納米魚骨在肌球蛋白膠凝過程中鈣賦存形態(tài)的變化及分布

高 霞，張夢(mèng)玲，熊善柏，胡 楊，尹 濤，劉 茹

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，國(guó)家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，湖北 武漢 430070）

肌球蛋白是魚糜膠凝過程中最重要的功能性蛋白，對(duì)形成具有良好質(zhì)地的魚糜制品至關(guān)重要。魚糜熱誘導(dǎo)膠凝過程中，在較低溫度（5～40 ℃）下的凝膠化行為與內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（fish endogenous transglutaminase，F(xiàn)TGase）密切相關(guān)，F(xiàn)TGase通過催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的谷氨酸與賴氨酸殘基之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，生成ε-(γ-Glu)-Lys異肽鍵，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子聚集形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。研究表明，F(xiàn)TGase具有Ca依賴性，生產(chǎn)過程中常需要添加鈣鹽以提高其催化活性進(jìn)而改善魚糜的凝膠性能。近年來，有學(xué)者比較研究了氯化鈣、碳酸鈣、乳酸鈣等化合鈣對(duì)魚糜凝膠性能的影響，發(fā)現(xiàn)溶解性越好的化合鈣對(duì)魚糜凝膠性能的提升作用越大。但是，化合鈣添加量過多會(huì)產(chǎn)生苦味，對(duì)魚糜制品的風(fēng)味產(chǎn)生不良影響。

魚骨是魚糜加工過程中產(chǎn)生的主要固體副產(chǎn)物，約占整條魚的10%～15%。魚骨中富含鈣、磷等元素，且鈣磷比利于人體吸收，具有較高的生物利用度，是天然的優(yōu)質(zhì)鈣源。目前，工業(yè)生產(chǎn)中大都將魚骨加工成飼料或直接當(dāng)作下腳料丟棄，利用率極低，易造成資源浪費(fèi)甚至引發(fā)環(huán)境污染問題，將其開發(fā)為新型鈣源，對(duì)副產(chǎn)物的高效利用具有重要意義。魚骨中的鈣大都以羥基磷灰石的形式存在，溶解度較低。前期實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，魚骨中鈣的生物利用度隨著魚骨尺寸的減小而升高，納米魚骨（nano fish bone，NFB）中鈣的溶解性較微米魚骨顯著提高。相較于CaCl，NFB中僅有少部分鈣以游離態(tài)存在，其對(duì)FTGase的激活作用弱于CaCl，但是NFB對(duì)魚糜凝膠的提升作用強(qiáng)于CaCl，這可能與NFB中鈣的不同賦存形態(tài)有關(guān)。然而，關(guān)于NFB在肌球蛋白膠凝過程中鈣的賦存形態(tài)如何轉(zhuǎn)化鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以鰱魚骨為原料制備NFB，將其加入肌球蛋白中，研究肌球蛋白膠凝過程中鈣賦存形態(tài)和表面元素的變化，進(jìn)一步采用激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）觀察肌球蛋白凝膠的微觀形貌，結(jié)合低場(chǎng)核磁分析肌球蛋白樣品水分分布狀況，探討NFB在肌球蛋白膠凝過程中鈣的賦存形態(tài)變化與分布，為探討NFB提升魚糜凝膠性能的作用機(jī)理提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱（Hyophthalmichthys molitrix），每尾質(zhì)量約1.5 kg，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場(chǎng)。將鮮活鰱魚置于盛滿水的塑料袋中迅速運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，去頭、去內(nèi)臟后分別取背脊部肉和魚骨用于提取肌球蛋白和制備NFB，其他樣品置于4 ℃冰箱存放。

茜素紅染液（分析純） 武漢谷歌生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250（分析純） 美國(guó)Amresco公司；氯化鑭及其余試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AA-6300c原子吸收分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；Nikon Eclipase CI光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司；X-Max 50能量光譜儀 英國(guó)Oxford公司；Minispec核磁共振分析儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考高霞等的方法提取肌球蛋白，純化的肌球蛋白用含有NaCl的Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液溶解，使其鹽離子濃度為0.5 mol/L。采用Lowry法測(cè)定肌球蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.2 NFB的制備

參考Yin Tao等的方法，并稍作修改。將魚脊骨切成長(zhǎng)約3～5 mm的小段，加水漂洗除去血污和部分脂肪。然后，加入3 倍體積水將魚骨浸沒，在120 ℃（反壓蒸煮）下蒸煮1 h，去掉水煮液以脫除油脂，加清水漂洗數(shù)次瀝干。瀝干的魚骨用篩板孔徑為3 mm的絞肉機(jī)進(jìn)行粗破碎，之后加入1 倍體積冰水，用骨泥機(jī)細(xì)磨進(jìn)行微?；幚恚瑮l件為：磨盤轉(zhuǎn)速3 000 r/min，磨盤間隙0.3 mm，研磨次數(shù)2 次。進(jìn)一步將得到的魚骨加去離子水制備成5%的骨液，并用濕法高能球磨機(jī)進(jìn)行球磨。球磨條件為磨盤轉(zhuǎn)速3 000 r/min，磨球填充率85%，磨球直徑0.5 mm，球磨時(shí)間6 h，得到的樣品即為NFB（粒徑～280 nm）。樣品中的總鈣含量參考GB 5009.92—2016《食品中鈣的測(cè)定》方法測(cè)定。

1.3.3 不同加熱方式肌球蛋白樣品的制備

研究NFB對(duì)肌球蛋白膠凝過程中原子吸收光譜的影響時(shí)，用0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）將肌球蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為1.0 mg/mL，將NFB加入肌球蛋白中至總鈣濃度為40 mmol/L，同時(shí)控制整體的鹽離子濃度為0.5 mol/L。制備好的肌球蛋白樣品立即進(jìn)行加熱處理，加熱條件分別為：不加熱、一段式加熱（在40 ℃加熱60 min，記為S）、二段式加熱（先在40 ℃加熱60 min，再迅速轉(zhuǎn)移至90 ℃加熱30 min，記為S+K）。結(jié)束后，將肌球蛋白樣品用流動(dòng)水冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱保存待用，30 min內(nèi)立即進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)量。

1.3.4 鈣賦存形態(tài)測(cè)定

參考邢尚軍等的方法測(cè)定。取肌球蛋白凝膠樣品5 g，加入8 倍體積去離子水，均質(zhì)，37 ℃恒溫水浴振蕩60 min，8 000 r/min離心10 min，保留沉淀，傾出上清液，將其定容至100 mL，用原子吸收法測(cè)定提取液中的鈣含量（A）。取30 mL 0.5 mol/L NaCl溶液加入上一步驟保留的沉淀中，均質(zhì)，37 ℃恒溫水浴振蕩60 min，8 000 r/min離心10 min，保留上清液并將其定容至100 mL，用原子吸收法測(cè)定提取液中的鈣含量（B）。樣品中總鈣含量（C）的測(cè)定參考GB 5009.92—2016《食品中鈣的測(cè)定》。離子鈣的含量=A-B；螯合鈣的含量=B；不溶性鈣的含量=C-A。

1.3.5 表面元素測(cè)定

參考Grehn等的方法，使用能量光譜儀測(cè)定肌球蛋白凝膠的表面元素。樣品的處理步驟同掃描電鏡樣品。將干燥后的肌球蛋白凝膠粘于樣品臺(tái)，設(shè)置加速電壓為15 kV進(jìn)行面掃描，獲得樣品表面元素組成及鈣離子分布圖像。

1.3.6 光學(xué)顯微鏡分析

將肌球蛋白凝膠進(jìn)行冷凍切片處理，使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色5 min，結(jié)束后用蒸餾水沖洗除去多余的染液，晾干。再用茜素紅染液進(jìn)行復(fù)染5 min，結(jié)束后用蒸餾水沖洗，并于烘箱中烘干。將切片置于二甲苯溶液中浸泡5 min，取出晾干，并用中性樹脂封片。采用Nikon Eclipse CI光學(xué)顯微鏡觀察肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)為200 倍。

1.3.7 激光共聚焦顯微鏡分析

參考高霞等的方法，采用激光共聚焦顯微鏡觀察NFB添加前后肌球蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，并稍作修改。將肌球蛋白凝膠進(jìn)行冷凍切片處理，使用羅丹明B染料（濃度為10mol/L）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，待測(cè)。

1.3.8 水分分布測(cè)定

參考Zhang Huimin等的方法測(cè)定肌球蛋白凝膠的低場(chǎng)核磁自旋-自旋弛豫時(shí)間。取5 g樣品用核磁膜包裹后放入10 mm核磁管中，隨后放入分析儀中。自旋-自旋弛豫時(shí)間T用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill（CPMG）序列進(jìn)行測(cè)量，參數(shù)設(shè)置為：掃描次數(shù)8 次，掃描迭代6 500 ms，回聲1 200，τ值（90°脈沖和180°脈沖之間的時(shí)間）為10 ms。用儀器自帶軟件分析T弛豫時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 NFB-Ca在肌球蛋白膠凝過程中賦存形態(tài)的變化

NFB中，鈣主要存在于羥基磷灰石與膠原交錯(cuò)互穿的結(jié)構(gòu)中，大部分以不溶性鈣形態(tài)存在。如表1所示，將NFB加入肌球蛋白后，樣品中離子鈣的含量在未加熱條件下僅占1.65%，40 ℃加熱處理顯著提高離子鈣含量（P＜0.05），隨后于90 ℃加熱又使部分離子鈣轉(zhuǎn)變成為另外2 種形態(tài)的鈣。螯合鈣含量變化與離子鈣呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。此外，前期實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，NFB中可溶性鈣的含量約為8.88%～14.02%，本實(shí)驗(yàn)中添加NFB的肌球蛋白凝膠中可溶性鈣（離子鈣+螯合鈣）質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于8.88%，不溶性鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，推測(cè)NFB中部分可溶性鈣以鹽橋方式參與凝膠形成轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄遭}。Jiang Yang等已證實(shí)加熱會(huì)顯著提高NFB中可溶性鈣的含量。然而，本研究表明與未加熱條件相比，一段式加熱和二段式加熱處理顯著提高了添加NFB的肌球蛋白凝膠中不溶性鈣的含量（P＜0.05）。該結(jié)果說明，肌球蛋白膠凝過程中，NFB釋放出的可溶性鈣部分轉(zhuǎn)變成不可溶性鈣。前期研究發(fā)現(xiàn)，熱膠凝過程中，肌球蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)變得伸展，并暴露出帶電基團(tuán)（COO），Ca與帶電基團(tuán)（COO）之間形成鹽橋，推測(cè)該鈣橋的形成使Ca被包埋在肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)中，致使不溶性鈣含量增多。

表1 NFB-Ca在肌球蛋白膠凝過程中賦存形態(tài)的變化Table 1 Changes in occurrence form of NFB-Ca during myosin gelation

2.2 NFB對(duì)肌球蛋白表面元素的影響

如表2所示，未加熱條件下，NFB中礦物元素含量最多的是Ca（8.29±0.10）keV和P（5.25±0.25）keV，Na和Mg的含量相對(duì)較低。魚骨的無機(jī)相主要由磷酸氫鈣（CaHPO）和羥基磷灰石（Ca(PO)(OH)）構(gòu)成，這解釋了NFB中Ca、P含量較高的原因。一段式加熱和二段式加熱處理顯著提高了NFB表面Ca、P含量（P＜0.05），推測(cè)這是由于加熱處理破壞了NFB的晶體結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了Ca、P向表面遷移。加熱過程中，NFB中的Ca/P無顯著變化（P＞0.05）。

加熱前，相較于肌球蛋白組，添加NFB的肌球蛋白樣品組中Ca含量顯著升高（P＜0.05）。40 ℃加熱后，添加NFB的肌球蛋白表面鈣元素較未加熱條件下增長(zhǎng)了約51%，隨后于90 ℃加熱其表面鈣元素進(jìn)一步增多，與未加熱相比提高了約85%。然而，加熱過程中未添加NFB的肌球蛋白樣品表面鈣元素?zé)o顯著變化（P＞0.05）。該結(jié)果說明肌球蛋白膠凝過程中表面鈣元素的增加主要來源于NFB的添加，且進(jìn)一步反映加熱可促進(jìn)NFB中Ca的釋放。

表2 NFB的添加對(duì)肌球蛋白表面元素的影響Table 2 Effect of NFB on surface elements of myosin keV

能譜結(jié)合電鏡分析是一種監(jiān)測(cè)樣品中元素分布的有效手段。如圖1所示，綠色圓點(diǎn)表示分布在肌球蛋白表面的鈣元素。所有樣品中均存在鈣元素。未加熱時(shí)，鈣元素較少且分布不均勻，一段式加熱和二段式加熱處理后，肌球蛋白表面鈣元素逐漸增多，分布的均勻性也有所提升，在加熱過程中，NFB晶體結(jié)構(gòu)被破壞，釋放出部分鈣，膠凝時(shí)肌球蛋白與鈣形成鹽橋，形成了較為均一的凝膠結(jié)構(gòu)，使表面鈣元素分布得更加均勻。

圖1 添加NFB的肌球蛋白在膠凝過程中表面鈣元素的分布狀況Fig. 1 Calcium distribution on the surface of myosin with the addition of NFB during gelation

2.3 光學(xué)顯微鏡分析

茜素紅可將鈣鹽染成玫紅色，而考馬斯亮藍(lán)可將蛋白質(zhì)染成亮藍(lán)色，茜素紅與考馬斯亮藍(lán)雙染能夠較好地表征熱膠凝時(shí)肌球蛋白樣品中鈣鹽的分布與凝膠的結(jié)構(gòu)變化。如圖2所示，空白組中（未加NFB），樣品均被染成亮藍(lán)色，未觀察到玫紅色，說明空白組中Ca含量較少；NFB加入后，樣品中均觀察到玫紅色，表明樣品中Ca含量明顯增多，這與表面元素的結(jié)果（表2）一致。

未加熱條件下，空白組與NFB組中肌球蛋白均以粗絲形式存在。40 ℃加熱處理后，肌球蛋白樣品形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但是孔隙較大。相較于空白組，NFB組中的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為連續(xù)，二段式加熱處理后，NFB組形成了更為致密的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Jia Dan等研究發(fā)現(xiàn)，Ca會(huì)誘導(dǎo)肌球蛋白的雙螺旋結(jié)構(gòu)變得伸展，在凝膠化及魚糕化過程中伸展的肌球蛋白進(jìn)一步通過疏水相互作用和二硫鍵發(fā)生聚集，形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖2 經(jīng)染色后的肌球蛋白樣品的光學(xué)顯微鏡圖Fig. 2 Optical microscopic images of stained myosin samples

2.4 CLSM結(jié)果

如圖3所示，未加熱條件下，相較于空白組，NFB組中肌球蛋白粗絲排列更為有序，粗絲間隙變小。本研究中蛋白體系pH值為7.5，高于pI 5.5，此時(shí)，肌球蛋白帶凈負(fù)電荷，根據(jù)Arfat等報(bào)道，推測(cè)NFB釋放的Ca與肌球蛋白所帶負(fù)電荷形成鹽橋，促進(jìn)了肌球蛋白粗絲之間發(fā)生交聯(lián)，使粗絲間隙減小。一段式加熱和二段式加熱處理后，相較于空白組，NFB組凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為均勻，粗糙程度有所改善。加熱過程中，Ca誘導(dǎo)肌球蛋白構(gòu)象改變，同時(shí)暴露疏水性氨基酸殘基、巰基等功能性基團(tuán)，這有利于蛋白質(zhì)之間通過疏水相互作用、二硫鍵形成聚集體，進(jìn)而形成均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖3 NFB加入后肌球蛋白在不同加熱方式下的激光共聚焦圖像Fig. 3 CLSM images of myosin with the addition of NFB during gelation

2.5 NFB對(duì)肌球蛋白水分分布的影響

低場(chǎng)核磁技術(shù)是一種安全、非破壞性的檢測(cè)手段，被廣泛地用來監(jiān)測(cè)食品中水分的分布與流動(dòng)性。如圖4所示，肌球蛋白膠凝過程中存在2 個(gè)水分分布峰，分別位于65.79～403.7 ms和464.16～1 873.82 ms附近。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，這2 個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)不易流動(dòng)水（T）和自由水（T）。表3為膠凝過程中肌球蛋白T弛豫時(shí)間的變化?？瞻捉M中，隨著加熱的進(jìn)行，T向低弛豫時(shí)間移動(dòng)，表明水分子的流動(dòng)性降低，推測(cè)這是由于加熱過程中形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖3）將水分子束縛其中。與空白組相比，加入NFB顯著降低了T弛豫時(shí)間（P＜0.05），表明自由水的流動(dòng)性降低。根據(jù)Ahmad等報(bào)道，推測(cè)NFB釋放的Ca與熱處理使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出水分子結(jié)合位點(diǎn)，這有利于提高蛋白質(zhì)的水合作用，降低自由水流動(dòng)性；此外，加入NFB后形成更致密的微觀結(jié)構(gòu)（圖2、3）也有利于增強(qiáng)對(duì)水分子的束縛能力，降低水分子流動(dòng)性。

圖4 NFB對(duì)肌球蛋白加熱過程中水分分布的影響Fig. 4 Effect of NFB on LF-NMR spetrum of myosin under different heating conditions

表3 NFB對(duì)肌球蛋白T2弛豫時(shí)間的影響Table 3 Effect of NFB on T2 relaxation time of myosin

3 結(jié) 論

NFB中含有較多的Ca、P元素，加入肌球蛋白后，NFB-Ca仍以不溶性鈣形態(tài)為主（＞95%），加熱處理促進(jìn)了Ca元素向表面遷移。隨著加熱的進(jìn)行，樣品中部分可溶性鈣以鹽橋方式參與形成肌球蛋白凝膠，促進(jìn)形成較為致密的凝膠結(jié)構(gòu)，有利于增強(qiáng)對(duì)水分子的束縛，降低自由水的流動(dòng)性，同時(shí)提高了表面Ca元素的分布均勻性。綜上，肌球蛋白膠凝過程中NFB-Ca賦存形態(tài)發(fā)生改變，部分離子鈣通過參與形成鹽橋的形式轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄遭}，促進(jìn)肌球蛋白形成均勻致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了對(duì)水分子的束縛能力。