令狐遠(yuǎn)鳳, 楊 陽, 潘 永, 段世宇, 張家莉, 張寶太, 楊 琦

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550025)

沙門氏菌(Salmonella)為腸桿菌科、沙門氏菌屬成員,可引起人與動物多種疾病，在全世界均有發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1].研究表明[2]，沙門氏菌中重要的調(diào)控因子small RNA(sRNA)在轉(zhuǎn)錄水平上對細(xì)菌的生命活動進(jìn)行調(diào)控,其中反式編碼sRNA調(diào)控作用往往離不開伴侶蛋白Hfq的幫助.當(dāng)Hfq缺失后，相關(guān)sRNA的調(diào)控作用可能會減弱甚至消失.也有研究表明[3-4]，越來越多的腸桿菌sRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上對外膜蛋白(OMPs)的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié),已知InvR、MicA、MicC、MicF、OmrAB、RseX、RybB等至少8個sRNA在大腸桿菌與沙門氏菌中可以調(diào)節(jié)OMPs.

Hfq蛋白由6個相同的分子質(zhì)量為11.2 ku的亞基組成，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的同型六聚體結(jié)構(gòu).該種蛋白具備最少3個不同的RNA相互作用面：近端面、遠(yuǎn)端面、邊緣面.Hfq蛋白通過這3個不同的接觸面，與RNA相互作用.近端面與富含尿嘧啶核苷(U)的序列結(jié)合，每個單體最多結(jié)合6個核苷酸，這種多存在于與許多sRNA 3'端的Rho非依賴性終止子結(jié)合.而遠(yuǎn)端面對富含腺苷(A)的序列具有親和力，在rpoSmRNA的5′-UTR內(nèi)首次確定的相關(guān)結(jié)構(gòu)，AAYA 序列顯著增強(qiáng)了Hfq的結(jié)合，并在Hfq、rpoS和DsrA之間形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物[5].基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是控制細(xì)菌內(nèi)基因表達(dá)過程的第一步，轉(zhuǎn)錄控制涉及RNA聚合酶和許多其他調(diào)節(jié)因素的共同作用，無論是全局的還是局部的，正的或負(fù)的調(diào)節(jié)劑，在細(xì)菌細(xì)胞中都起著至關(guān)重要的作用.根據(jù)調(diào)控條件的不同，在顏色指示重組菌株fadL、ompN、ybfM基因(ARN)n基序缺失基礎(chǔ)上再分別進(jìn)行hfq基因缺失，通過β-半乳糖苷酶活性分析可以反映基因表達(dá)含量的變化，探究缺失區(qū)域?qū)υ摶虍a(chǎn)生的作用.

本試驗將利用5′RACE技術(shù)探究fadL、ompN、ybfMmRNA 5′UTR基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；篩查fadL、ompN、ybfMmRNA 5′UTR可能的Hfq結(jié)合位點(diǎn)(ARN)n基序；利用λ-red同源重組技術(shù)構(gòu)建不同(ARN)n完整基序突變的lacZ基因融合菌株；利用噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的hfq基因缺失菌株；通過β-半乳糖苷酶試驗檢測不同重組菌株fadL、ompN、ybfM基因的蛋白水平，分析fadL、ompN、ybfMmRNA (ARN)n基序與Hfq調(diào)控的作用關(guān)系，為闡明鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium，STM)中Hfq與靶mRNA的作用機(jī)制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

MA7455菌株(STM LT2/pKD46)，MA10241菌株(STM LT2 ΔgcvB∷cat)，MA10675菌株(STM LT2 Δhfq∷tetRA)，P22噬菌體，pKD13質(zhì)粒，pCP20質(zhì)粒及pCE40質(zhì)粒均由法國國家科學(xué)研究中心(CNRS)分子遺傳學(xué)Bossi實(shí)驗室惠贈，STM LT2fadL∷kn菌株，STM LT2ompN∷kn，STM LT2ybfM∷kn由本實(shí)驗室構(gòu)建.

1.2 主要試劑

TRIzol、SMARTer RACE 5′/3′Kit(Cat.NO.634859)和pMD19-T試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司.氯仿和甲苯申請并報備于貴州大學(xué)實(shí)驗室與設(shè)備管理處.氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、鹽酸四環(huán)素、利福平、Pfu DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase、dNTPs Mix 及ONPG均購自北京索萊寶科技有限公司.DL2000 Plus DNA Marker、AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix和膠回收試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司.Cycle-Pure Kit和質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega生物科技有限公司.NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)購自近岸蛋白科技有限公司.

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上STM LT2 菌株的fadL、ybfM、ompN基因序列與5′RACE引物要求設(shè)計引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成.

表1 5′RACE引物序列

1.4 fadL、ybfM、ompN mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和ARN基序篩查

根據(jù)R6950 Bacterial RNA Kit，提取STM LT2的總RNA，利用特異性的反轉(zhuǎn)錄引物在反轉(zhuǎn)錄試劑(RNase H-) 作用下合成5′RACE Ready cDNA，在TdT酶作用下加上10～15個(dC)殘基，進(jìn)行第1輪R1的擴(kuò)增和第2輪R2的擴(kuò)增.使用Mfold軟件預(yù)測fadL、ybfM、ompNmRNA部分序列的二級結(jié)構(gòu)，登錄網(wǎng)站(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)，打開RNA Folding Form (version 2.3 energies)選項，輸入fadL、ybfM、ompNmRNA 5′UTR完整序列至編碼區(qū)第20個堿基，其余參數(shù)按默認(rèn)方案設(shè)置，導(dǎo)出并分析結(jié)果.根據(jù)(ARN)n基序特征篩查fadL、ybfM、ompNmRNA 5′UTR的ARN基序.

1.5 ARN基序缺失菌株的構(gòu)建

1.5.1 引物設(shè)計 參照5′UTR分析結(jié)果設(shè)計相應(yīng)引物(表2)，P1(F)分別與P2(F)、P3(F)進(jìn)行擴(kuò)增，P4(F)、P5(F)驗證，構(gòu)建fadLARN-1、ARN-2缺失菌株；P1(Y)分別與P2(Y)、P3(Y)、P4(Y)、P5(Y)、P6(Y)進(jìn)行擴(kuò)增，P7(Y)、P8(Y)驗證，構(gòu)建ybfMARN-1、ARN-2、ARN-3、ARN-4、ARN-5缺失菌株；P1(O)分別與P2(O)、P3(O)、P4(O)、P5(O)進(jìn)行擴(kuò)增，P6(O)、P7(O)驗證，構(gòu)建ompNARN-1、ARN-2、ARN-3、ARN-4缺失菌株.

表2 定點(diǎn)突變菌株構(gòu)建使用引物1)

利用λ-Red同源重組酶及FLP重組酶系統(tǒng)，以STM LT2fadL∷kn菌株總DNA為模板，分別以P1(F)/P2(F)、P1(F)/P3(F)為引物，PCR擴(kuò)增將用于敲除fadLmRNA 5′UTR中經(jīng)預(yù)測ARN基序的目的片段，產(chǎn)物經(jīng)純化回收后取5 μL與50 μL MA7455電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞混合并進(jìn)行電轉(zhuǎn)化試驗，吸取200 μL菌液涂布于卡那抗性平板中進(jìn)行培養(yǎng)篩選，獲得菌株STM LT2fadLΔ(AAAAATAAT)∷kn、STM LT2fadLΔ(AAAAAA)∷kn；將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)入STM LT2fadLΔ(AAAAATAAT)∷kn、STM LT2fadLΔ(AAAAAA)∷kn中，在氨芐抗性的平板中進(jìn)行培養(yǎng)篩選，獲得菌株STM LT2fadLΔ(AAAAATAAT)∷scar、STM LT2fadLΔ(AAAAAA)∷scar；將質(zhì)粒Pce40轉(zhuǎn)入菌株STM LT2fadLΔ(AAAAATAAT)∷scar、STM LT2fadLΔ(AAAAAA)∷scar中，在卡那抗性平板中進(jìn)行培養(yǎng)篩選，以P4(F)/P5(F)為引物進(jìn)行PCR與測序驗證，構(gòu)建出菌株STM LT2fadLΔ(AAAAATAAT)∷MudK、STM LT2fadLΔ(AAAAAA)∷MudK.其余ARN基序缺失菌株根據(jù)其相對應(yīng)引物按同樣方法分別構(gòu)建出LT2ompNΔ(GTTTTT)∷MudK、LT2ompNΔ(TCTTTT)∷MudK、LT2ompNΔ(ATTATT)∷MudK、LT2ompNΔ(TTTGCT)∷MudK，構(gòu)建LT2ybfMΔ(AAGAGG)∷MudK、LT2ybfMΔ(AGCAAT)∷MudK、LT2ybfMΔ(AGTAAA)∷MudK、LT2ybfMΔ(AAAAATAGT)∷MudK、LT2ybfMΔ(AACAGAAAG)∷MudK.

1.5.2 P22噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建缺失菌株 將ARN基序缺失和點(diǎn)突變菌株通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的hfq基因缺失菌株.以MA10675菌株為供體菌，ARN基序缺失和點(diǎn)突變菌株為受體菌，取20 μL的供體菌borth至1.5 mL離心管，按1∶50加入980 μL無菌PBS中進(jìn)行稀釋.分別取受體菌50、100 μL稀釋后，供體菌borth至2.0 mL EP管中，混勻.將2.0 mL離心管置于37 ℃搖床進(jìn)行孵育1 h后，取20 μL在相應(yīng)抗性 LB平板進(jìn)行涂布篩選，次日取單個菌落進(jìn)行劃線純化培養(yǎng).將經(jīng)鑒定正確構(gòu)建的菌株在噬菌體鑒別培養(yǎng)基上純化，直至無噬菌體殘留.

1.5.3 β-半乳糖苷酶活性分析 每組設(shè)3個重復(fù)并以STM LT2fadL∷lacZ菌株為陰性對照，同時設(shè)空白對照.步驟：將待測菌株過夜培養(yǎng)后取100 μL再次培養(yǎng)至D600 nm=0.3～0.5，從中抽取菌液1 mL置于比色皿中測D600 nm，記錄數(shù)值.從這1 mL菌液中取0.1 mL置于新的試管中，以Z buffer定容至1 mL，加入1滴甲苯，立即旋轉(zhuǎn)振蕩30 s.后將其置于42 ℃搖床中振蕩2 h，再置于28 ℃水浴鍋中5 min.往試管中加入0.2 mL ONPG(4 mg·mL-1)，記錄加入時間(start time,t0).當(dāng)試管中出現(xiàn)黃色時，加入0.5 mL 1 mol·L-1Na2CO3終止反應(yīng)，記錄終止時間(finish time,tf).將所得液體進(jìn)行離心，取上清液1 mL置于比色皿，以Z buffer作為空白對照，測D420 nm,記錄數(shù)值.β-半乳糖苷酶活性=1 000×D420 nm/[(tf-t0)×D600 nm].

2 結(jié)果與分析

2.1 fadL、ybfM、ompN mRNA 5′UTR測序

提取鼠傷寒沙門氏菌總RNA，使用5′/3′RACE試劑盒，對STM LT2fadL、ybfM、ompNmRNA 進(jìn)行5′RACE PCR試驗，按試劑盒上步驟分別進(jìn)行R1、R2的擴(kuò)增，將R2 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果確認(rèn)fadL、ompN、ybfM基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(表3).

表3 fadL、ompN、ybfM序列1)

2.2 fadL、ompN、ybfM mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及ARN基序篩查

將fadL5′-UTR 端序列導(dǎo)入網(wǎng)站(http://rna.urmc.rochester.edu/)進(jìn)行fadL 5′UTR端二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，確定其可能的(ARN)n位點(diǎn)與rybB結(jié)合區(qū)域.fadL5′UTR退火形成2個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從中篩選出2個可能的(ARN)n位點(diǎn)，ARN-1(AAAAATAAT)位于靠近fadLAUG的莖環(huán)結(jié)構(gòu)上，ARN-2(AAAAAA)則遠(yuǎn)離2個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，距離AUG近160 nt，2個(ARN)n均處于單鏈狀態(tài).以上結(jié)果表明，成功預(yù)測了fadL5′ UTR的二級結(jié)構(gòu)，并篩選出2個可能的(ARN)n序列ARN-1和ARN-2.同樣方法預(yù)測出ompN5′UTR的二級結(jié)構(gòu)，篩選出4個可能的(ARN)n序列ARN-1、ARN-2、ARN-3、ARN-4，ybfM5′UTR篩選出5個可能的(ARN)n序列ARN-1、ARN-2、ARN-3、ARN-4、ARN-5(圖1).

A:fadL mRNA 5′UTR;B:ompN mRNA 5′UTR C:ybfM mRNA 5′UTR.

2.3 基因定點(diǎn)ARN基序缺失菌株鑒定

利用λ-Red同源重組酶及FLP重組酶系統(tǒng)，成功構(gòu)建出fadL基因中ARN-1、ARN-2區(qū)域缺失的STM LT2fadLΔ(AAAAATAAT)∷MudK、STM LT2fadLΔ(AAAAAA)∷MudK；ompN基因中ARN-1、ARN-2、ARN-3、ARN-4區(qū)域缺失的LT2ompNΔ(GTTTTT)∷MudK、LT2ompNΔ(TCTTTT)∷MudK、LT2ompNΔ(ATTATT)∷MudK、LT2ompNΔ(TTTGCT)∷MudK；ybfM基因中ybfMARN-1、ARN-2、ARN-3、ARN-4區(qū)域缺失的LT2ybfMΔ(AAGAGG)∷MudK、LT2ybfMΔ(AGCAAT)∷MudK、LT2ybfMΔ(AGTAAA)∷MudK、LT2ybfMΔ(AAAAATAGT)∷MudK、LT2ybfMΔ(AACAGAAAG)∷MudK(圖2).

A:菌株fadL mRNA ARN-2、ARN-1基序的敲除;B:菌株ompN mRNA ARN-4、ARN-3、ARN-2和ARN-1基序的敲除;C:菌株ybfM mRNA ARN-5、ARN-4、ARN-3、ARN-2和ARN-1基序的敲除.

2.4 定點(diǎn)缺失顏色指示菌株hfq缺失

通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，成功構(gòu)建fadL、ompN、ybfM對應(yīng)(ARN)n基序的hfq基因缺失菌株LT2 ΔfadL(AAAAAA)∷MudK Δhfq∷TetRa、LT2 ΔfadL(AAAAATAAT)∷MudK Δhfq∷TetRa、LT2 ΔybfM(AAGAGG)∷MudK Δhfq∷TetRa、LT2 ΔybfM(AGCAAT)∷MudK Δhfq∷TetRa、LT2 ΔybfM(AGTAAA)∷MudK Δhfq∷TetRa、LT2 ΔybfM(AAAAATAGT)∷MudK Δhfq∷TetRa、LT2 ΔybfM(AACAGAAAG)∷MudK Δhfq∷TetRa、LT2ΔompN(GTTTTT)∷MudK Δhfq∷TetRa、LT2ΔompN(TCTTTT)∷MudK Δhfq∷TetRa Δhfq∷TetRa(圖3).

M:2 000 bp DNA maker；1、2:LT2 ΔfadL(AAAAAA)∷MudK Δhfq∷TetRa；3、4:LT2 ΔfadL(AAAAATAAT)∷MudK Δhfq∷TetRa；5、6:LT2 ΔybfM(AAGAGG)∷MudK Δhfq∷TetRa；7、8:LT2 ΔybfM(AGCAAT)∷MudK Δhfq∷TetRa；9、10:LT2 ΔybfM(AGTAAA)∷MudK Δhfq∷TetRa;11、12:LT2 ΔybfM(AAAAATAGT)∷MudK Δhfq∷TetRa;13、14:LT2 ΔybfM(AACAGAAAG)∷MudK Δhfq∷TetRa;15、16:LT2ΔompN(GTTTTT)∷MudK Δhfq∷TetRa;17、18:LT2ΔompN(TCTTTT)∷MudK Δhfq∷TetRa Δhfq∷TetRa.

2.5 (ARN)n序列缺失對fadL、ompN、ybfM表達(dá)的影響

通過β-半乳糖苷酶活性分析試驗探知(ARN)n缺失對fadL、ompN、ybfM的蛋白表達(dá)的影響(圖4).結(jié)果表明：ARN-1(AAAAAA)、ARN-2(AAAAATAAT)分別對fadL蛋白水平表達(dá)量下調(diào)72%、56%；ARN-1(GTTTTT)、ARN-2(TCTTTT)、ARN-3(ATTATT)、ARN-4(TTTGCT)缺失導(dǎo)致ompN蛋白表達(dá)水平分別是原菌株的1.29、1.30、0.90、1.07倍；ARN-1(AAGAGG)、ARN-2(AGCAAT)、ARN-3(AGTAAA)、ARN-4(AAAAATAGT)、ARN-5(AACAGAAAG)可提高ybfM蛋白表達(dá)水平，分別是原菌株的4.20、3.99、10.90、227.00、46.00倍.

圖4 (ARN)n序列缺失菌株的β-半乳糖苷酶活性

以LT2 Δhfq∷TetRa作為供體菌，通過P22噬菌體將hfq缺失片段轉(zhuǎn)入(ARN)n序列缺失指示菌株中，進(jìn)行(ARN)n序列缺失指示菌株的hfq基因缺失(圖5).結(jié)果表明：hfq缺失后，LT2 ΔfadL(AAAAAA)∷MudK、LT2 ΔfadL(AAAAATAAT)∷MudK中fadL蛋白水平分別下調(diào)62%、48%；LT2 ΔybfM(AAAAATAGT)∷MudK、LT2 ΔybfM(AACAGAAAG)∷MudK中ybfM蛋白水平上調(diào)，分別為對照組的4.12、7.25倍.

圖5 hfq缺失后(ARN)n序列缺失菌株的β-半乳糖苷酶活性

3 討論

在大腸桿菌中，與富含腺苷(A)復(fù)合的Hfq晶體結(jié)構(gòu)顯示，Hfq每亞單位在分離面上結(jié)合3個核苷酸，即是(ARN)序列，A是腺苷核苷酸，R是任何一種嘌呤核苷酸，N是任何核苷酸[6].此發(fā)現(xiàn)證實(shí)了Hfq的作用機(jī)制是多元化的，在促進(jìn)sRNA與靶mRNA之間相互配對的同時，可以調(diào)節(jié)相應(yīng)的生理活動，重塑RNA的二級結(jié)構(gòu)，促進(jìn)sRNA對靶mRNA的調(diào)控[7].Hfq蛋白參與靶標(biāo)調(diào)控的主要方式是幫助sRNA與其靶mRNA的5′UTR結(jié)合，該區(qū)域可能是核糖體結(jié)合位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游或核糖體結(jié)合位點(diǎn)下游(包含起始密碼子的區(qū)域)，而與靶mRNA 3′UTR結(jié)合方式較為少見[8].在sRNA 對其靶mRNArpoS和fhlA的調(diào)控過程中，這些Hfq結(jié)合序列對于調(diào)節(jié)至關(guān)重要[9].沙門菌yifK mRNA ACA翻譯增強(qiáng)子元件的鑒定研究表明[10]，(ARN)n基序可能作為fadL、ompN、ybfMmRNA翻譯增強(qiáng)子，缺失導(dǎo)致其mRNA翻譯受阻.

Hfq蛋白對不同的RNA表現(xiàn)出明顯的親和力，其中遠(yuǎn)端面多與mRNA中5'-UTR區(qū)域進(jìn)行結(jié)合，以幫助sRNA與靶標(biāo)mRNA的相互作用.本試驗首先對fadL、ompN、ybfMmRNA 5′UTR進(jìn)行了分析，并確證了fadL、ompN、ybfM基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn).根據(jù)ARN基序特征，在fadL、ompN、ybfMmRNA 5′UTR 篩選到符合ARN特性的對應(yīng)基序.在預(yù)測其mRNA二級結(jié)構(gòu)中，(ARN)n完全或大部分處于單鏈狀態(tài),說明蛋白對單鏈結(jié)構(gòu)的偏好性有著同一特征，(ARN)n具備與Hfq蛋白相互作用的條件.

為確定Hfq對fadL、ompN、ybfM的結(jié)合位點(diǎn)，通過對fadL、ompN、ybfM進(jìn)行5′UTR進(jìn)行分析及二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，在fadLmRNA中篩選出ARN-1(AAAAAA)、ARN-2(AAAAATAAT)，在ompN中篩選出ARN-1(GTTTTT)、ARN-2(TCTTTT)、ARN-3(ATTATT)、ARN-4(TTTGCT)，在ybfM中篩選出ARN-1(AAGAGG)、ARN-2(AGCAAT)、ARN-3(AGTAAA)、ARN-4(AAAAATAGT)、ARN-5(AACAGAAAG)，根據(jù)篩選結(jié)果構(gòu)建相應(yīng)的ARN基序缺失菌株.β-半乳糖苷酶活性分析試驗結(jié)果表明：fadL(ARN)n位點(diǎn)缺失后，fadL所翻譯的蛋白表達(dá)量顯著降低；ompN中(ARN)n位點(diǎn)缺失后，ompN的蛋白表達(dá)量未出現(xiàn)顯著變化;而ybfM(ARN)n位點(diǎn)缺失后,ybfM的蛋白表達(dá)量出現(xiàn)不同程度升高，其中ARN-4(AAAAATAGT)缺失對ybfM的影響最為顯著.對部分(ARN)n指示菌株進(jìn)行hfq缺失后，β-半乳糖苷酶活性分析結(jié)果表明，在(ARN)n序列缺失后，fadL中ARN-1(AAAAAA)、ARN-2(AAAAATAAT)的蛋白表達(dá)量均顯著下降，ybfM中ARN-4(AAAAATAGT)、ARN-5(AACAGAAAG)的蛋白表達(dá)量均有不同程度升高.該結(jié)果表明，ompN的(ARN)n基序缺失對蛋白表達(dá)量的影響不顯著，僅略微上調(diào)，這可能是因為ompN篩選出的(ARN)n基序?qū)τ贖fq調(diào)控影響不顯著.而fadL、ybfM的(ARN)n基序?qū)τ贖fq調(diào)控fadL、ybfM的表達(dá)有著重要聯(lián)系，進(jìn)一步確證了(ARN)n基序與Hfq調(diào)控fadL、ybfMmRNA的機(jī)制有關(guān)，并推測Hfq通過與其fadL、ybfM(ARN)n基序結(jié)合從而發(fā)揮作用，但相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步探究.