王金花，張健琴，成良強，呂建偉，胡廷會，饒慶琳，姜 敏，王 軍

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院油料研究所，貴陽 550006； 2.安順學院，貴州 安順 561000)

花生(ArachishypogaeaL.)是重要的油料作物和經(jīng)濟作物，我國花生產(chǎn)量和單產(chǎn)均位居世界第一位，在保障國家油料供給安全、推進農(nóng)業(yè)結構調(diào)整中具有重要作用[1-3]。雜交育種是我國培育花生新品種的主要手段之一[4]，但花生雜交授粉成功率相對較低，在授粉之前檢驗花粉的生活力,掌握不同花生品種的花粉生活力,對于提高雜交育種授粉效率、合理進行雜交育種具有重要意義[5]。近年來，對于其他作物花粉活力檢測方法的研究較多，例如，通關藤[6]、思茅松[7]適合用I2-KI染色法，馬蹄蓮[8]、玉米[9]適合用TTC染色法，細香蔥[10]適合用聯(lián)苯胺染色法，但是關于花生花粉活力測定方法的報道較少。本試驗利用TTC染色法、卡寶品紅染色法、醋酸洋紅染色法、I2-KI染色法、紅墨水染色法以及離體萌發(fā)法等6種方法對花育23、四粒紅、吉花23進行花粉活力測定，通過不同測定方法的比較分析，篩選出適合花生花粉活力快速檢測的方法，為花生雜交育種提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

試驗采用吉花23、花育23及四粒紅等3個花生品種，試驗材料種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學院試驗基地，2021年6月24日播種，進行常規(guī)田間管理，于盛花期，選擇晴天07：00—08：00時采集盛開的花蕾，帶回實驗室取花粉進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1TTC染色法

在離心管中滴入1～2滴0.4%的TTC溶液，使花粉散在溶液中，將離心管置于35 ℃恒溫箱中放置1.5 h，取出后用移液槍吸取花粉懸浮液于載玻片上，鏡檢，有活力的花粉呈紅色，有微弱活力的花粉呈淡紅色，無活力或不育的花粉無色。

1.2.2卡寶品紅染色法

滴1～2滴卡寶品紅溶液于載玻片上，取少許花粉，攪拌均勻后蓋上蓋玻片，染色5～10 min，鏡檢，有活力的花粉被染成紫紅色，淺紅色的活力次之，未被染色或者無變化的花粉不具有活力。

1.2.3醋酸洋紅染色法

滴1～2滴1%的醋酸洋紅溶液于載玻片上，取少許花粉，攪拌均勻后蓋上蓋玻片，染色5～10 min，鏡檢，具有活力的花粉被染成紅色，無活力的花粉不被染色。

1.2.4I2-KI染色法

配制0.5% I2+2% KI溶液，貯于棕色瓶中，滴1～2滴I2-KI溶液于載玻片上，取少許花粉，攪拌均勻后蓋上蓋玻片，染色5～10 min，鏡檢，有活力的花粉呈紅棕色，無活力的花粉呈黃褐色。

1.2.5紅墨水染色法

配制5%的紅墨水溶液，滴1～2滴于載玻片上，取少許花粉，攪拌均勻后蓋上蓋玻片，立刻鏡檢，有活力的花粉不被染色，無活力的花粉被染成紅色。

1.2.6離體萌發(fā)法

配制花粉萌發(fā)培養(yǎng)基(15%蔗糖+0.5%硼酸+1%瓊脂，pH值5.8～6.2)，放在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用鑷子將花粉涂抹在預先準備好的培養(yǎng)基上，做好標記后，將培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)1.5 h后在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)的情況，以花粉管長度超過花粉直徑作為萌發(fā)標準，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率：

萌發(fā)率(%)=(已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個處理制作3個玻片，在OLYMPUS-IX 83倒置顯微鏡下觀察并拍照，每個玻片選取5個視野，統(tǒng)計花粉粒總數(shù)量不少于500個，計算花生花粉活力：

花粉活力(%)=(有活力的花粉數(shù)量/總花粉數(shù)量)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 26.0 軟件進行處理。

2 試驗結果

2.1 TTC染色法

TTC染色法對花生花粉的染色效果見圖1 A，TTC染色液處理后，所有的花粉呈黃褐色，未觀察到被染成紅色的花粉，花粉活力測定結果均為0，說明TTC染色法不易使花生花粉著色，因此，不適合用來測定花生花粉活力。

2.2 卡寶品紅染色法

卡寶品紅染色法對花生花粉的染色效果見圖1 B，所有的花粉都被染色，大部分花粉被染成紫紅色，少數(shù)畸形花粉被染成淺紫色，花粉活力檢測結果均為100%。因此，利用卡寶品紅染色法不能辨別出花生花粉是否具有活力，不適合花生花粉活力的測定。

2.3 醋酸洋紅染色法

醋酸洋紅染色法對花生花粉活力的染色效果見圖1 C，幾乎所有的花生花粉都被染成紅色，少數(shù)畸形花粉未被染色。醋酸洋紅染色法測得的3個花生品種的花粉活力分別為97.31%、93.80%和97.56%，3個品種的平均值為96.20%，最小值為76.92%，最大值為100.00%(見表1)。該方法測定結果偏高，不適合花生花粉活力的測定。

表1 醋酸洋紅染色法檢測花生花粉活力統(tǒng)計結果Table 1 Statical results of peanut pollen vitality detected by acetic acid magenta solution staining

2.4 I2-KI染色法

I2-KI染色法對花生花粉活力的染色效果見圖1 D，有活力的花粉淀粉含量高，被染成紅棕色，而無活力的花粉淀粉含量低，不被染色，呈黃褐色。I2-KI染色法測得的3個花生品種的花粉活力分別為84.88%、91.68%和87.99%，平均值為88.19%，最小值為73.91%，最大值為98.89%(見表2)。I2-KI染色法染色速度快，操作簡單，有活力的花粉與無活力的花粉差異明顯，適合用于測定花生花粉活力。

表2 I2-KI染色法檢測花生花粉活力統(tǒng)計結果Table 2 Statical results of peanut pollen vitality detected by I2-KI staining

2.5 紅墨水染色法

紅墨水染色法對花生花粉活力的染色效果見圖1E，有活力的花粉其細胞膜具有選擇透性，不能被紅墨水染色，無活力的花粉具有完全滲透性，被染成紅色。紅墨水染色法測得的3個花生品種的花粉活力分別為64.29%、63.86%和64.30%，平均值為64.15%，最小值為40.74%，最大值為81.48%(見表3)。紅墨水染色法染色速度快，操作簡單，有活力的花粉與無活力的花粉差異明顯，適合用于測定花生花粉活力。

表3 紅墨水染色法檢測花生花粉活力統(tǒng)計結果Table 3 Statical results of peanut pollen vitality detected by red ink staining

2.6 離體萌發(fā)法

花生花粉在萌發(fā)培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況見圖1 F，3個花生品種的花粉萌發(fā)率分別為60.50%、57.49%和57.90%，平均值為58.47%，最小值40.00%，最大值80.00%(見表4)。離體萌發(fā)法能直觀地反映花粉萌發(fā)情況，測定結果相對準確，但該方法對于培養(yǎng)溫度、營養(yǎng)成分、pH值要求較高，花費時間較長。

表4 離體萌發(fā)法檢測花生花粉活力統(tǒng)計結果Table 4 Statical results of peanut pollen vitality detected by in vitro germination method

2.7 不同花粉活力測定方法的比較

TTC染色法不能使花生花粉著色，所測的花粉活力值均為0，因此未進行花粉活力比較分析。由表5可知，不同方法測定的花粉活力值差異較大，其大小關系為：卡寶品紅染色法>醋酸洋紅染色法>I2-KI染色法>紅墨水染色法>離體萌發(fā)法；差異顯著性分析結果表明，5種方法間存在極顯著差異，卡寶品紅染色法、醋酸洋紅染色法、I2-KI染色法測定結果顯著高于紅墨水染色法和離體萌發(fā)法(p<0.05)；在花育23和吉花23中，卡寶品紅染色法與醋酸洋紅染色法測定結果差異不顯著，兩者均顯著高于I2-KI染色法的測定結果，在四粒紅中，卡寶品紅染色法測定結果顯著高于醋酸洋紅染色法和I2-KI染色法，而醋酸洋紅染色法和I2-KI染色法測定結果差異不顯著；紅墨水染色法的測定結果最接近離體萌發(fā)法，在花育23和吉花23中，紅墨水染色法與離體萌發(fā)法的測定結果在p<0.05水平上差異不顯著，而在四粒紅中，紅墨水染色法與離體萌發(fā)法的測定結果在p<0.01水平上差異不顯著(表5)。

表5 花生花粉活力不同測定方法的結果比較Table 5 Comparison of determination methods of peanut pollen vitality

注：A為TTC染色法；B為卡寶品紅染色法；C為醋酸洋紅染色法；D為I2-KI染色法；E為紅墨水染色法；F為離體萌發(fā)法。 圖1 不同方法檢測花生花粉活力鏡檢結果Fig.1 Microscopic examination results of peanut pollen vitality detected by different methods

3 討論與結論

離體萌發(fā)法可以直接觀測到花粉的萌發(fā)情況，本試驗中，3個花生品種的花粉均能較好地萌發(fā)，并且萌發(fā)率基本穩(wěn)定，是花粉活力測定的首選方法，這與在馬蹄金[11]、卵葉海桑[12]中的研究結果是一致的，但是該方法操作復雜，花費時間長，不適合花粉活力的快速檢測。染色法具有快速簡便的優(yōu)點，能夠在一定程度上直接反映花粉的活力，但受花粉特性的影響較大，不同植物適用不同的染色法[13]，本研究中，紅墨水染色法染色效果好，操作簡單，且測定結果最接近離體萌發(fā)法，是快速測定花生花粉活力最適合的方法，在王偉偉等[14]的研究中，藍墨水染色法是快速測定柳樹花粉活力最合適的方法。紅墨水染色法的測定原理是有活力的花粉其細胞膜具有選擇透性，不能被紅墨水染色，無活力的花粉具有完全滲透性，被染成紅色，但隨著染色時間的延長，多數(shù)花粉會失去選擇透性，這與任飛艷等[12]的研究結果一致，因此在使用該方法時操作要迅速，染色后立即拿到顯微鏡下觀察。

I2-KI染色法是靠淀粉使花粉著色，染色效果除了受淀粉含量的影響外，還受支鏈淀粉和直鏈淀粉比例高低的影響[15]，直鏈淀粉與碘的結合物呈藍色, 支鏈淀粉與碘的結合物呈紫色[16]，多數(shù)情況下，I2-KI溶液將有活力的花粉染成藍色或藍黑色，例如，通關藤[6]、思茅松[7]、牡丹[17]和芍藥[18]，少數(shù)研究中I2-KI溶液可將有活力的花粉染成紅棕色，如滇重樓[19]，本研究中，有活力的花生花粉粒著紅棕色，說明花生花粉內(nèi)淀粉主要為支鏈淀粉，此外，I2-KI染色法對花生花粉染色效果明顯，有活力花粉和無活力花粉容易區(qū)分，是較好的花生花粉活力測定方法，但測定結果顯著高于離體萌發(fā)法(p<0.05)。

醋酸洋紅溶液和卡寶品紅染色法測定結果顯著高于其他測定方法。醋酸洋紅溶液幾乎使所有的花生花粉著色，少數(shù)畸形花粉未著色，這與醋酸洋紅溶液對柱花草的染色效果相似[20]；而卡寶品紅染色法使所有的花粉均著色，大部分花粉被染成紫紅色，個別花粉被染成淺紫色，而在岳玲等[21]的研究中，卡寶品紅染色法是適宜君子蘭花粉活力測定的方法，與本試驗結果差別較大，具體原因有待進一步研究。

TTC染色法是靠呼吸作用產(chǎn)生的NADH2或NADPH2使花粉著色,在花粉活力測定中具有廣泛的應用，例如，鈍裂銀蓮花[22]、毛葉鐵線蓮[23]、黃牡丹[24]都適合用TTC染色法，而在本試驗中，TTC染色法對花生花粉的染色效果不佳，未能觀測到被染成紅色的花粉粒，有研究表明，TTC染色法也不能使毛棉杜鵑花[25]、錦帶[26]、肉果秤錘樹[27]、君子蘭[21]的花粉著色，可能是因為花粉外壁太厚或者花粉呼吸產(chǎn)生的脫氫酶較少，具體原因還有待進一步研究。

綜上所述，離體萌發(fā)法是檢測花生花粉活力最準確有效的方法，TTC染色法、卡寶品紅染色法和醋酸洋紅染色法不適合花生花粉活力的測定；I2-KI染色法和紅墨水染色法操作簡單、染色效果明顯，是較好的花生花粉活力快速檢測方法,其中，紅墨水染色法的測定結果與離體萌發(fā)法的測定結果最接近，是最適合用于花生花粉活力快速檢測的方法。