劉延波，魏蒙蒙，王琳琳，王賢，沈祥坤，韓素娜，張立新，潘春梅

1.河南仰韶酒業(yè)有限公司 博士后科研工作站，河南 澠池 472400；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品與生物工程學院(酒業(yè)學院)/河南省白酒風格工程技術研究中心/鄭州市白酒釀造微生物技術重點實驗室，河南 鄭州 450046；3.河南大學 生命科學學院，河南 開封 475004；4.賒店老酒股份有限公司，河南 社旗 473300；5.河南省食品工業(yè)科學研究所有限公司，河南 鄭州 450003

0 引言

大曲是白酒釀造過程中的重要物質[1]，是一種同時含有微生物菌系、微生物酶系和復合曲香物質的微生態(tài)制品[2]，在大曲酒釀造過程中可同時作為糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑[3]，其品質是影響白酒品質的重要因素[4]。平板曲呈塊狀或磚狀，其表面和內(nèi)部均形成了有益的釀酒微生物群系[5]；包包曲中間凸起的“包包”部位表面積大、結構疏松、氣泡厚實，可形成高溫區(qū)域[6]。大曲的制作受原料、環(huán)境的影響較大，故其中的微生物菌群十分復雜[7]。微生物的代謝產(chǎn)物及原料的分解產(chǎn)物直接或間接地構成了白酒的風味成分，這些風味成分不僅有助于研究白酒的香氣成分，而且有助于判別大曲的品質[8]。大曲中的許多微量香氣成分(如己酸、己酸乙酯、乙酸乙酯等)與基礎白酒中的香氣成分相似[9]。微生物中的霉菌具有糖化、液化、蛋白分解等水解能力及酯化能力[10]，而酵母菌具有酒精發(fā)酵能力及產(chǎn)酯能力，二者對白酒中酒精及香味成分的產(chǎn)生均起著十分重要的作用[11]。

大曲是固體狀態(tài)，提取其風味成分的難度比液體狀態(tài)的白酒更大。頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術可對食品揮發(fā)性或難揮發(fā)性風味成分進行富集，并對混合成分進行鑒定或定性定量分析，具有操作簡便、高效、準確、無需有機溶劑等優(yōu)點，是目前應用較廣泛的風味成分分析方法[12]。高通量測序技術具有數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高、分析全面、靈敏、快速等特點，可定性和定量揭示樣品微生物群落組成和多樣性信息[13]，是分析復雜微生物群落結構的有效手段[14-15]。G.M.Fu等[16]使用Illumina MiSeq測序及HS-SPME-GC-MS技術分析了不同季節(jié)生產(chǎn)的茶味大曲的微生物群落結構及揮發(fā)性風味成分，確定了該類大曲的最佳生產(chǎn)季節(jié)；G.S.Fan等[17]利用上述技術表征了不同存放時間清香型白酒大曲的揮發(fā)性風味成分和微生物群落結構，發(fā)現(xiàn)老化有助于酯化活性的穩(wěn)定。

河南地區(qū)酒企主要使用平板曲，但近年來，包包曲的應用比例逐年上升，而針對包包曲的研究相對較少，且對包包曲和平板曲的揮發(fā)性風味成分、真菌群落結構和釀酒優(yōu)勢的對比研究也較少?；诖?，本研究擬利用HS-SPME-GC-MS和高通量測序技術，分析河南地區(qū)濃香型白酒包包曲和平板曲的揮發(fā)性風味成分及真菌群落結構，以期為河南地區(qū)大曲的選用與制作、濃香型白酒品質的提升及創(chuàng)新性發(fā)展提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大曲樣品包包曲和平板曲樣品，均取自賒店老酒股份有限公司濃香型白酒釀酒生產(chǎn)用曲。在包包曲和平板曲曲垛的上、中、下層各取1塊，將3塊大曲的曲心、曲皮混勻，粉碎過20目篩，存放于無菌采樣袋中，分別標號為A1和B1，于-80 ℃冰箱存放，備用。

1.1.2 主要試劑DNeasy PowerSoil Pro Kit試劑盒，德國Qiagen公司產(chǎn)；QubitTMssDNA檢測試劑盒、2×Rapid Taq Master Mix，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)；MagicPure Size Selection DNA Beads 試劑盒，北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)。

1.2 主要儀器與設備

7890B-5977A型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)；Pico-21型臺式離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)；TT-2500-VM型漩渦混合器，北京金恒祥儀器有限公司產(chǎn)；ZX-30型混勻型干式恒溫器，北京開源國創(chuàng)科技有限公司產(chǎn)；T100TMThermal Cyeler型 PCR儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)；Research plus移液器(0.5～10.0 μL)，美國Eppendorf公司產(chǎn)；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21型電泳槽，北京市六一生物科技有限公司產(chǎn)；ZF-258型凝膠成像分析系統(tǒng)，上海嘉鵬科技有限公司產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 揮發(fā)性風味成分檢測HS-SPME條件：準確稱取3.0 g大曲樣品置于20 mL頂空瓶中；孵化爐溫度為60 ℃，孵化10 min；萃取40 min；進樣口溫度為260 ℃，解吸2 min后，自動進行GC-MS分析。

GC條件：色譜柱為HP-FFAP(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；不分流，流速為1.21 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；升溫程序為40 ℃穩(wěn)定3 min，以5 ℃/min升至60 ℃，再以8 ℃/min升至230 ℃并穩(wěn)定7 min。

MS條件：接口溫度為220 ℃；電離方式為電子電離(EI)源；電子能量為70 eV；離子源溫度為200 ℃。

1.3.2 真菌DNA提取及高通量測序根據(jù)DNeasy PowerSoil Pro Kit試劑盒使用說明書進行真菌DNA提取，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

PCR擴增真菌ITS區(qū)基因，引物為ITS1F(5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN (barcode) CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GTGACTG-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTT-CATCGATGC-3′)。PCR擴增條件參照文獻[18]，并對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增產(chǎn)物堿基長度為400 bp左右，與目標產(chǎn)物長度一致，使用MagicPure Size Selection DNA Beads試劑盒回收該產(chǎn)物，并利用Illumina公司Miseq PE 300測序平臺進行高通量測序。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)分析去除序列引物接頭序列，將成對的reads拼接成一條序列，按barcode標簽序列識別并區(qū)分樣品后對數(shù)據(jù)進行質控過濾。對真菌群落結構進行OTU(操作分類單元)分析(http:∥drive5.com/usearch/manual/singletons.html)、α多樣性分析、物種分類學分析、物種豐度差異分析等。

2 結果與分析

2.1 包包曲和平板曲的揮發(fā)性風味成分分析

通過HS-SPME-GC-MS技術檢測包包曲和平板曲中的揮發(fā)性風味成分，并進行半定量分析。包包曲和平板曲的揮發(fā)性風味成分見表1。由表1可知，共檢測到24種揮發(fā)性風味成分，包括7種醇類化合物、4種酯類化合物、1種酮類化合物、1種醛類化合物、4種酸類化合物、3種酚類化合物和4種碳氫化合物。包包曲中共檢測出17種揮發(fā)性風味成分，平板曲中共檢測出19種揮發(fā)性風味成分。

表1 包包曲和平板曲的揮發(fā)性風味成分Table 1 The volatile flavor components of bag Daqu and the brick Daqu

酯類化合物中的3-苯丙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、己二酸雙(2-丁氧基乙)酯，酮類化合物中的3-叔-丁基-2-吡唑啉-5-酮，酸類化合物中的醋酸、己酸、辛酸、棕櫚酸，醇類化合物中的苯乙醇，酚類化合物中的對甲酚、2,4-二叔丁基苯酚，以及碳氫化合物中的2,5-二甲基正己烷-2,5-二甲羥基過氧化物在包包曲中的相對含量均高于平板曲。3-苯丙酸乙酯是具有中等強度水果蜂蜜香的芳香活性酯[19-20]。

己二酸雙(2-丁氧基乙)酯存在于酒、醋及其他發(fā)酵食品中，高濃度時對細菌具有抑制作用，低濃度時可作為碳源刺激真菌生長與繁殖[21]。棕櫚酸乙酯、醋酸、己酸、辛酸、苯乙醇是濃香型白酒中的關鍵香氣成分[22]，其中棕櫚酸乙酯為淺黃色油狀液體，呈微弱蠟香、果香和奶油香氣[23]；醋酸對濃香型白酒風味具有積極的影響，是酯類的重要前體物質，但過多的醋酸可能會使?jié)庀阈桶拙飘a(chǎn)生酸味[24]；己酸在微生物催化的酯化作用下能產(chǎn)生濃香型白酒的主體香己酸乙酯，對濃香型白酒品質具有重要作用[25]；辛酸是辛酸乙酯的重要前體物質，微量的辛酸乙酯在濃香型白酒中具有較明顯的水果香[26]；苯乙醇具有甜面包和玫瑰香氣[27]。2,4-二叔丁基苯酚是一類具有抗真菌活性的抗氧化劑[24]，其在包包曲中的相對含量高于平板曲，可能對包包曲真菌群落限制較大，這一猜想將通過后文關于真菌群落多樣性和豐度的數(shù)據(jù)加以證實。

酯類化合物中的乙酸龍腦酯，醛類化合物中的癸醛，醇類化合物中的正己醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基己醇、辛醇、(-)-4-萜品醇、DL-薄荷醇，酚類化合物中的苯酚，以及碳氫化合物中的1,4-二乙基苯、2,3,5,6-四甲基吡嗪、萘在平板曲中的相對含量均高于包包曲。其中，乙酸龍腦酯具有殺蟲、抗炎、抗腫瘤、提高心血管活性、止痛、止瀉、改善記憶等藥理作用[28]；癸醛只在平板曲中檢出，其具有脂香，低濃度時呈花香[29]。包包曲中酯類揮發(fā)性風味成分的種類多于平板曲，但總酯相對含量低于平板曲。平板曲中醇類揮發(fā)性風味成分的種類及相對含量均明顯高于包包曲，其中，正己醇、辛醇、(-)-4-萜品醇、DL-薄荷醇是濃香型白酒中的微量成分，俗稱“雜醇油”或高級醇，具有強烈、特殊的刺激性氣味[30]，低濃度時具有青香、果香、醇香、甜香和醚香[31]。醇類化合物和酸類化合物可在酯酶催化或酯化條件下形成大量酯類化合物，從而賦予濃香型白酒更多的揮發(fā)性風味成分，且適量的高級醇能賦予濃香型白酒良好的感官特征[32-33]。1-辛烯-3-醇被證實是酒曲中最重要的香氣成分之一，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香氣[34]。2,3,5,6-四甲基吡嗪是一種含氮雜環(huán)化合物，具有烘焙和堅果風味及極性香味閾值，可為濃香型白酒提供特殊的風味[24]。

包包曲和平板曲揮發(fā)性風味成分在組成和相對含量上具有差異，包包曲的揮發(fā)性風味成分主要為酯類化合物和酸類化合物；平板曲的揮發(fā)性風味成分主要為醇類化合物。大曲中的風味成分會隨發(fā)酵基質最終呈現(xiàn)在濃香型白酒中[35]，因此，使用包包曲、平板曲或混合曲對濃香型白酒風味形成具有一定的導向作用。

2.2 包包曲和平板曲真菌群落結構分析

2.2.1 高通量測序結果分析包包曲和平板曲經(jīng)高通量測序分別產(chǎn)生原始序列數(shù)目60 511個和66 247個。將序列質控過濾后，包包曲有58 724個序列，平均長度為243 bp，平板曲有66 001個序列，平均長度為226 bp。經(jīng)PCR擴增后，包包曲產(chǎn)生了62個嵌合體，平板曲產(chǎn)生了571個嵌合體。對測序錯誤數(shù)據(jù)進行剔除、校正等質量控制處理后，包包曲的序列數(shù)目為58 662個，平板曲的序列數(shù)目為65 430個。該結果表明，本研究測序數(shù)據(jù)的質量滿足微生物群落結構的分析要求。

2.2.2OTU分析在97%的相似水平下進行OTU生物信息統(tǒng)計分析。比對數(shù)據(jù)庫，包包曲共注釋117個OTU，平板曲共注釋156個OTU。Venn分析發(fā)現(xiàn)，包包曲和平板曲共有的OTU 數(shù)目為62個，包包曲和平板曲特有的OTU數(shù)目分別為55個和94個。

2.2.3α多樣性分析α多樣性可以反映微生物群落的多樣性和豐度，其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表示物種多樣性，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)表示物種豐度，Coverage指數(shù)反映測序結果是否代表樣本的真實情況。包包曲和平板曲的真菌α多樣性指數(shù)見表2。由表2可知，與包包曲相比，平板曲的Shannon指數(shù)較高，而Simpson指數(shù)較低；包包曲的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均低于平板曲，表明包包曲物種豐度低于平板曲，即平板曲中真菌的復雜程度明顯高于包包曲。包包曲和平板曲的Coverage指數(shù)均高于0.99，足以反應二者真菌群落結構的真實信息。

表2 包包曲和平板曲的真菌α多樣性指數(shù)Table 2 Fungal α diversity index of bag Daqu and brick Daqu

Shannon指數(shù)稀釋曲線用于評估測序數(shù)據(jù)量。包包曲和平板曲的Shannon指數(shù)稀釋曲線圖如圖1所示。由圖1可知，代表包包曲的紅線和代表平板曲的藍線均隨測序量的增加而趨于平坦，表明本研究的測序數(shù)據(jù)量是合理的。

圖1 包包曲(A1)和平板曲(B1)的Shannon指數(shù)稀釋曲線圖Fig.1 Shannon index dilution curve of bag Daqu(A1)and brick Daqu (B1)

2.2.4 物種分類學分析通過高通量測序，基于OTU在門水平和屬水平上對包包曲和平板曲真菌群落進行分類統(tǒng)計。包包曲和平板曲在門水平上的真菌群落結構分布圖如圖2所示。由圖2可知，從門水平上分析，以平均相對豐度>0.50%為閾值，包包曲中的優(yōu)勢真菌門分別是子囊菌門(Ascomycota，96.54%)、被孢菌門(Mucoromycota，2.68%)和擔子菌門(Basidiomycota，0.56%)；非優(yōu)勢真菌門為Olpidiomycota(0.01%)。平板曲中的優(yōu)勢真菌門分別是子囊菌門(Ascomycota，81.47%)和被孢菌門(Mucoromycota，6.74%)；非優(yōu)勢真菌門為擔子菌門(Basidiomycota，0.14%)。包包曲和平板曲中共有的優(yōu)勢真菌門為子囊菌門和被孢菌門，且包包曲比平板曲多一個優(yōu)勢真菌門擔子菌門。之前的研究[36-37]表明，濃香型白酒大曲中的真菌群落多為子囊菌門、被孢菌門、擔子菌門和接合菌門，這與本研究結果基本一致。

圖2 包包曲(A1)和平板曲(B1)在門水平上的真菌群落結構分布圖Fig.2 Distribution of the fungal community structure of bag Daqu(A1)and brick Daqu(B1) at the phylum level

包包曲和平板曲在屬水平上的真菌群落結構分布圖如圖3所示。由圖3可知，從屬水平上分析，以平均相對豐度>1.00%為閾值，包包曲中的優(yōu)勢真菌屬分別是嗜熱子囊菌屬(Thermoascus，76.90%)、曲霉屬(Aspergillus，1.60%)、根霉菌屬(Rhizopus，2.03%)和假絲酵母屬(Candida，2.11%)，非優(yōu)勢真菌屬分別是雙足囊菌屬(Dipodascus，0.12%)、鏈格孢屬(Alternaria，0.01%)、根毛霉屬(Rhizomucor，0.62%)、附球菌屬(Epicoccum，0.01%)、生絲畢赤酵母屬(Hyphopichia，0.19%)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces，0.04%)、鐮刀菌屬(Fusarium，0.02%)、紅酵母屬(Rhodotorula，0.37%)、嗜熱真菌屬(Thermomyces，0.04%)、Cutaneotrichosporon(0.02%)、Cystofilobasidium(0.09%)、絲孢酵母屬(Trichosporon，0.03%)、青霉菌屬(Penicillium，0.02%)、毛霉菌屬(Mucor，0.01%)、Apiotrichum(0.02%)、Papiliotrema(0.01%)、畢赤酵母屬(Pichia，0.01%)、棒孢酵母屬(Clavispora，0.01%)、Diutina(0.01%)和油壺菌屬(Olpidium，0.01%)；平板曲中的優(yōu)勢真菌屬分別是嗜熱子囊菌屬(49.70%)、曲霉屬(8.41%)、根霉菌屬(6.02%)、雙足囊菌屬(3.30%)、鏈格孢屬(1.07%)和附球菌屬(1.00%)，非優(yōu)勢真菌屬分別是假絲酵母屬(0.19%)、根毛霉屬(0.51%)、生絲畢赤酵母屬(0.63%)、明梭孢屬(Monographella，0.40%)、威克漢姆酵母屬(0.33%)、鐮刀菌屬(0.34%)、紅酵母屬(0.01%)、嗜熱真菌屬(0.07%)、平臍蠕孢屬(Bipolaris，0.10%)、Cutaneotrichosporon(0.07%)、絲孢酵母屬(0.03%)、青霉菌屬(0.04%)、橫梗霉屬(Lichtheimia，0.04%)、毛霉菌屬(0.03%)、小球腔霉屬(Leptosphaeria，0.03%)、絲衣霉屬(Byssochlamys，0.02%)、Guehomyces(0.01%)、彎孢屬(Curvularia，0.01%)、枝孢霉屬(Cladosporium，0.01%)、籃狀菌屬(Talaromyces，0.01%)、亞隔孢殼屬(Didymella，0.01%)、黑孢屬(Nigrospora，0.01%)和地霉屬(Geotrichum，0.01%)。李斌等[38]利用高通量測序技術得到的濃香型白酒中高溫酒曲的優(yōu)勢真菌屬為假絲酵母屬、嗜熱子囊菌屬和根毛霉屬，雙足囊菌屬、鏈格孢屬和附球菌屬含量較少，而這些含量較少的真菌屬是本研究中平板曲的優(yōu)勢菌屬。

圖3 包包曲(A1)和平板曲(B1)在屬水平上的真菌群落結構分布圖Fig.3 Distribution of the fungal community structure of bag Daqu(A1)and brick Daqu(B1) at the genus level

屬水平上包包曲和平板曲與菌屬物種的關系圖如圖4所示。圖4不僅反映了每個大曲樣品的優(yōu)勢真菌屬的組成比例，也反映了各優(yōu)勢真菌屬在不同大曲樣本上的分布比例。與平板曲相比，包包曲中占比較高的優(yōu)勢真菌屬包括嗜熱子囊菌屬和假絲酵母屬。嗜熱子囊菌屬可產(chǎn)生過氧化氫酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶、角質酶、幾丁質酶等，多數(shù)假絲酵母屬具有酒精發(fā)酵能力[39]。平板曲中曲霉屬、雙足囊菌屬、根霉菌屬等均明顯多于包包曲。曲霉菌屬能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、酯化酶、果膠酶、纖維素酶、單寧酶等，在濃香型白酒的釀造過程中主要作用于發(fā)酵前期，是濃香型白酒發(fā)酵原料中淀粉等大分子物質分解的主要動力之一[40]。雙足囊菌屬的作用則主要表現(xiàn)在產(chǎn)香及產(chǎn)前體物質方面，對酸類化合物、醇類化合物具有較強的酯化能力，所產(chǎn)生的物質對濃香型白酒酒體風格的形成具有重要作用[41]。根霉菌屬為固態(tài)發(fā)酵中后期的優(yōu)勢真菌[42]，在釀酒發(fā)酵中非常常見，其產(chǎn)淀粉酶最為突出，在一定條件下，根霉菌屬能同時進行糖化和發(fā)酵，產(chǎn)生乙醛、乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙醇等風味成分[43]。

圖4 屬水平上包包曲(A1)和平板曲(B1)與菌屬物種的關系圖Fig.4 Relationship between bag Daqu(A1)and brick Daqu(B1)and mycorrhizal species at the genus level

2.2.5 物種豐度差異分析進一步對包包曲和平板曲的菌群豐度進行差異性分析，包包曲和平板曲真菌屬豐度差異顯著的誤差線圖如圖5所示，其中，當P<0.05時，表示兩者差異顯著。由圖5可知，除未分類的真菌屬外，包包曲和平板曲豐度差異顯著的真菌屬共24個，其中，平板曲比包包曲多的真菌屬包括曲霉屬、雙足囊菌屬、根霉菌屬、鏈格孢屬、附球菌屬、明梭孢屬、鐮刀菌屬、威克漢姆酵母屬、生絲畢赤酵母屬、平臍蠕孢屬、橫梗霉屬、小球腔霉屬、絲衣霉屬和Cutaneotrichosporon。包包曲比平板曲多的真菌屬包括嗜熱子囊菌屬、假絲酵母屬、紅酵母屬和Cystofilobasidium。

圖5 包包曲(A1)和平板曲(B1)菌屬豐度差異顯著的誤差線圖Fig.5 Error line plot for comparing the differences in genera of bacteriophages of bag Daqu (A1) and brick Daqu (B1)

平板曲的真菌群落豐度高于包包曲。平板曲中曲霉屬和根霉菌屬負責形成一系列淀粉酶和糖化酶，為微生物生長提供合適的底物[44]，且雙足囊菌屬類產(chǎn)香真菌[45]的相對豐度高于包包曲，這或許能解釋真菌群落和揮發(fā)性風味成分上的差異。鏈格孢屬、附球菌屬、明梭孢屬、小球腔霉屬、橫梗霉屬、平臍蠕孢屬、絲衣霉屬和Cutaneotrichosporon在濃香型白酒發(fā)酵過程中雖已有報道，但其具體功能還未被解析[46]；鐮刀菌屬與苯甲醛和(E,E)-2,4-壬二烯醛的形成呈正相關；威克漢姆酵母屬是最主要的非釀酒酵母，存在于各類自然發(fā)酵食品中[47]，這些真菌屬賦予了平板曲強于包包曲的諸多功能。在包包曲中，因發(fā)酵溫度較平板曲高，耐高溫的嗜熱子囊菌屬、假絲酵母屬是其主要的差異菌屬，它們主要提供與糖化和乙醇發(fā)酵有關的酶[48]；紅酵母屬對降解酒精發(fā)酵過程中的污染物氨基甲酸乙酯具有重要作用[49]。綜上所述，平板曲在真菌群落結構組成上優(yōu)于包包曲，可為濃香型白酒發(fā)酵提供更多的潛在功能。

大曲在自然發(fā)酵過程中依靠內(nèi)源生物熱驅動群落演變，在溫度逐漸升高的過程中，部分不耐高溫微生物會死亡[38]。本研究中包包曲真菌群落屬水平上的多樣性和豐度均低于平板曲，這是由于包包曲的“包包”部分溫度高、濕度大、高溫持續(xù)時間長，對微生物生長的制約較大。兩種大曲形狀的不同導致二者發(fā)酵參數(shù)不同，尤其是溫度的變化，對真菌群落的結構起著決定性作用。大曲微生物菌群在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生的各種酶可將大曲中的大分子淀粉和蛋白質降解為小分子還原糖和氨基酸供給微生物生長和風味代謝，其本身所含有的大量風味成分或前體物質在釀造過程中亦可直接或間接地進入酒體中[50-51]。大曲微生物的群落結構不僅決定大曲的功能，而且對大曲的風味成分代謝至關重要。本研究中包包曲和平板曲因形狀不同，導致二者發(fā)酵溫度不同，進而導致真菌群落結構不同，從而引起揮發(fā)性風味成分的差異。

2.2.6 系統(tǒng)發(fā)生進化樹分析在屬水平上，選取OTU聚類結果中總豐度較大的前50個OTU聚類的代表序列，以及數(shù)據(jù)庫中與這50個代表序列種屬信息一致且最長的序列，通過MUSCLE軟件比對分析，構建的系統(tǒng)發(fā)生進化樹如圖6所示。圖6可明顯、系統(tǒng)地揭示包包曲和平板曲中菌落進化過程的順序及其各個菌屬進化的歷史和機制。

圖6 豐度較大的前50個OTU在屬水平上的系統(tǒng)發(fā)生進化樹Fig.6 Cluster diagram of the top 50 OTUs with the highest abundance at the genus level

3 結論

本文通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術檢測了包包曲和平板曲中的揮發(fā)性風味成分，發(fā)現(xiàn)在兩種大曲中共檢測到24種揮發(fā)性風味成分，其中包括7種醇類化合物、4種酯類化合物、1種酮類化合物、1種醛類化合物、4種酸類化合物、3種酚類化合物和4種碳氫化合物；包包曲和平板曲揮發(fā)性風味成分的組成和相對含量均具有差異，包包曲中共有17種揮發(fā)性風味成分，主要為酯類化合物和酸類化合物，如3-苯丙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、己二酸雙(2-丁氧基乙)酯、醋酸、己酸、辛酸和棕櫚酸；平板曲中共有19種揮發(fā)性風味成分，主要為醇類化合物，如正己醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基己醇、辛醇、(-)-4-萜品醇和DL-薄荷醇；包包曲中相對含量較高的2,4-二叔丁基苯酚可能是導致其真菌群落豐度低于平板曲的原因之一。通過高通量測序技術分析了包包曲和平板曲中的真菌群落結構，發(fā)現(xiàn)從門水平上分析，包包曲中含有的優(yōu)勢真菌門(平均相對豐度>0.50%)有3個，分別是子囊菌門、被孢菌門和擔子菌門；平板曲中的優(yōu)勢真菌門(平均相對豐度>0.50%)有2個，分別是子囊菌門和被孢菌門；從屬水平上分析，包包曲中的優(yōu)勢真菌屬(平均相對豐度>1.00%)有4個，分別是嗜熱子囊菌屬、曲霉屬、根霉菌屬和假絲酵母屬；平板曲中的優(yōu)勢真菌屬(平均相對豐度>1.00%)有6個，分別是嗜熱子囊菌屬、曲霉屬、根霉菌屬、雙足囊菌屬、鏈格孢屬和附球菌屬。包包曲和平板曲中豐度差異顯著的真菌屬共24個，分析原因為包包曲和平板曲的形狀不同使得二者發(fā)酵溫度不同，進而導致真菌群落的多樣性和豐度不同，從而引起揮發(fā)性風味成分的差異。該研究明確了河南地區(qū)包包曲和平板曲的揮發(fā)性風味成分組成和真菌群落結構，對河南地區(qū)大曲的制作、酒企對生產(chǎn)用曲的選擇、濃香型白酒品質的提升及創(chuàng)新性發(fā)展具有重要意義。本研究只選取了發(fā)酵成熟階段的包包曲和平板曲，對兩種大曲整個發(fā)酵階段的溫度變化與真菌群落演替規(guī)律和揮發(fā)性風味成分代謝的關系尚不明確，因此，下一步將采用微生物組學和代謝組學聯(lián)用的方法研究整個發(fā)酵階段溫度變化對微生物群落演替規(guī)律和揮發(fā)性風味成分代謝的影響。