吳秦超 金波 張顯敏

過敏性紫癜（henoch-schonlein purpura，HSP）是多系統(tǒng)免疫球蛋白A 介導的兒童常見血管變態(tài)反應性疾病，主要表現(xiàn)為非血小板減少性的皮膚紫癜、腹部不適、關(guān)節(jié)炎或下肢大關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)痛等關(guān)節(jié)癥狀，部分患兒有腎臟、呼吸受累風險［1］。HSP 發(fā)生的原因可能是由肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）感染引起的呼吸道感染，可導致兒童口咽、鼻咽菌群紊亂，還會引起除呼吸道癥狀以外的廣泛組織損傷。近年來有研究報道［2］，HSP 患兒常合并MP 感染，1 個月至18 歲兒科患者的MP 感染率為30.3%～37.5%。而B淋巴細胞在HSP 發(fā)病中起主要作用，患兒體內(nèi)B細胞活性增強，分泌到血液中的IgA、IgM 增多，從而增強體液免疫［3］。維生素D 是兒童生長發(fā)育必不可少的微量元素，維生素D 可參與骨代謝調(diào)節(jié)鈣磷水平并參與機體免疫反應，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)維生素D 與許多兒童常見的感染性自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［4］。本研究選取HSP患兒為研究對象，探究HSP 合并MP 感染患兒呼吸道菌群多樣性與維生素D、IL-6 及相關(guān)免疫指標間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2018年7月至2021年7月期間皖西衛(wèi)生職業(yè)學院附屬醫(yī)院兒科收治的HSP 患兒88 例為研究對象。根據(jù)MP 感染情況分未合并MP 感染HSP 組（n=49）與合并MP 感染HSP 組（n=39）。納入標準：①符合《兒童過敏性紫癜循證診治建議》［5］中HSP 的診斷標準并經(jīng)病原學檢查確診；②經(jīng)血清學方法診斷為MP 感染，表現(xiàn)為外周靜脈血MP 抗體陽性［6］。③年齡2～15 歲；④發(fā)病時間＜5 d；⑤患兒家屬知情并簽署同意書。排除標準：①患有免疫缺陷性疾病或代謝疾病；②患有意識障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病或依從性差，無法配合研究；③近一個月內(nèi)服用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或維生素D 補充治療。未合并MP 感染HSP 組男28 例，女21 例，年齡（7.74±2.14）歲；合并MP 感染HSP 組男19 例，女20 例，年齡（7.62±2.63）歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)皖西衛(wèi)生職業(yè)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理會審批并通過。

1.2 呼吸道菌群檢測方法

專業(yè)護士指導患兒用溫開水漱口后用無菌痰液收集器收集患兒咳出的氣管深處痰液，保存于-80℃冰箱中待測。對標本作液化處理后加入裂解液裂解，轉(zhuǎn)至硅膠柱中吸附DNA，對目標基因片段進行PCR 擴增，回收擴增產(chǎn)物，用熒光定量系統(tǒng)對PCR 擴增回收產(chǎn)物定量后，采用NovaSeq6000 高通量測序儀（美國Illumina 公司）進行高通量測序，最后用QIIME 序列分析軟件分析呼吸道菌群多樣性。采用辛普森多樣性指數(shù)（Simpson index）與香農(nóng)-維納指數(shù)（Shannon index）［7］評估呼吸道菌群多樣性，Simpson 指數(shù)越小，Shannon 指數(shù)越大，表示物種數(shù)量越多。

1.3 25（OH）D、IL-6 及免疫指標檢測方法

于研究對象入院次日清晨采集空腹肘正中靜脈血10 mL，注入含有抗凝劑的試管中混勻，1 800×g 離心10 min（離心半徑10 cm）后取上層血清，保存于-80℃冰箱中待測。25（OH）D 檢測：采用XevoTQ-S 型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）及其配套試劑盒，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。IL-6 檢測：采用雙抗體夾心法使用試劑盒（廣州祺正生物科技有限公司）進行測定。IgM 檢測：采用Cobas e 601 型全自動化學發(fā)光免疫分析儀（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）采用免疫透射比濁法進行測定。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS Statistics 21 統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。采用Spearmen 分析患兒呼吸道菌群多樣性與血清25（OH）D、IL-6 及免疫指標的關(guān)系，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組呼吸道菌群多樣性比較

Simpson 指數(shù)：合并MP 感染HSP 組大于未合并MP 感染HSP 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Shannon 指數(shù)：未合并MP 感染HSP 組大于合并MP 感染HSP 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組Simpson 與Shannon 指數(shù)比較（±s）Table 1 Comparison of Simpson and Shannon indices between two groups（±s）

表1 兩組Simpson 與Shannon 指數(shù)比較（±s）Table 1 Comparison of Simpson and Shannon indices between two groups（±s）

組別合并MP 感染HSP 組未合并MP 感染HSP 組t 值P 值n 39 49 Simpson 指數(shù)0.75±0.06 0.36±0.04 36.467＜0.001 Shannon 指數(shù)0.79±0.10 1.51±0.25 16.924＜0.001

2.2 兩組25（OH）D、IL-6、IgM 水平比較

IL-6 水平：合并MP 感染HSP 組大于未合并MP 感染HSP 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；25（OH）D 水平：未合并MP 感染HSP 組大于合并MP 感染HSP 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；IgM 水平：未合并MP 感染HSP 組大于合并MP感染HSP 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組25（OH）D、IL-6、IgM 水平比較（±s）Table 2 Comparison of 25（OH）D，IL-6 and IgM levels between two groups（±s）

表2 兩組25（OH）D、IL-6、IgM 水平比較（±s）Table 2 Comparison of 25（OH）D，IL-6 and IgM levels between two groups（±s）

組別合并MP 感染HSP 組未合并MP 感染HSP 組t 值P 值n 39 49 25（OH）D（ng/mL）13.17±3.89 17.65±4.31 5.055＜0.001 IL-6（pg/mL）19.74±3.36 16.27±3.54 4.671＜0.001 IgM（g/L）0.92±0.26 1.32±0.47 4.763＜0.001

2.3 呼吸道菌群多樣性與血清25（OH）D、IL-6 及免疫指標的相關(guān)性分析

Spearmen 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HSP 合并MP感染患兒Simpson 指數(shù)與血清25（OH）D、IgM 水平呈負相關(guān)，Shannon 指數(shù)與IL-6 水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 呼吸道菌群多樣性與血清25（OH）D、IL-6 及免疫指標的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of respiratory flora diversity and serum 25（OH）D，IL-6 and immune indexes

3 討論

目前HSP 發(fā)病機制尚不完全清楚，但遺傳因素和環(huán)境因素（接觸過敏原、微生物感染、藥物等）與HSP 的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切。MP 是兒童呼吸道感染的主要病原體之一，可引起較輕的上呼吸道感染（咽炎、鼻竇炎）和嚴重的下呼吸道感染（支氣管炎、肺炎）并損害肺外系統(tǒng)［8-9］。目前MP 感染患者存在大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率升高、多種全身并發(fā)癥、治療難度增加等問題［10］。因此，加強相關(guān)研究對指導臨床開展針對性治療及改善HSP 合并MP 感染患兒預后具有重要意義。

HSP 患兒紫癜皮膚的毛細血管內(nèi)的沉積物中含有大量IgA，這主要與T淋巴細胞、B淋巴細胞活性增強，導致產(chǎn)生大量IgA 免疫復合物，進而引起IgA 介導的免疫反應有關(guān)。此外，T 淋巴細胞亞群功能失調(diào)及相關(guān)細胞因子的異常分泌等免疫失衡也是HSP 發(fā)病的重要因素之一。HSP 急性期時IgM 水平會發(fā)生變化，本研究中合并MP 感染HSP 組患兒血清IgM 水平低于未感染組，Simpson 指數(shù)與血清IgM 水平呈負相關(guān)，提示MP感染可導致HSP 患兒呼吸道菌群多樣性下降，且IgM 水平降低可能與MP 感染所致的HSP 發(fā)病有關(guān)，這與雷小葆等［11］的研究結(jié)果部分相符。白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是一種重要的細胞因子，主要由Th2 細胞分泌，可促進細胞外微生物病原體保護性抗體的分泌。研究表明［12］，IL-6 在MP 感染的發(fā)病機制中起重要作用，IL-6-174 G/C基因型會使患者的感染率上升。MP 刺激白細胞介素和腫瘤壞死因子α 的產(chǎn)生，并可引起血管炎，介導HSP 的發(fā)生發(fā)展。本研究中，合并MP 感染HSP 組患兒的IL-6 水平顯著高于未感染HSP 組，提示IL-6 與HSP 合并MP 感染患兒呼吸道菌群多樣性密切相關(guān)，與張潔等［13］的報道相似。其機制可能是通過引起患兒免疫應答失衡，誘導大量促炎因子生成，形成相應組織的自身抗體與抗原-抗體復合物，沉積于小血管壁上，引起血管炎為主的病理改變有關(guān)。維生素D 是一類脂溶性維生素，其在調(diào)節(jié)免疫功能、炎癥反應等方面均具有重要作用，在多種自身免疫性疾病中扮演重要角色。維生素D 在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化為25（OH）D，25（OH）D 半衰期長，在血液中濃度穩(wěn)定，是反映人體內(nèi)維生素D 水平的最佳指標［14］。維生素D 促進T 調(diào)節(jié)細胞的誘導，刺激炎癥細胞因子如TNFα 的表達。先前的研究表明，維生素D 缺乏會導致呼吸道病原體感染的風險增加，25（OH）D 不足的兒童，更容易受到流感、呼吸道病毒、呼吸道病原菌和MP 等病原微生物的侵害［15］。HSP 患兒血清25（OH）D 水平降低，導致患兒T 細胞功能改變，B 細胞多克隆活化，體液免疫反應總體處于亢進狀態(tài)，從而促進HSP 的發(fā)生及發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，HSP 合并MP 感染患兒血清25（OH）D 水平明顯降低，且隨著患兒感染程度呈逐漸降低趨勢，與董顯燕等［16］研究結(jié)果相一致，這提示25（OH）D 與HSPMP 感染程度有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)HSP 合并MP 感染患兒呼吸道菌群多樣性與血清25（OH）D、IL-6 及免疫指標IgM 顯著相關(guān)，提示上述指標可能參與了HSP合并MP 感染過程。在臨床治療中，治療原發(fā)MP感染的同時，可通過補充免疫抑制劑、維生素D 等途徑調(diào)節(jié)免疫平衡以獲得更好的治療效果。本研究還存在許多不足之處：①研究樣本量較少，且研究對象均來自皖西衛(wèi)生職業(yè)學院附屬醫(yī)院，可能由于地域、文化或習俗差異，導致代表性不高。②未對其信號通路及具體機制做深入分析。希望將來可進行多中心、大樣本的前瞻性研究，以便更深入地探究HSP 合并MP 感染患兒呼吸道菌群多樣性與血清25（OH）D、IL-6 及免疫指標的相關(guān)性及機制。