàn)B.subtilis高效合成L-賴氨酸有利于簡化飼料生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，提高企業(yè)的行業(yè)競爭力。

隨著B.subtilis基因組注釋的解析，B.subtilis發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的生物合成途徑和調(diào)節(jié)機(jī)制已較清晰。當(dāng)以葡萄糖為原料時(shí)，B.subtilis有5個(gè)途徑參與L-賴氨酸合成，分別是糖酵解途徑、磷酸戊糖(PP)途徑、三羧酸(TCA)循環(huán)、CO2固定反應(yīng)和L-賴氨酸終端合成途徑?，F(xiàn)階段，針對(duì)E.coli和C.glutamicum的代謝工程改造合成L-賴氨酸已有較多報(bào)道[12-14]，主要集中在以下幾個(gè)方面：1)解除合成途徑中的反饋調(diào)節(jié)，提高L-賴氨酸合成途徑的效率；2)阻斷副產(chǎn)物的支路代謝途徑，促進(jìn)多代謝流進(jìn)入L-賴氨酸合成途徑；3)強(qiáng)化合成途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)水平，提高L-賴氨酸前體物的供應(yīng)；4)拓寬菌株代謝底物譜，降低L-賴氨酸的生產(chǎn)成本；5)提高胞內(nèi)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的有效供應(yīng)水平，促進(jìn)L-賴氨酸高效合成。然而，針對(duì)B.subtilis的代謝工程改造合成L-賴氨酸卻鮮有報(bào)道。

基于此，本研究擬以飼料工業(yè)中常用的益生菌B.subtilisACCC11025為出發(fā)菌株，采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)磷酸戊糖途徑、L-賴氨酸終端合成途徑和L-賴氨酸競爭支路代謝途徑進(jìn)行重構(gòu)，以期獲得具有益生功能和L-賴氨酸高效合成功能的“雙功能”枯草芽孢桿菌重組菌株，為利用B.subtilis生產(chǎn)L-賴氨酸等飼用氨基酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

主要試劑：胰蛋白胨、酵母提取物，英國Oxoid公司產(chǎn)；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA聚合酶、DL1000 DNA Marker、甘露糖、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) ，南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶，日本TAKARA公司產(chǎn)；葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4等常規(guī)化學(xué)試劑，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)。

主要設(shè)備：DNA Engine型PCR儀、Biophotometer型核酸/蛋白電泳儀、Gel DOC GR+型凝膠成像儀、Micro Pulser型電穿孔儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)；BioPhotometer plus型核酸蛋白測定儀，德國Eppendorf公司產(chǎn)；Autotune超聲波細(xì)胞破碎儀，美國Sonics公司產(chǎn)；Allegra X-15R型冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司產(chǎn)；SBA40-E型生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院產(chǎn)。

1.2 菌株、質(zhì)粒和引物序列

實(shí)驗(yàn)用主要菌株和質(zhì)粒見表1，引物序列見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)用主要菌株和質(zhì)粒Table 1 The main strains and plasmids used in experiments

表2 實(shí)驗(yàn)用引物序列Table 2 The pimer pairs used in experiments

1.3 培養(yǎng)條件與培養(yǎng)基

于37 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)B.subtilis及其重組菌株。在特定條件下，添加質(zhì)量濃度為100 μg/mL的Amp或質(zhì)量濃度為50 μg/mL的Kan，用于篩選E.coli和B.subtilis重組菌株。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0。

SPⅠ培養(yǎng)基(20 mL)：9.8 mL SPⅠ-A鹽溶液(即Na3C6H5O7·2H2O 2 g/L，(NH4)2SO44 g/L，K2HPO4·3H2O 28 g/L，KH2PO412 g/L，0.1 MPa滅菌20 min);9.8 mL SPⅠ-B溶液(即MgSO4·7H2O 0.4 g/L，0.1 MPa滅菌20 min);200 μL 100×CAYE溶液(即酪蛋白水解物20 g/L，酵母提取物100 g/L，0.1 MPa滅菌20 min);200 μL葡萄糖溶液(500 g/L)。

SPⅡ培養(yǎng)基(6 mL)：5.88 mL SPⅠ培養(yǎng)基，60 μL CaCl2溶液(50 mmol/L)，60 μL MgCl2溶液(250 mmol/L)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，玉米漿35 g/L，甜菜糖蜜12 g/L，(NH4)2SO436 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，K2HPO41 g/L，KH2PO41 g/L，F(xiàn)eSO40.02 g/L，MnSO40.02 g/L，甜菜堿0.05 g/L，煙酰胺0.008 g/L，硫胺素0.000 45 g/L，生物素0.000 85 g/L,CaCO340 g/L。

所有培養(yǎng)基均用質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至 7.0～7.2，并于121 ℃滅菌20 min，發(fā)酵培養(yǎng)基于115 ℃滅菌10 min。

1.4 質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建方法

1.4.1 質(zhì)粒pHT01-Cas9的構(gòu)建以釀膿鏈球菌的基因組作為模板，使用引物Spcas9-F和Spcas9-R將基因Spcas9進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XamⅠ對(duì)質(zhì)粒pHT01和片段Spcas9進(jìn)行雙酶切并酶連，獲得目標(biāo)重組質(zhì)粒pHT01-Cas9。

1.4.2質(zhì)粒pBE980b-hom59、pBE980b-lysC311、pBE980b-zwf234、pBE980b-gnd361和pBE980b-ddh的構(gòu)建以質(zhì)粒pBE980b為模板，利用引物hom-F、hom-R、lysC-F、lysC-R、zwf-F、zwf-R、gnd-F、gnd-R、pksD-F和pksD-R通過反向PCR擴(kuò)增將20 bp的sgRNA無縫連接到質(zhì)粒pBE980b，獲得5個(gè)帶有靶向位點(diǎn)的質(zhì)粒。

以B.subtilisACCC11025基因組為模板，利用引物hom-L-F、hom-L-R、hom-R-F、hom-R-R、lysC-L-F、lysC-L-R、lysC-R-F、lysC-R-R、zwf-L-F、zwf-L-R、zwf-R-F、zwf-R-R、gnd-L-F、gnd-L-R、gnd-R-F、gnd-R-R、pksD-L-F、pksD-L-R、pksD-R-F和pksD-R-R分別對(duì)基因hom、lysC、zwf、gnd和pksD的上下同源臂進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以C.glutamicum為基因組，利用引物Cghom-F、Cghom-R、CglysC-F、CglysC-R、Cgzwf-F、Cgzwf-R、Cggnd-F、Cggnd-R、Cgddh-F和Cgddh-R分別擴(kuò)增基因hom、lysC、zwf、gnd和ddh。將回收后的同源臂片段和基因片段同時(shí)作為模板，通過融合PCR進(jìn)行基因融合，利用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)融合片段及帶有靶向位點(diǎn)的質(zhì)粒pBE980b進(jìn)行酶切和酶連，獲得重組質(zhì)粒pBE980b-hom59、pBE980b-lysC311、pBE980b-zwf234、pBE980b-gnd361和pBE980b-ddh。

1.4.3B.subtilis重組菌株的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pHT01-Cas9電轉(zhuǎn)化至B.subtilisACCC11025感受態(tài)細(xì)胞中，通過氨芐抗性篩選得到帶有Cas9蛋白的轉(zhuǎn)化子。將重組質(zhì)粒pBE980b-hom59、pBE980b-lysC311、pBE980b-zwf234、pBE980b-gnd361和pBE980b-ddh分別電轉(zhuǎn)化至帶有Cas9蛋白的B.subtilisACCC11025感受態(tài)細(xì)胞中。目標(biāo)重組菌株的具體篩選和鑒定參照A.J.Sachla等[15]的方法進(jìn)行。

1.5 分析方法

1.5.1 酶活性測定采用超聲波細(xì)胞破碎法處理細(xì)胞，離心后取上清液，獲得粗酶液[16]，將該粗酶液保存于-20 ℃?zhèn)溆没蛄⒓从糜诿富钚缘臏y定。參照J(rèn).Z.Xu等[17]的方法測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6GPD)和二氨基庚二酸脫氫酶(DapDH)的酶活性；參照許金坤等[18]的方法，采用吸光光度法測定高絲氨酸脫氫酶(HSD)的酶活性。

1.5.2 菌體生長情況測定參照J(rèn).Z.Xu等[17]的方法，每間隔2 h或4 h取200 μL發(fā)酵液，用0.25 mol/L的稀HCl溶液將其稀釋到5 mL，用紫外分光光度計(jì)于562 nm處測定吸光度(即OD562)。

1.5.3 葡萄糖含量和L-賴氨酸產(chǎn)量測定參照J(rèn).Z.Xu等[17]的方法，將發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，取上清液稀釋100倍后，通過生物傳感分析儀測定發(fā)酵液中葡萄糖含量和L-賴氨酸產(chǎn)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)考查實(shí)驗(yàn)因素，數(shù)據(jù)表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)重組菌株的篩選與鑒定結(jié)果分析

目標(biāo)重組質(zhì)粒和目標(biāo)重組菌株的驗(yàn)證如圖1所示，圖1a)中，泳道1 為pBE980b-gnd361雙酶切驗(yàn)證，泳道2 為pBE980b-lysC311雙酶切驗(yàn)證，泳道3為pBE980b-zwf234雙酶切驗(yàn)證，泳道4為pBE980b-hom59雙酶切驗(yàn)證，泳道5為pBE980b-ddh雙酶切驗(yàn)證，泳道M為DL10000 DNA Marker；圖1b)中，泳道1為B.subtilisACCC11025對(duì)照，泳道2為菌株XH3中基因gndPCR驗(yàn)證，泳道3為菌株XH4中基因gndPCR驗(yàn)證，泳道4為菌株XH2中基因zwfPCR驗(yàn)證，泳道5為菌株XH6中基因ddhPCR驗(yàn)證，泳道6為菌株XH1中基因lysCPCR驗(yàn)證，泳道7為菌株XH5中基因homPCR驗(yàn)證，泳道M為DL10000 DNA Marker。由圖1a)可知，所選擇的質(zhì)粒都帶有目標(biāo)片段，為目標(biāo)重組質(zhì)粒pBE980b-gnd361、pBE980b-lysC311、pBE980b-zwf234、pBE980b-hom59和 pBE980b-ddh。由圖1b)可知，通過對(duì)候選目標(biāo)菌株進(jìn)行目標(biāo)片段PCR驗(yàn)證，確定了目標(biāo)重組菌株XH1、XH2、XH3、XH4、XH5和XH6。

圖1 目標(biāo)重組質(zhì)粒和目標(biāo)重組菌株的驗(yàn)證Fig.1 Confirmation of target plasmids and recombinant strains

2.2 天冬氨酸激酶對(duì)L-賴氨酸終端合成途徑碳通量的影響分析

天冬氨酸激酶(Aspartokinase，AK)是催化L-天冬氨酸形成天冬氨酸磷酸的酶，是天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，也是L-賴氨酸生物合成過程中的第一個(gè)限速酶[3]。然而，在B.subtilis中，AK只有一個(gè)同功酶天冬氨酸激酶(AKⅢ)，由基因thrD編碼，其酶活力受L-賴氨酸和L-纈氨酸的協(xié)同反饋抑制和阻遏作用[19]。有研究[17]表明，將來源于C.glutamicum的AKⅢ氨基酸序列中的第311位氨基酸由蘇氨酸定點(diǎn)突變成異亮氨酸，可以解除L-賴氨酸的反饋抑制作用。為此，本研究首次將B.subtilis中的AKⅢ替換成來源于C.glutamicum的已解除反饋調(diào)節(jié)作用的AKⅢ(編碼基因lysC311)，以調(diào)節(jié)L-賴氨酸終端合成途徑的碳通量。lysC基因替換及替換后重組菌株的生長情況如圖2所示。由圖2a)可知，目標(biāo)重組菌株B.subtilisXH1已成功將自身AKⅢ編碼基因thrD替換成C.glutamicum中的lysC311。重組菌株B.subtilisXH1(XH0thrD::lysC311)可在添加有L-賴氨酸結(jié)構(gòu)類似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)的LB固體培養(yǎng)基中正常生長，而出發(fā)菌株B.subtilisXH0則不能生長(圖2b))。這表明，將B.subtilis中的thrD基因替換成lysC311基因成功解除了L-賴氨酸對(duì)AKⅢ的反饋調(diào)節(jié)作用。

圖2 lysC基因替換及替換后重組菌株生長情況Fig.2 Sequencing of lysC and the growth of different strains

課題組前期研究[17]發(fā)現(xiàn)，解除C.glutamicum中AKⅢ的反饋調(diào)節(jié)作用有利于強(qiáng)化L-賴氨酸終端合成途徑碳通量，從而促進(jìn)L-賴氨酸合成。為了考查來源于C.glutamicum中解除反饋調(diào)節(jié)作用的AKⅢ是否能在B.subtilis中表達(dá)，本研究對(duì)出發(fā)菌株和重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵并測定胞外L-賴氨酸產(chǎn)量。不同菌株L-賴氨酸產(chǎn)量和菌體生長情況如圖3所示。由圖3a)可知，重組菌株B.subtilisXH1在發(fā)酵16 h后開始逐漸向胞外分泌L-賴氨酸，發(fā)酵結(jié)束后(發(fā)酵40 h)胞外L-賴氨酸產(chǎn)量為(11.7±0.6)g/L。相反，出發(fā)菌株B.subtilisXH0在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)都沒有明顯積累L-賴氨酸的現(xiàn)象。由圖3b)可知，與出發(fā)菌株B.subtilisXH0相比，重組菌株B.subtilisXH1的菌體生長并未受到明顯抑制，最終菌體量(OD562=38.4±3.5)為出發(fā)菌株(OD562=37.5±4.1)的97.6%。這表明，將B.subtilis中的AKⅢ替換成來源于C.glutamicum的解除反饋調(diào)節(jié)的AKⅢ可以實(shí)現(xiàn)改造B.subtilis以促進(jìn)L-賴氨酸合成的目的。相似的結(jié)果也被魏佳等[20]報(bào)道，他們發(fā)現(xiàn),將來源于C.glutamicum的解除反饋調(diào)節(jié)作用的AKⅢ替換E.coli中的AKⅢ，有利于L-蘇氨酸的合成。

圖3 不同菌株L-賴氨酸產(chǎn)量和菌體生長情況Fig.3 L-lysine production and cell growth of different strains

2.3 G6PD和6GPD對(duì)PP途徑碳通量的影響分析

以葡萄糖為碳源時(shí)B.subtilis中L-賴氨酸的生物合成途徑如圖4所示，其中，每合成1分子的L-賴氨酸需要消耗4分子的輔酶因子NADPH；不同顏色的線條表示不同的合成途徑，紅色線條表示引入外源合成途徑；橢圓圈里是編碼基因，紅色圈表示替代基因；?表示基因替換；基因zwf編碼G6PD，基因gnd編碼6GPD，基因lysC編碼AKⅢ，基因hom編碼HSD，基因ddh編碼DapDH。對(duì)胞內(nèi)NADPH水平的調(diào)控已成為當(dāng)前菌種改造和發(fā)酵過程優(yōu)化的熱點(diǎn)之一。諸多文獻(xiàn)[1,3,14]指出，胞內(nèi)NADPH供給主要來源于PP途徑中的G6PD和6GPD。有文獻(xiàn)[21]報(bào)道，失活的PDHC有利于支鏈氨基酸中L-纈氨酸的合成，其原因是可以提高胞內(nèi)丙酮酸的供應(yīng)。然而，G6PD和6GPD的酶活性受到NADPH、ATP、果糖-1,6-二磷酸、甘油醛-3-磷酸、核酮糖-5-磷酸、赤蘚糖-4-磷酸等的反饋調(diào)節(jié)，從而影響PP途徑碳通量和NADPH供給[22]。為了強(qiáng)化PP途徑碳通量，提高L-賴氨酸合成所必需的NADPH供給量，本研究選擇來源于C.glutamicum的解除反饋調(diào)節(jié)作用的G6PD(編碼基因zwf234)和6GPD(編碼基因gnd361)替換菌株B.subtilisXH1中的野生型G6PD(編碼基因zwf)和6GPD(編碼基因gnd)，分別獲得重組菌株B.subtilisXH2(XH1zwf::zwf234)、B.subtilisXH3(XH1gnd::gnd361)和B.subtilisXH4(XH1zwf::zwf234gnd::gnd361)。不同重組菌株中G6PD和6GPD的酶學(xué)性質(zhì)見表3。由表3可知，與出發(fā)菌株相比，重組菌株XH2和XH4中的G6PD及重組菌株XH3和XH4中的6GPD對(duì)葡萄糖-6-磷酸(G6P)和NADP+的親和力都提高了。這表明，通過替換來源于C.glutamicum的解除反饋調(diào)節(jié)作用的G6PD和6GPD,可以解除菌株B.subtilisXH1中的野生型G6PD和6GPD的反饋調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響胞內(nèi)G6PD和6GPD的酶活力。

圖4 以葡萄糖為碳源時(shí)B.subtilis中L-賴氨酸的生物合成途徑Fig.4 The biosynthetic pathway of L-lysine from glucose in B.subtilis

表3 不同重組菌株中G6PD和6GPD的酶學(xué)性質(zhì)Table 3 Kinetic characterization of G6PD and 6GPD in different strains μmol/L

G6PD和6GPD是細(xì)胞內(nèi)NADPH再生的關(guān)鍵酶[1,3,14]，而胞內(nèi)NADPH水平又顯著影響L-賴氨酸的合成(圖4)[1,3]。不同菌株胞內(nèi)NADPH水平、L-賴氨酸產(chǎn)量和菌體生長情況如圖5所示。由圖5可知，由于不同重組菌株胞內(nèi)的G6PD和6GPD酶活性不同，菌體胞內(nèi)的NADPH水平也不同。胞內(nèi)G6PD和6GPD酶活力越高，胞內(nèi)NADPH水平也越高。由圖5a)可知，重組菌株B.subtilisXH4胞內(nèi)NADPH水平最高，從出發(fā)菌株B.subtilisXH1的(3.51×10-4)nmol/(104細(xì)胞)增加到(5.38×10-4)nmol/(104細(xì)胞)，胞內(nèi)NADPH/NADP+提高了43.2%。由圖5b)可知，重組菌株B.subtilisXH2、B.subtilisXH3和B.subtilisXH4胞外L-賴氨酸產(chǎn)量都顯著提升。重組菌株B.subtilisXH4搖瓶發(fā)酵40 h后積累了(20.3±1.9) g/L L-賴氨酸，比出發(fā)菌株B.subtilisXH1提高了73.5%。這些結(jié)果表明，引入外源的解除反饋調(diào)節(jié)的G6PD和6GPD可以強(qiáng)化PP途徑碳通量，從而有效提高胞內(nèi)NADPH供給水平，促進(jìn)L-賴氨酸的合成。諸多研究[1,3,14,22]也指出，強(qiáng)化E.coli或C.glutamicum中PP途徑碳通量，可以提高胞內(nèi)NADPH水平，從而提高NADPH依賴型產(chǎn)物的合成效率。由圖5c)可知，與出發(fā)菌株B.subtilisXH1相比，重組菌株表現(xiàn)出較差的菌體生長性能，尤其是重組菌株B.subtilisXH4。有研究[22]報(bào)道，引入外源的zwf234和gnd361不僅會(huì)顯著改變目標(biāo)產(chǎn)物合成量，還會(huì)顯著影響葡萄糖利用速率和菌體生長。因此，造成重組菌株菌體生長差的原因可能是由于更多的碳源用于L-賴氨酸合成而不是菌體生長。

圖5 不同菌株胞內(nèi)NADPH水平、L-賴氨酸產(chǎn)量和菌體生長情況Fig.5 Intracellular NADPH level, L-lysine production and cell growth of different strains

2.4 HSD對(duì)胞內(nèi)副產(chǎn)物積累的影響分析

天冬氨酸族氨基酸以草酰乙酸為前體物進(jìn)行生物合成，包括5種氨基酸，即L-天冬氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-蘇氨酸和L-異亮氨酸。由圖4可知，L-賴氨酸生物合成途徑中的重要中間物質(zhì)天冬氨酸半醛在HSD的催化作用下進(jìn)入L-賴氨酸生物合成的競爭途徑，從而影響L-賴氨酸生物合成。雖然通過失活HSD可以阻斷競爭途徑，但會(huì)使重組菌株成為營養(yǎng)缺陷型菌株，需要在發(fā)酵過程中額外添加高絲氨酸等物質(zhì)，增加生產(chǎn)成本[18]。為此，本研究通過在重組菌株B.subtilisXH4中調(diào)節(jié)HSD酶活力，嘗試將B.subtilis中的HSD(編碼基因hom)替換為來自C.glutamicum的滲漏型HSD(編碼基因hom59)以有效降低競爭途徑碳通量，獲得目標(biāo)重組菌株B.subtilisXH5(XH4hom::hom59)。不同菌株生長情況、L-賴氨酸產(chǎn)量和副產(chǎn)物積累量見表4。由表4可知，重組菌株B.subtilisXH5菌體生長性能表現(xiàn)出與菌株B.subtilisXH4相似的水平。需要指出的是，盡管重組菌株B.subtilisXH5的菌體量低于出發(fā)菌株B.subtilisXH0和B.subtilisXH1，但其L-賴氨酸產(chǎn)量遠(yuǎn)高于二者。重組菌株B.subtilisXH5中L-賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到(23.2±1.7) g/L，比菌株B.subtilisXH1和B.subtilisXH4分別增加了98.3%和14.3%。此外，隨著重組菌株HSD酶活力的降低，仍可促進(jìn)L-賴氨酸的合成，同時(shí)減少其他4種天冬氨酸族氨基酸的積累量。重組菌株B.subtilisXH5發(fā)酵液中未檢測到L-蛋氨酸、L-蘇氨酸和L-異亮氨酸，而菌株B.subtilisXH1和B.subtilisXH4在胞外都積累了一定量的副產(chǎn)物。這一結(jié)果表明，替換來源于C.glutamicum的滲漏型HSD，可以調(diào)節(jié)B.subtilis的胞內(nèi)HSD酶活力水平，從而有利于促進(jìn)L-賴氨酸合成、減少副產(chǎn)物積累。

表4 不同菌株生長情況、L-賴氨酸產(chǎn)量和副產(chǎn)物積累量Table 4 The cell growth， the concentration of L-lysine and by-products in different strains

2.5 外源DapDH對(duì)L-賴氨酸合成效率的影響分析

在已知的具有L-賴氨酸生物合成途徑的微生物和植物中，可以將L-賴氨酸生物合成劃分為兩個(gè)完全不同的途徑，即氨基乙二酸途徑(AAA)和二氨基庚二酸途徑(DAP)[1]。DAP是天冬氨酸族氨基酸合成途徑中的一部分，存在4種不同的變化形式用于合成內(nèi)消旋二氨基庚二酸，即脫氫酶途徑、琥珀酰化酶途徑、乙?；竿緩胶娃D(zhuǎn)氨酶途徑[23]。B.subtilis中只存在乙?；竿緩?，即以L-Δ1-四氫吡啶二羧酸為底物經(jīng)5步酶促反應(yīng)合成L-賴氨酸(圖4)。然而，一些革蘭氏陽性菌(如C.glutamicum)存在更為簡單的脫氫酶途徑，該途徑以L-Δ1-四氫吡啶二羧酸為底物經(jīng)2步酶促反應(yīng)即可合成L-賴氨酸[23]。為了提高B.subtilis合成L-賴氨酸的效率，本研究在菌株B.subtilisXH5中引入C.glutamicum中的DapDH(編碼基因ddh)，獲得重組菌株B.subtilisXH6(XH5pksD::ddh)。菌株XH5和XH6的菌體生長和L-賴氨酸合成情況如圖6所示。由圖6a)可知，與出發(fā)菌株B.subtilisXH5不同，重組菌B.subtilisXH6表現(xiàn)出菌體生長延滯，但兩者最終的菌體量基本一致。由圖6b)可知，重組菌株B.subtilisXH6在發(fā)酵初期(10 h)就開始積累L-賴氨酸，這可能是導(dǎo)致重組菌株B.subtilisXH6生長延滯的原因。重組菌株B.subtilisXH6中L-賴氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到(25.6±2.3)g/L，比菌株B.subtilisXH5增加了10.3%。這一結(jié)果表明，來源于C.glutamicum的DapDH可以調(diào)節(jié)B.subtilis中的DAP碳通量，引導(dǎo)部分碳流進(jìn)入脫氫酶途徑，從而促進(jìn)L-賴氨酸的合成。

圖6 菌株XH5和XH6的菌體生長和L-賴氨酸合成情況Fig.6 The cell growth and L-lysine production in XH5 and XH6 strains

3 結(jié)論

本研究首次以飼料工業(yè)中常用的益生菌B.subtilisACCC11025為出發(fā)菌株，圍繞胞內(nèi)前體物和輔酶因子NADPH供應(yīng)、副產(chǎn)物積累和優(yōu)化終端合成途徑對(duì)L-賴氨酸合成的影響，采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)磷酸戊糖途徑、L-賴氨酸終端合成途徑和L-賴氨酸競爭支路代謝途徑進(jìn)行重構(gòu)，獲得一株枯草芽孢桿菌重組菌株。結(jié)果表明，將B.subtilis中內(nèi)源的參與L-賴氨酸合成的關(guān)鍵性酶替換成來源于C.glutamicum中的解除反饋調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵性酶(AKⅢ、G6PD和6GPD)，可有效為合成L-賴氨酸提供前體物和輔酶因子NADPH，保證在B.subtilis中有效積累L-賴氨酸。此外，將B.subtilis中L-賴氨酸合成支路途徑中的限速酶HSD替換成來源于C.glutamicum中的滲漏型HSD，可實(shí)現(xiàn)在不影響菌體生長的情況下降低副產(chǎn)物積累，從而保證在B.subtilis中高效清潔發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在B.subtilis中引入來自C.glutamicum的脫氫酶途徑，可以引導(dǎo)碳流進(jìn)入脫氫酶途徑，從而促進(jìn)L-賴氨酸的高效合成。經(jīng)上述對(duì)B.subtilis基因組進(jìn)行的一系列遺傳改造，最終獲得的重組菌株B.subtilisXH6中L-賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到(25.6±2.3) g/L。重組菌株B.subtilisXH6經(jīng)10次傳代培養(yǎng)后仍然具有穩(wěn)定的L-賴氨酸產(chǎn)量，這些結(jié)果表明重組菌株B.subtilisXH6具有良好的遺傳穩(wěn)定性。此外，重組菌株B.subtilisXH6的出發(fā)菌株為飼料工業(yè)常用的益生菌B.subtilisACCC11025，因此重組菌株B.subtilisXH6保留了出發(fā)菌株的益生功能。綜上所述，B.subtilisXH6即為兼具益生功能和L-賴氨酸高效合成功能的“雙功能”枯草芽孢桿菌重組菌株。