吳漢鋒，趙 輝，黃家亮，甘桂春，李炎炎

廣西壯族自治區(qū)貴港市婦幼保健院遺傳實驗室，廣西貴港 537100

出生缺陷是人口出生素質(zhì)下降的主要因素，是導(dǎo)致早期流產(chǎn)、死胎、嬰幼兒死亡和先天殘疾的主要原因，其中染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)目變化所致的遺傳疾病約占出生缺陷的80%以上[1]。產(chǎn)前診斷即在胎兒出生前利用醫(yī)學(xué)檢驗、細胞遺傳學(xué)、分子及基因檢測、醫(yī)學(xué)影像學(xué)等檢測手段了解胎兒在宮內(nèi)的狀態(tài)，在胎兒出生前確診先天性疾病和遺傳性疾病，從而進一步進行宮內(nèi)治療或產(chǎn)前干預(yù)。產(chǎn)前診斷是預(yù)防遺傳疾病的重要環(huán)節(jié)，是避免遺傳病患兒出生的有效手段。雖然染色體核型分析技術(shù)多年來被視為產(chǎn)前診斷的“金標準”，但由于技術(shù)方法的局限性，只能辨別染色體5～10 Mb以上的片段異常，染色體微小結(jié)構(gòu)的變異和其他基因變異不能被檢出，所以染色體核型分析需和其他遺傳檢測技術(shù)相結(jié)合進行檢測，提高染色體小片段異常檢出率。LIANG等[2]介紹了基于二代測序技術(shù)的基因組拷貝數(shù)變異測序(CNV-Seq)方法，CNV-seq具有檢測范圍廣、操作簡便、報告周期短、兼容性好等優(yōu)點?！兜蜕疃热蚪M測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識》指出，孕婦可以選擇CNV-seq檢測作為一線的產(chǎn)前診斷方法，前提是孕婦充分知情了解[3]。本研究探討CNV-seq和染色體核型分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年2月至2021年12月在本院優(yōu)生遺傳科就診的1 155例孕中期孕婦為研究對象，1 155例孕婦均具有產(chǎn)前診斷指征。產(chǎn)前診斷指征包括高齡妊娠(n=256)、孕中期血清學(xué)唐氏篩查高風(fēng)險(n=97)、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(n=89)、不良孕產(chǎn)史(n=90)、B超影像學(xué)軟指標異常(n=485)等。孕婦年齡17～48歲，孕周20～28周，排除雙胎及多胎妊娠者。根據(jù)不同孕周選擇羊膜腔穿刺術(shù)或臍靜脈穿刺術(shù)，抽取羊水和臍帶血在2 h內(nèi)送至本院遺傳實驗室進行接種培養(yǎng)，報告1個月內(nèi)發(fā)出；CNV-seq檢測當天將標本按要求寄往深圳華大醫(yī)學(xué)檢驗實驗室檢測，報告15 d內(nèi)發(fā)出。所有孕婦及家屬在侵入性產(chǎn)前診斷前均接受臨床醫(yī)生詳細的遺傳咨詢，充分提示孕婦及家屬穿刺術(shù)所帶來的風(fēng)險及檢測方法的局限性，孕婦及家屬知情了解后簽署染色體核型分析和CNV-seq知情同意書。

1.2方法

1.2.1染色體核型分析 優(yōu)生遺傳科醫(yī)生在超聲監(jiān)測下穿刺抽取羊水20 mL，臍帶血穿刺抽取1.5 mL，所有操作均按無菌要求進行。羊水及臍帶血染色體核型分析實驗操作過程均為雙人雙線平行操作，按標準操作要求進行室內(nèi)質(zhì)控和參加全國室間質(zhì)評。蔡司全自動染色體掃描儀掃描染色體圖片，利用染色體分析軟件進行分析和計數(shù)，兩線分別計數(shù)至少10個分裂象，分析至少5個完整清晰染色體核型并保存歸檔，命名規(guī)則按照人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2016)標準進行，如有異常核型則加量計數(shù)和分析。

1.2.2CNV-seq檢測 孕婦簽署知情同意書后，在超聲下引導(dǎo)無菌穿刺抽取羊水10 mL，穿刺抽取臍帶血1.5 mL，抽取孕婦外周血5 mL，標本按要求寄送至深圳華大醫(yī)學(xué)檢驗實驗室檢測。所有標本常規(guī)進行聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)連鎖分析及母源污染鑒定。深圳華大醫(yī)學(xué)檢驗實驗室采用高通量測序技術(shù)，對受檢標本提取 DNA進行全基因組測序和生物信息學(xué)分析，結(jié)合STR和甲基化特異性PCR，測序所得的unique reads 與GRCh37/UCSC release hg19參考基因組進行比對，檢出100 kb以上的微重復(fù)微缺失變異。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)發(fā)布的指南進行染色體拷貝數(shù)變異(CNV)致病性解讀，對檢測到的CNV的致病性進行評估，將結(jié)果分為5類，分別是已知致病變異、疑似致病變異、臨床意義不明變異、良性變異及疑似良性變異，良性變異和疑似良性變異不在報告中體現(xiàn)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理。

2 結(jié) 果

1 155例羊水和臍帶血均培養(yǎng)成功，均出具染色體核型分析報告。檢出染色體異常97例，異常檢出率為8.39%，其中數(shù)目異常63例，包括21-三體37例、18-三體8例、13-三體1例、45，X 3例、47，XXY 10例、47，XXX 4例；結(jié)構(gòu)異常25例，染色體嵌合體9例。CNV-seq無檢測失敗現(xiàn)象，出具1 155份報告，檢出染色體非整倍體及100 kb以上的CNV 112例，異常檢出率為9.69%，其中非整倍體63例，包括21-三體37例、18-三體8例、13-三體1例、45，X 3例、47，XXY 10例、47，XXX 4例；已知致病性變異30例，疑似致病變異16例，嵌合體3例。1 155例孕婦標本染色體核型分析與CNV-seq共同檢出異常83例，其中染色體數(shù)目異常63例，CNV-seq檢測出非整倍體63例，非整倍體符合率為100%，其他異常20例，見表1；染色體核型異常而CNV-seq未檢出的共14例，包括染色體平衡易位、染色體倒位、染色體嵌合體，見表2。染色體核型未檢出而CNV-seq檢出異常的共29例，見表3。

表1 20例染色體核型分析與CNV-seq檢測均異常結(jié)果

續(xù)表1 20例染色體核型分析與CNV-seq檢測均異常結(jié)果

表2 14例染色體核型分析異常而CNV-seq結(jié)果正常

表3 29例染色體核型分析正常而CNV-seq結(jié)果異常

3 討 論

本研究中，CNV-seq異常檢出率為9.69%，染色體核型分析異常檢出率為8.39%，CNV-seq檢測的異常檢出率比染色體核型分析高1.30%，與其他研究異常檢出率報道結(jié)果相似[4]。CNV-seq與染色體核型分析共同檢出異常核型83例，其中非整倍體63例檢測結(jié)果一致，非整倍體檢測符合率100%。其余20例染色體核型為結(jié)構(gòu)缺失、重復(fù)、衍生等，由于染色體核型分析技術(shù)的局限性，只能分辨大于5 Mb的片段異常，且對異常片段的來源及定位受培養(yǎng)制片和顯帶技術(shù)的影響無法準確辨別。表1中的20號病例，染色體核型分析看到的是一個標記染色體，標記染色體片段較小，通常小于同一分裂象中的20號染色體，沒有可供識別的染色體帶紋以提示其來源，但CNV-seq檢測結(jié)果提示該標記染色體來源于15q11-13，即15q11-13重復(fù)綜合征。該綜合征臨床特征包括自閉癥、智力低下、共濟失調(diào)、癲癇發(fā)作、發(fā)育遲緩和行為問題[5]。胎兒父母進行了CNV-seq檢測，檢測結(jié)果顯示母親為15q11-13重復(fù)綜合征，母親的臨床癥狀為肌張力低、發(fā)育遲緩、抽搐、孤獨譜系障礙，特殊面容，最終該孕婦選擇了終止妊娠。表1中的3、5、8、10、14號病例染色體核型描述為衍生染色體，CNV-seq檢測均對其片段來源及染色體微缺失微重復(fù)片段大小進行了快速精準的辨別，為產(chǎn)前診斷臨床咨詢提供可靠的依據(jù)。

CNV-seq不適宜用于檢測染色體平衡易位、染色體倒位、染色體整倍體及雜合性缺失(UPD)等，有待于CNV-seq技術(shù)的深入研究。表2中的24、25、27、33、34號病例染色體核型描述為平衡易位或羅伯遜易位，21號病例為4號染色體倒位，CNV-seq檢測這些病例結(jié)果均為未見異常。由于染色體平衡易位和倒位不涉及染色體片段的丟失和重復(fù)，且染色體斷裂重接后沒有影響相關(guān)基因的功能，該類患者一般無染色體疾病的表型，只是在生育時會形成異常的配子，導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)及產(chǎn)生染色體異常后代[6]。本研究中表2的染色體倒位及平衡易位的孕婦均選擇繼續(xù)妊娠，隨訪至胎兒出生后表型均未見異常。表2中的29號病例，染色體核型描述為標記染色體，CNV-seq檢測未見異常，表明該標記物只是異染色質(zhì)，無染色體遺傳物質(zhì)，親本驗證為遺傳母親核型，母親表型無異常，該孕婦選擇繼續(xù)妊娠。由于染色體微小結(jié)構(gòu)變化所導(dǎo)致的遺傳性疾病稱為染色體微缺失/微重復(fù)綜合征，傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)不能夠分辨，缺失或者重復(fù)的片段小于5 Mb，是基因組CNV主要表現(xiàn)形式。至今為止，由致病性基因CNV所致的染色體微小結(jié)構(gòu)變化綜合征已達300多種[7-8]，10%～20%的智力障礙患者通過CNV-seq檢測可以找到病因[9-11]，可以確診5%～15%的孤獨癥譜系患兒[12]。本研究表3中的29例患者CNV-seq檢測結(jié)果均為小于5 Mb的缺失或重復(fù)，其中15例為已知致病變異，14例為疑似致病變異，而染色體核型分析結(jié)果均未見明顯異常。41、49、56、59、60、61、62號病例，CNV-seq檢出15q11.211.2區(qū)域缺失，該區(qū)域與15q11.2缺失綜合征有關(guān)，可能會增加神經(jīng)精神性疾病或神經(jīng)發(fā)育障礙的易感性，包括精神運動發(fā)育遲緩、語言發(fā)育遲緩、自閉癥、多動癥、強迫癥及癲癇[13]。46、47、50、53、57號病例，CNV-seq檢測結(jié)果為22q11.2q11.2區(qū)域大小不同片段缺失，該區(qū)域包含ClinGen判斷的劑量敏感區(qū)域，即22q11.2缺失綜合征。臨床表現(xiàn)為顱面部畸形、先天性心臟病、免疫缺陷和低鈣血癥三大癥狀，新生兒中該病的發(fā)病率為1/6 000[14]。CNV-seq檢測技術(shù)提高了染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的檢出率[2.50%(29/1 155)]，同時也給臨床醫(yī)生咨詢帶來了挑戰(zhàn)和困難，臨床醫(yī)生需要結(jié)合臨床及溯源胎兒父母的CNV-seq檢測結(jié)果綜合分析。

嵌合體是指兩種或兩種以上的細胞系存在于一個個體中，產(chǎn)前診斷嵌合體分為限制性胎盤嵌合體和真性胎盤嵌合體[15]。本研究表1中的17、19號病例染色體核型分析與CNV-seq均檢出嵌合體，但是嵌合比例不一致，因為異常染色體在體外培養(yǎng)和細胞分裂的過程穩(wěn)定性較差，造成嵌合比例存在差異，染色體結(jié)構(gòu)也容易發(fā)生變異或丟失，所以CNV-seq檢測盡量采用未經(jīng)培養(yǎng)的羊水和臍帶血[16]。表3中的39號病例，CNV-seq檢測結(jié)果為14號染色體存在三體嵌合，異常比例約為39%，而染色體核型未檢測出嵌合體，這種情況下需結(jié)合臨床和超聲，以及未培養(yǎng)羊水細胞間期Fish檢測，如果Fish檢測結(jié)果是陰性，則為假性嵌合體，后期繼續(xù)B超監(jiān)測妊娠情況。表2中的26、31、32號病例染色體核型出現(xiàn)平衡易位嵌合體，而CNV-seq檢測結(jié)果為未見異常，平衡易位嵌合體大多數(shù)認為是部分細胞畸變在體外培養(yǎng)時發(fā)生，一般無明顯的異常表型。表2中的病例30，染色體核型分析結(jié)果為47,XXX[6]/47,XX,+mar[8]/46,XX[99]，CNV-seq檢測未見異常，可能原因是CNV-seq對嵌合體檢測的靈敏度不高，嵌合比例不精準，對于47,XXX與45,X兩種細胞嵌合，若兩種細胞嵌合比例各占50%，CNV-seq檢測結(jié)果會顯示X染色體拷貝數(shù)未見異常[17]。CNV-seq檢測對于嵌合體的理想檢測比例為<5%，對低比例的嵌合體檢測結(jié)果更精準[18]。對于真性嵌合體的鑒別，無論是染色體核型分析還是CNV-seq檢測，建議至少兩種技術(shù)檢出嵌合體時才能確立真性嵌合體，只有一種技術(shù)檢出嵌合體時，臨床咨詢解釋需謹慎，需結(jié)合臨床及胎兒影像學(xué)綜合分析。

本研究中，產(chǎn)前診斷指征B超軟指標異常485例，所占比例最高[41.99%(485/1 155)]，其中CNV-seq異常例數(shù)43例，占CNV-seq檢測異常例數(shù)的38.39%(43/112)，CNV-seq檢測或CMA是產(chǎn)前B超軟指標異常首選的侵入性產(chǎn)前診斷方法[19]。

綜上所述，CNV-seq檢測與染色體核型分析技術(shù)各有優(yōu)缺點，在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域中CNV-seq檢測具有良好的應(yīng)用價值，對小片段的染色體結(jié)構(gòu)異常能夠精準定位及確定片段大小來源，可以作為進行產(chǎn)前診斷的一線方法，但是不能檢出平衡易位及倒位等結(jié)構(gòu)異常，對整倍體異常的檢出也有局限性。兩種方法聯(lián)合應(yīng)用于產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，可以提高遺傳病的檢出率，避免遺傳病患兒的出生，改善母嬰健康狀況，提高出生人口素質(zhì)。