輔助生殖技術(shù)中PGT嵌合體胚胎的發(fā)生比例及處理對策

秦文松，劉英，秦輝靈，雷金鳳，林慧，段金良

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing，PGT)是指在輔助生殖技術(shù)過程中，在胚胎移植入子宮前，活檢胚胎細(xì)胞，對胚胎23對染色體進(jìn)行分析，選擇整倍體胚胎植入子宮，以期提高試管嬰兒的成功率。但是有相關(guān)研究報(bào)道，PGT對胚胎的判斷并不是“非黑即白”，而多了一個(gè)“灰色區(qū)域”需要被考慮，即嵌合體[1]。

嵌合體是指胚胎中存在兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的染色體細(xì)胞系，是人類植入前胚胎的普遍特征[2]。嵌合主要是來源于受精卵細(xì)胞分裂過程中的有絲分裂錯(cuò)誤，包括細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的改變、中心體的畸變、染色單體內(nèi)聚力的下降[3]、單核苷酸變異以及小的插入/缺失等[1]。染色體的嵌合主要包括兩種：一種是兩個(gè)或兩個(gè)以上的異常細(xì)胞系(如非整倍體/非整倍體) ；另一種是正常細(xì)胞系和異常細(xì)胞系(如整倍體/非整倍體)。與胚胎所有細(xì)胞的完全異常非整倍體相反，嵌合體可能通過多種機(jī)制發(fā)生，包括后期延遲、絲裂相分離、偶然的染色體破壞和DNA復(fù)制前的早期細(xì)胞分裂[2]。此外，嵌合性可能局限于發(fā)育中胚胎的某一特定區(qū)域，這對于囊胚階段的胚胎尤其如此，在這個(gè)階段，滋養(yǎng)外胚層中的細(xì)胞可能表現(xiàn)出嵌合性，而內(nèi)細(xì)胞團(tuán)不受影響。因此，如何正確對嵌合體胚胎的測序結(jié)果進(jìn)行判讀，如何選擇合適的嵌合體胚胎移植風(fēng)險(xiǎn)最低便顯得尤為重要,本文擬探討PGT嵌合體胚胎的發(fā)生比例和處理對策。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年3月至2020年9月在中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)部行PGT的276例患者，共704枚活檢胚胎(囊胚)數(shù)據(jù)資料，滿足以下條件之一者納入統(tǒng)計(jì)：女方年齡≥38歲、反復(fù)流產(chǎn)(≥2次)、胚胎反復(fù)著床失敗(至少連續(xù)3次胚胎移植周期且每周期至少有1枚優(yōu)質(zhì)胚胎仍未獲得臨床妊娠)、男女雙方任意一方存在染色體異常(易位、倒位等)。入組患者經(jīng)過促排卵、取卵、體外受精、囊胚培養(yǎng)，選擇D5/D6為3BB及以上的囊胚進(jìn)行活檢(囊胚評(píng)分參考Gardner評(píng)分系統(tǒng))，在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對側(cè)進(jìn)行激光輔助孵化，培養(yǎng)3～4 h后對孵出的外滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行活檢，將活檢的細(xì)胞裝入PCR管后進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，后將擴(kuò)增產(chǎn)物送檢測序(采用DA8600高通量測序平臺(tái)完成全基因組測序)。該276例患者中，有6例患者無整倍體胚胎可供移植，僅有1枚或數(shù)枚單條染色體或單一片段嵌合異常(嵌合率≤50%)的胚胎。在進(jìn)行遺傳咨詢并知曉相關(guān)遺傳風(fēng)險(xiǎn)，提交倫理審查通過后，簽署知情同意書，擬定胚胎解凍移植。

1.2 內(nèi)膜準(zhǔn)備及胚胎解凍移植

均采用人工周期進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備?；颊哂谠陆?jīng)第3天口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂)2 mg/d，定期B超監(jiān)測，視內(nèi)膜情況調(diào)整補(bǔ)佳樂用量。待內(nèi)膜≥8 mm時(shí)開始肌注黃體酮，于肌注黃體酮后第5天進(jìn)行胚胎解凍移植，移植后繼續(xù)黃體支持。

1.3 妊娠結(jié)局的確定

胚胎移植后14 d抽血驗(yàn)β-hCG，陽性者繼續(xù)黃體支持，移植后28 d行B超見宮內(nèi)孕囊及胎心搏動(dòng)者確定為臨床妊娠。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)數(shù)資料均采用率(%)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。

2 結(jié)果

2.1 胚胎高通量測序結(jié)果

總共活檢胚胎704枚，其中染色體無明顯異常胚胎為388枚，占55.75%(388/696)；異常胚胎為308枚，占44.25%(308/696)，8枚胚胎的活檢細(xì)胞未通過質(zhì)檢未進(jìn)行后續(xù)測序。

2.2 不同嵌合類型胚胎所占比例

將嵌合體胚胎劃分成兩組：a、多條片段嵌合異常；b、單條染色體或單一片段嵌合異常，并對其所占比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示：多條染色體或多條片段嵌合異常胚胎所占比例為31.17%(96/308)，單條染色體或單一片段嵌合異常胚胎所占比例為19.48%(60/308)。

2.3 移植嵌合體胚胎患者信息及臨床結(jié)局

在移植嵌合體胚胎的6例患者中，生化妊娠率為50%(3/6)，臨床妊娠率為33.33%(2/6)，流產(chǎn)率為33.33%(1/3)。在獲得臨床妊娠的患者中，嵌合率最低(33.33%)，且異常片段最短(19.35 Mb)的患者活產(chǎn)1女嬰(外觀無異常)。另一獲得妊娠的患者，雖然異常片段較長(38.72 Mb)，但嵌合率也較低(38.1%)，最后活產(chǎn)1男嬰(外觀無異常)。具體結(jié)果詳見下頁表1。

表1 6例嵌合體胚胎移植患者情況及結(jié)局

3 討論

嵌合體胚胎給PGT結(jié)果的解釋以及患者的遺傳咨詢帶來了新挑戰(zhàn)。通過高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)表明，應(yīng)該報(bào)告和使用“嵌合”來幫助決定哪些胚胎應(yīng)該優(yōu)先移植[4]。Greco E等[4]對嵌合體胚胎移植進(jìn)行了研究，結(jié)果表明大多數(shù)嵌合體胚胎不能移植或?qū)е略缙诹鳟a(chǎn)，但有一少部分嵌合體胚胎移植后可分娩健康的嬰兒。中國臺(tái)灣的Liu YL等[5]也做了嵌合體胚胎移植獲得活產(chǎn)的相關(guān)報(bào)道。另外，還有學(xué)者研究了嵌合程度和涉及的非整倍體的類型(即染色體以及它是三體還是單體)對嵌合胚胎發(fā)育潛力的影響。其數(shù)據(jù)顯示非整倍體細(xì)胞百分比低及單體或三體的胚胎更可能有機(jī)會(huì)植入[6-7]。本文的結(jié)果也顯示，獲得妊娠的胚胎其嵌合率均在40%以下。最近在小鼠染色體嵌合模型中獲得的數(shù)據(jù)表明，嵌合率在50%的胚胎都能成功植入，而嵌合率在75%的胚胎只有44%能成功植入。根據(jù)這個(gè)模型，高比例的非整倍體細(xì)胞可以從囊胚階段開始逐漸減少，進(jìn)而降低對正常細(xì)胞的影響[8]。根據(jù)這些結(jié)果，可以認(rèn)為嵌合體胚胎在活力方面代表了一個(gè)獨(dú)特的類別，介于正常胚胎和完全異常胚胎之間。這種類型的胚胎可能導(dǎo)致著床和妊娠潛能降低，以及遺傳異常和不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)增加。然而，還需要從前瞻性非選擇性研究中獲得更多的臨床數(shù)據(jù)來評(píng)估胚胎的嵌合狀態(tài)對于植入前胚胎發(fā)育潛能的臨床預(yù)測價(jià)值。

針對嵌合體胚胎如何處理這一問題，國際專業(yè)組織召集了專家小組，提出了有關(guān)嵌合體胚胎移植的建議[9]。然而，公布的指南是在基于臨床結(jié)果公開數(shù)據(jù)仍然有限的情況下編寫的。有些建議可能還需要根據(jù)不斷的調(diào)查結(jié)果加以探討[10]。例如，胚胎植入前遺傳診斷國際協(xié)會(huì)(Preimplantation Genetic Diagnosis International Society，PGDIS)建議，優(yōu)先移植單倍體/整倍體嵌合型胚胎而非三倍體/整倍體嵌合型胚胎，因?yàn)槌Ｈ旧w單倍體一般高度不育，而某些常染色體三倍體結(jié)局是并發(fā)相關(guān)身體和認(rèn)知障礙的活產(chǎn)。若打算將三倍體/整倍體嵌合型胚胎用于移植，PGDIS指南建議：① 優(yōu)先考慮chr.1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、17、19、20、22、X、Y三倍體嵌合體；② 由于存在單親二倍體可能，不考慮chr.14、15三倍體嵌合體；③ 由于存在宮內(nèi)生長發(fā)育遲滯可能，不考慮chr.2、7、16三倍體嵌合體；④ 由于存在三體綜合征活產(chǎn)可能，不考慮chr.13、18、21三倍體嵌合體[11-12]。

展望未來，希望科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步能夠準(zhǔn)確識(shí)別嵌合胚胎，減少對潛在可存活胚胎的丟棄，這將是一項(xiàng)重要的成就，尤其是對于那些卵巢儲(chǔ)備不足、只能產(chǎn)生有限數(shù)量胚胎的患者，或者那些只檢測到染色體異常胚胎的患者。精確分類嵌合胚胎的潛力可能是輔助生殖過程中的另一個(gè)額外工具，有可能降低丟棄嵌合胚胎的風(fēng)險(xiǎn)，提高助孕成功率。