周 琪, 呂 享, 林 冰, 田小橋, 鐘雙萍, 李佩儀

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)食品安全質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，貴陽 550025)

朱砂根(ArdisiacrenataSims)是紫金?？谱辖鹋僦参颷1]，耐蔭性強(qiáng)，四季常綠，掛果時(shí)間長，碩果鮮艷[2]，常作為觀賞植物，其干燥根為傳統(tǒng)中藥材[3]。現(xiàn)代藥理表明，朱砂根干燥根具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抑制血小板凝聚、降血壓等多方面的作用[4-6]。朱砂根藥材在民間和藥企有較大的使用量，市場需求量逐年增加。目前，朱砂根藥材主要來源于野生資源，隨著無限制的采挖，野生資源瀕臨枯竭，人工種植勢在必行。朱砂根的繁殖方法主要有播種[7]、扦插、壓條、組織培養(yǎng)等。研究表明，種子繁殖易出現(xiàn)性狀分離，生長一致性差，影響朱砂根規(guī)?；鏪8]。為解決上述問題，有學(xué)者開展了愈傷誘導(dǎo)[9]、幼莖叢生芽誘導(dǎo)[10]等生物技術(shù)研究，但未見采用朱砂根種胚進(jìn)行無菌苗培養(yǎng)的報(bào)道。本試驗(yàn)以朱砂根種胚為材料，從消毒滅菌、基本培養(yǎng)基、胚齡選擇、生長壯苗配方、移栽基質(zhì)等方面開展育種技術(shù)研究，旨在掌握朱砂根種胚繁殖的調(diào)控技術(shù)，為朱砂根種胚離體培養(yǎng)及育苗生產(chǎn)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)所用材料取自貴州中醫(yī)藥大學(xué)育苗大棚中朱砂根植株上的種子，由本校魏升華教授鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子表面消毒滅菌

取不同成熟度的朱砂根種子，分別用75%酒精消毒0.5 min和1 min，再用0.1% HgCl2溶液分別處理6 min、8 min、10 min、12 min。消毒滅菌后，無菌水清洗5次，用濾紙吸干種子表面水分，接種于MS培養(yǎng)基，每組3瓶，每瓶3粒種子，重復(fù)3次，置光照培養(yǎng)箱，25 ℃暗培養(yǎng)3 d，觀察并統(tǒng)計(jì)污染率。

1.2.2種子萌發(fā)的前處理

取已消毒滅菌好的成熟種子與未成熟種子，分別用解剖刀于無菌操作臺(tái)上去掉種子果皮、切去1/3胚乳、取種胚，處理后即刻轉(zhuǎn)接于已處理好的MS培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定為(23±2)℃，光照周期12 h/d，光照強(qiáng)度為2 500 lx(下同)條件下培養(yǎng)。每組處理3瓶，每瓶接3個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)成苗率及觀察無菌苗長勢。

1.2.3胚齡的選擇

分別取37 d、42 d、47 d、52 d、57 d等5個(gè)胚齡的種胚，接種于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)，考察胚齡對種胚萌發(fā)的影響。每組接3瓶，每瓶接3個(gè)種胚，重復(fù)3次，培養(yǎng)12 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.2.4種胚萌發(fā)基本培養(yǎng)基的選擇

分別以MS、1/2 MS、1/4 MS、WPM四種培養(yǎng)基為萌發(fā)培養(yǎng)基，取種胚，每組接3瓶，每瓶接3個(gè)種胚，重復(fù)3次，培養(yǎng)12 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，篩選適宜萌發(fā)的基本培養(yǎng)基。

1.2.5無菌幼苗生長基本培養(yǎng)基的選擇

將萌發(fā)早且萌發(fā)率高的萌發(fā)幼苗分別接種于MS、1/2 MS、1/4 MS、WPM等4種培養(yǎng)基上生長，樣本量同1.2.4，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)株高、葉片數(shù)和根條數(shù)。

1.2.6無菌苗株型與移栽存活率的相關(guān)性考察

將培養(yǎng)所得無菌苗以株高和根粗兩個(gè)指標(biāo)分成6個(gè)級(jí)別，即株高(高：25.61～49.10 mm；中：19.17～25.07 mm；低：7.85～19.15 mm)，根粗(高：1.83～2.79 mm；中：1.57～1.79 mm；低：1.12～1.56 mm)，每個(gè)級(jí)別設(shè)3個(gè)重復(fù)，每組16株無菌苗，共計(jì)18組，同時(shí)統(tǒng)計(jì)根條數(shù)、莖粗和葉片數(shù)。移栽至育苗基質(zhì)∶腐殖土(質(zhì)量比)為1∶1的基質(zhì)中培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)移栽存活率。

1.2.7無菌苗株型正交優(yōu)化

為提高無菌苗的抗性，在基本培養(yǎng)中分別添加蔗糖、NAA和6-BA，設(shè)計(jì)此正交試驗(yàn)因素水平表(表1)。選取生長狀況相對一致的無菌幼苗，接至相應(yīng)培養(yǎng)基上，每組接3瓶，每瓶接1株，重復(fù)3次，每隔3 d觀察一次，觀察42 d后統(tǒng)計(jì)各生長指標(biāo)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Level table of orthogonal test factors

1.2.8煉苗移栽

選取生長狀況良好的無菌苗，煉苗3 d，分別移栽至育苗基質(zhì)∶腐殖土(質(zhì)量比為1∶1，JZ 1)、育苗基質(zhì)∶黃壤土(質(zhì)量比為1∶1，JZ 2)和純育苗基質(zhì)(JZ 3)中。每種基質(zhì)移栽30株，做3次重復(fù)，30 d后統(tǒng)計(jì)存活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

相關(guān)分析采用GraphPad Prism 8.0軟件分析作圖，其他數(shù)據(jù)均采用Excel 2016和SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

污染率(%)=(污染的種子數(shù)/接種數(shù))×100%；

萌發(fā)率(%)=(萌發(fā)數(shù)/接種數(shù))×100%；

存活率(%)=(存活數(shù)/移栽數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌效果

為保護(hù)種胚免受消毒滅菌劑的損害，直接以朱砂根果實(shí)進(jìn)行無菌處理，結(jié)果(表2)表明，酒精的處理更有效，表明消毒滅菌劑的穿透能力對果實(shí)類材料滅菌效果尤為突出，最終確定朱砂根果實(shí)消毒滅菌參數(shù)為75%酒精1 min + 0.1% HgCl210 min。

表2 滅菌處理效果Table 2 Effect of sterilization treatment

2.2 物理處理對種子萌發(fā)的影響

朱砂根果實(shí)是漿果類果實(shí)的代表之一，此類種子萌發(fā)受物理障礙較為突出，為提高萌發(fā)效率與萌發(fā)一致性，開展了物理障礙破除技術(shù)研究。結(jié)果(表3)表明，切除種子的部分胚乳，可顯著提高其萌發(fā)率(p<0.05)；成熟種子的種胚幾乎不能在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，未成熟種子的種胚萌發(fā)率達(dá)100%，這可能與種子的生理狀態(tài)有關(guān)(如種胚的含水量及細(xì)胞活性)。

表3 物理處理效果Table 3 The effect of physical processing

2.3 胚齡對種胚萌發(fā)的影響

植物種子的胚齡決定著種胚適應(yīng)環(huán)境的能力，據(jù)此，開展了適宜萌發(fā)的胚齡選擇研究。結(jié)果(圖1)顯示，在考察期內(nèi)，隨著胚齡增加，萌發(fā)率呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，47 d胚齡的萌發(fā)率達(dá)到峰值，之后萌發(fā)率開始下降，推測種胚內(nèi)種皮發(fā)育完善，一定程度上阻礙了種胚對養(yǎng)分的吸收。

圖1 種胚胚齡對萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of embryo age on germination rate

2.4 基本培養(yǎng)基對種胚萌發(fā)的影響

離體種胚的萌發(fā)不僅需要適宜的生長條件，還需充足的養(yǎng)分。培養(yǎng)基不同，其成分差異較大，因此選擇4種基本培養(yǎng)基進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。檢測結(jié)果(圖2)顯示，種胚在MS和WPM培養(yǎng)基中的萌發(fā)率顯著低于1/2 MS(p<0.05)，1/2 MS與1/4 MS無顯著性差異。培養(yǎng)12 d后，1/2 MS培養(yǎng)基中種胚長出綠色的子葉，且葉片全部展開，其他組的子葉未全部長出(圖3)。

注：“*”表示與1/2 MS組比有顯著性差異。圖2 不同培養(yǎng)基中種胚萌發(fā)情況Fig.2 Effects of different media on germination of seed embryos

注：A為MS培養(yǎng)基；B為1/2 MS培養(yǎng)基；C為1/4 MS培養(yǎng)基；D為WPM培養(yǎng)基。圖3 不同培養(yǎng)基對種胚萌發(fā)的影響Fig.3 Effects of different media on germination of seed embryos

2.5 基本培養(yǎng)基對無菌幼苗生長的影響

種胚萌發(fā)后，進(jìn)入無菌苗生長期，為獲得優(yōu)質(zhì)無菌苗，開展?fàn)I養(yǎng)需求研究。結(jié)果(表4,圖4)表明，1/2 MS和1/4 MS培養(yǎng)基中幼苗長勢最好，其次是WPM，MS最差。1/4 MS培養(yǎng)基對幼苗根的生長最有利。

表4 不同培養(yǎng)基對無菌苗生長的影響Table 4 Effects of different media on growth of sterile seedlings

注：A、B、C、D分別為在MS、1/2 MS、1/4 MS和WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的幼苗；E、F、G、H分別為對應(yīng)培養(yǎng)基中幼苗的根系。 圖4 不同培養(yǎng)基對無菌苗生長的影響Fig.4 The correlation between the survival rate and sterile seedling of different plant types

2.6 無菌苗株型對移栽存活率的影響

良好的植物株型不但能提高作物的產(chǎn)量，而且有助于植物移栽的成功率。結(jié)果(表5，圖5)表明，朱砂根無菌苗根條數(shù)與移栽存活率呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，其相關(guān)系數(shù)為0.533；然而莖粗與移栽存活率呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.689，這可能是葉片數(shù)與莖粗呈正相關(guān)的原因，單位葉片面積增加，蒸騰效應(yīng)提高，水分丟失加快，存活率下降。

注：A為JZ 1(育苗基質(zhì)與腐殖土質(zhì)量比為1∶1)；B為JZ 2(育苗基質(zhì)與黃壤土質(zhì)量比為1∶1)；C為JZ 3(純育苗基質(zhì))；D為不同基質(zhì)存活率條形圖。圖5 不同株型無菌苗與存活率的相關(guān)性Fig.5 The correlation between the survival rate and the aseptic vaccine of different plant types

表5 無菌苗株型與移栽存活率的相關(guān)性分析Table 5 Analysis of correlation between plant types and survival rate

2.7 正交試驗(yàn)株型優(yōu)化

為獲得根系發(fā)達(dá)、株型良好且移栽存活率高的無菌苗，本研究采用正交試驗(yàn)優(yōu)化幼苗培養(yǎng)條件。結(jié)果(表6)顯示，基本培養(yǎng)基與植物激素對幼苗根粗影響較大，蔗糖與基本培養(yǎng)基對幼苗莖粗影響較大。綜合分析，最佳無菌苗生長培養(yǎng)基為：1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+2.5 mg/L NAA+20 g/L蔗糖(pH=5.8)。

2.8 移栽基質(zhì)對移栽存活率的影響

以正交優(yōu)化得到的最優(yōu)培養(yǎng)基培養(yǎng)的無菌苗為材料，初步探討移栽的適宜培養(yǎng)基質(zhì)，結(jié)果(圖6)表明，在JZ 1中存活最高，且與JZ 2達(dá)到顯著水平，說明基質(zhì)的保濕、透氣對移栽存活率有較大影響。

注：A為JZ 1(育苗基質(zhì)與腐殖土質(zhì)量比為1∶1)；B為JZ 2(育苗基質(zhì)與黃壤土質(zhì)量比為1∶1)；C為JZ 3(純育苗基質(zhì))；D為不同基質(zhì)存活率條形圖；“*”表示與JZ 1組比較有顯著性差異。圖6 不同煉苗移栽基質(zhì)對無菌苗生長的影響Fig.6 Effects of different cultivation substrates on growth of sterile seedlings

3 結(jié)果與討論

引起植物種子休眠的因素十分復(fù)雜，有來自種皮及其掩蓋物的機(jī)械壓迫，種胚發(fā)育不成熟，種子不透氣、不透水，種皮抑制性成分等因素。本研究發(fā)現(xiàn)，朱砂根種子致密的種皮和堅(jiān)硬的胚乳是導(dǎo)致其萌發(fā)參差不齊的主要因素，嚴(yán)重影響其規(guī)模化育種。謝金蘭等[11]研究發(fā)現(xiàn)，楠木種子經(jīng)物理去皮后，顯著提高其萌發(fā)率和萌發(fā)的整齊度。耿曉東等[12]去除射干種子的種皮障礙后，使射干種子的萌發(fā)率提高了40.9%。曹小林等[13]研究海南紅豆種子萌發(fā)特性時(shí)，發(fā)現(xiàn)破除其種皮限制，能顯著改善種子發(fā)芽率、發(fā)芽速度、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)。本研究通過機(jī)械損傷朱砂根種子堅(jiān)硬的胚乳，可提高其萌發(fā)率(表3)，但整齊度依然不理想；之后，直接取其種胚進(jìn)行無菌培養(yǎng)，在12 d后均能整齊地發(fā)出子葉，長成幼苗(圖3、圖4)，表明朱砂根種子的機(jī)械壓迫是影響其萌發(fā)一致性的主要因素。因此，采用朱砂根種胚育種能較好地解決朱砂根種子萌發(fā)一致性差的問題。

胚齡主要通過種胚細(xì)胞的活力及種胚內(nèi)種皮形成過程中細(xì)胞排列的致密程度影響種胚萌發(fā)。許文天等[14]研究杧果胚齡對幼胚離體培養(yǎng)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)幼胚萌發(fā)率隨胚齡增大呈先升高后降低的變化趨勢。此外，蓮幼胚萌發(fā)實(shí)驗(yàn)也呈類似變化規(guī)律[15]。本研究結(jié)果也表明，朱砂根種胚的萌發(fā)率隨胚齡的改變呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律(圖1)，這為朱砂根種胚育種的取胚時(shí)間提供依據(jù)。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental results

韋媛等[16]研究表明，培養(yǎng)基中大量元素的濃度對植物種子萌發(fā)及其幼苗生長有較大的影響。本研究針對性地設(shè)計(jì)了一組大量元素遞減的基本培養(yǎng)基，探討大量元素對朱砂根種胚萌發(fā)及其幼苗生長的影響，也發(fā)現(xiàn)大量元素適當(dāng)減少有利于朱砂根種胚的萌發(fā)及其幼苗的生長(圖2、圖3、表4)。

植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源等成分對植物組織培養(yǎng)材料的生長發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[17-18]。張新超等[19]研究表明，適宜濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，對組培苗的生根率、根長及根粗度均具有顯著的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，朱砂根地上部分的葉片既多又大，水分蒸發(fā)不可避免，易導(dǎo)致移栽植株體內(nèi)水分供應(yīng)不平衡，致使苗木整株死亡，選擇基本培養(yǎng)基、蔗糖、6-BA和NAA四種培養(yǎng)基，進(jìn)行幼苗優(yōu)化培養(yǎng)，獲得了葉片數(shù)少，根系較為發(fā)達(dá)，根條數(shù)較多，莖細(xì)株高適中的無菌苗株型，顯著提高幼苗在開放環(huán)境中的生存能力，明顯提高移栽存活率。