丁明雅，張雅倩，楊玉喬，李晉，何俊，常艷旭

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實驗室，天津 301617）

中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片是按照一定的技術(shù)規(guī)范制成，能體現(xiàn)中藥整體性和專屬性的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)形式，是衡量中藥飲片質(zhì)量最合適的“標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”[1]。當(dāng)前可以被用作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的化學(xué)對照品、對照藥材及對照提取物仍無法反映中藥飲片的科學(xué)內(nèi)涵和特征屬性[2]。中國藥典中中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)多數(shù)參考藥材的標(biāo)準(zhǔn)，缺乏專屬性和客觀性。因此建立中藥飲片專屬標(biāo)準(zhǔn)，健全中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)體系是及其必要的。通常來說標(biāo)準(zhǔn)飲片質(zhì)量均勻是其質(zhì)量穩(wěn)定的重要表現(xiàn)[3-4]。標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化研究可確保中藥臨床用藥的安全性和有效性，為建立健全中藥標(biāo)準(zhǔn)體系提供基礎(chǔ)性研究方案。

南葶藶子為十字花科植物播娘蒿Descurainia sophia（L．）Webb ex Prantl．的干燥成熟種子，其最早記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中。南葶藶子有下氣行水、清熱活血、利尿消腫[5-6]的功效。主治痰液積聚，咳嗽痰多，呼吸困難，胸腹水腫等癥。南葶藶子中化學(xué)成分主要有強(qiáng)心苷類、黃酮類、脂肪油類及有機(jī)酸類等[7-9]，其對呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)疾病的治療都具有積極作用[10-11]。但有關(guān)南葶藶子及炒南葶藶子制備標(biāo)準(zhǔn)飲片的相關(guān)報道較少。開展南葶藶子及炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片制備研究有利于其市場質(zhì)量監(jiān)管，其標(biāo)準(zhǔn)飲片的均勻化方法研究同時有利于保障飲片安全性、有效性和質(zhì)量可控性[1，12-14]。本文以出粉率、3種黃酮類化合物的總含量及指紋圖譜峰總面積為指標(biāo)，考察了粉碎時間、粉碎次數(shù)、投料量對于標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化方法的影響[12-14]，優(yōu)化南葶藶子及炒南葶藶子粉碎工藝，為南葶藶子和炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化技術(shù)規(guī)范的制定提供了參考依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AX205型十萬分之一電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；小型粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；SB-1000YDTD型超聲清洗槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Mill-Q II型超純水器（Millipore公司）；3K15型離心機(jī)（半徑11 cm，德國Sigma公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 試劑 乙腈來自Merk公司、甲醇來自Fisher公司、甲酸來自Tedia公司，所有有機(jī)試劑均為色譜純；實驗用水均由Millipore超純水系統(tǒng)制得。

2 藥品與方法

2.1 藥材與標(biāo)準(zhǔn)品 南葶藶子和炒南葶藶子藥材于2016年購買于安國藥材市場，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為十字花科植物播娘嵩Descurainia sophia（L．）Webb．ex Prantl．的干燥成熟種子，并按照2015版藥典進(jìn)行凈制和炮制，獲得南亭藶子飲片和炒葶藶子飲片。所有樣品干燥24 h后，在規(guī)定目數(shù)篩子下篩分備用（干燥溫度：60℃；篩子：65目）。黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷（批號：PCS0375）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（批號：CHB160912）、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖（批號：PS14012301）均來自德思特生物科技有限公司（成都），高效液相分析純度均≥98%。

2.2 正交實驗采用設(shè)計L9（34）正交實驗表（表1），考察粉碎時間（A）、粉碎次數(shù)（B）和投料量（C）均對飲片出粉率有影響。

表1 正交試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

2.3 3種黃酮成分含量測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 3種黃酮類成分分別加甲醇制成質(zhì)量濃度均為1．00 mg/mL的對照品母液。分別精密量取各母液適量配制成濃度分別為500 μg/mL（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖）、50 μg/mL（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）、50 μg/mL（異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照一定比例向下逐級稀釋成所需濃度，備用。

2.3.2 樣品的制備 精密稱取0．750 g樣品粉末于錐形瓶中，超聲30 min進(jìn)行樣品提?。ㄌ崛∪軇?0%的甲醇，10 mL），超聲前后對具塞錐形瓶總質(zhì)量進(jìn)行稱質(zhì)量，用提取溶液補(bǔ)足質(zhì)量差，混勻后14 000 rpm離心10 min，離心半徑為8 cm，取上清，經(jīng)0．22 μm針式過濾器過濾后進(jìn)樣分析[15]。

2.3.3 色譜條件色譜柱：ACQUITYBEHC18（1．7μm，2．1×100mm）；保護(hù)柱：Waters C18柱（2．1 mm×12．5 mm，5 μm）；流速：0．3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：30 ℃；波長掃描：265 nm；檢測時間：16 min；流動相：含0．1%甲酸的水溶液（A）- 乙腈（B）；采用梯度洗脫。見表2。

表2 梯度洗脫程序表Tab.2 Gradient elution procedure

2.3.4 出粉率的測定 對已稱質(zhì)量樣品粉末進(jìn)行粉末化處理，粉碎盡可能完全，過4號篩（65目），分離粉末和藥渣，計算出粉率。

3 結(jié)果

3.1 單因素考察 以出粉率為指標(biāo)，考察了飲片投料量、打粉時間、打粉次數(shù)對飲片粉碎工藝的影響。研究結(jié)果表明，當(dāng)南葶藶子投料量為100 g和150 g時，飲片出粉率沒有明顯差異，綜合考慮以150 g投料量為最佳，出粉率為74．0%?？疾觳煌蚍蹠r間（10 s、20 s、30 s）對粉碎工藝的影響，結(jié)果顯示單次打粉20 s出粉率最高，為72．8%?？疾齑蚍鄞螖?shù)（2次、3次、4次）對粉碎工藝的影響，發(fā)現(xiàn)打粉4次時飲片出粉率較其他組高，為83%。因此，通過單因素實驗確定了南葶藶子最佳粉碎工藝為：投料量150 g，打粉4次，單次打粉時間20 s。按照相同的方法，確定了炒南葶藶子最佳粉碎工藝為：投料量100 g，打粉4次，單次打粉時間20 s。

3.2 3個黃酮類化合物的含量測定

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 將配置好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇逐級稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣分析，按橫、縱坐標(biāo)分別為濃度（μg/mL）和峰面積進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見表3。

表3 3種黃酮類成分的線性回歸方程Tab.3 Linearity and regression equations of three flavonoids

3.2.2 精密度實驗 精密吸取同一批供試品溶液于1日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示3種黃酮類化合物6次進(jìn)樣峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）分別為1．38%、0．40%、0．84%，表明儀器精密度良好。

3.2.3 穩(wěn)定性實驗 準(zhǔn)確吸取適量供試品溶液，分別于1日內(nèi)不同時間點(diǎn)進(jìn)樣分析，加樣第1個點(diǎn)設(shè)置為0 h，依次按照選取的時間間隔進(jìn)樣分析供試樣品，共記錄24 h，實驗結(jié)束后依次計算供試品溶液中3個黃酮類化合物在不同時間點(diǎn)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示3個化合物連續(xù)24 h內(nèi)不同時間點(diǎn)進(jìn)樣峰面積 RSD 分別為：1．43%、1．87%、2．06%，表明樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.4 重復(fù)性實驗 精密稱取同一批次南葶藶子樣品粉末，平行制備6份樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣分析。計算所得峰面積換算成化合物濃度，分別計算6份樣品中3種黃酮類化合物的含量，結(jié)果顯示3種黃酮類化合物含量的RSD值分別為 3．72%、4．92%、3．82%，說明供試品樣品處理方法重復(fù)性良好。

3.2.5 指紋圖譜測定 取正交實驗9份樣品粉末，分別檢測指紋圖譜，計算UPLC指紋圖譜峰面積大于3 000的指紋峰總面積結(jié)果見表4[18]。南葶藶子生品與炮制品指紋圖譜結(jié)果分別見圖1和圖2。并通過標(biāo)準(zhǔn)品對其共有指紋峰進(jìn)行比對，指認(rèn)了其中5個色譜峰分別為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖、芥子酸和異鼠李素（圖3B）。

表4 南葶藶子和炒南葶藶子樣品L9（34）正交實驗設(shè)計結(jié)果Tab.4Results for orthogonal test L9（34）of raw and stir-fried Descurainiae Semen

圖1 南葶藶子樣品超高效液相色譜指紋圖譜Fig.1 Ultra high-performance liquid chromatography fingerprint of Descurainiae Semen

圖2 炒南葶藶子樣品UPLC指紋圖譜Fig.2 Ultra high-performance liquid chromatography fingerprint of stir-fried Descurainiae Semen

圖3 典型色譜圖譜Fig.3 Typical chromatography

3.3 3個黃酮類化合物的總含量測定 按照正交實驗計算出的9組制備工藝分別制備南葶藶子及炒南葶藶子樣品粉末，采用UPLC法測各組樣品粉末中所含3種黃酮類化合物的總含量。按照上述色譜條件進(jìn)樣分析南葶藶子及混合對照品典型色譜圖見圖3。

3.4 正交實驗結(jié)果

3.4.1 綜合評分法分析正交實驗結(jié)果 本實驗采用加權(quán)法對正交實驗結(jié)果進(jìn)行綜合評分，選用出粉率（D）、3個黃酮類化合物的總含量（E）、指紋圖譜總峰面積（F）作為均勻化方法考察的指標(biāo)，根據(jù)所測指標(biāo)在南葶藶子飲片均勻化工藝中的主次順序確定各指標(biāo)權(quán)重[17]，系數(shù)分別為：0．3、0．4、0．3。

3.4.2 數(shù)據(jù)處理與分析 南葶藶子及炒南葶藶子綜合評分結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。南葶藶子和炒南葶藶子方差分析結(jié)果顯示粉碎時間對實驗結(jié)果影響較小。在α=0．05條件下，粉碎時間、粉碎次數(shù)和投料量對粉碎工藝沒有顯著性的影響可能是因素間交互作用或誤差自由度小的原因。因此，根據(jù)直觀分析結(jié)果，影響南葶藶子飲片均勻化因素的主次順序為：C（投料量）＞B（粉碎次數(shù)）＞A（粉碎時間），A2＞A3＞A1，B3＞B1＞B2，C2＞C1＞C3。為節(jié)省生產(chǎn)成本，最佳均勻化方法選擇A1B3C2，即用150 g南葶藶子飲片，粉碎4次，每次10 s。同理直觀分析結(jié)果顯示，影響炒南葶藶子綜合評分因素的主次順序為：B（粉碎次數(shù)）＞C（投料量）＞A（粉碎時間），A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C1＞C3＞C2。綜合考慮，最佳均勻化方法為A1B2C1，即用100 g炒南葶藶子飲片，粉碎3次，每次10 s。

表5 南葶藶子和炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化粉碎工藝方差分析結(jié)果Tab.5 Analysis of variance of homogenization crushing process of standard decoction pieces of raw and stir-fried Descurainiae Semen

3.4.3 南葶藶子和炒南葶藶子最佳均勻化工藝驗證實驗 根據(jù)正交實驗所得的最優(yōu)均勻化工藝對南葶藶子及炒南葶藶子樣品進(jìn)行粉碎，實驗平行3次，計算每份粉末的出粉率，并測定指紋圖譜總峰面積和3個黃酮類化合物的總含量。最佳粉碎工藝驗證結(jié)果見表6。

表6 南葶藶子和炒南葶藶子最佳均勻化工藝驗證實驗Tab.6 Verification test of optimal homogenization process of raw and stir-fried Descurainiae Semen

4 討論

中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片處理是否均勻?qū)τ谒幬镄再|(zhì)、屬性的表達(dá)具有關(guān)鍵的作用，而粉碎工藝在標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化工藝中占絕對的比重，對粉碎工藝進(jìn)行研究是中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)制定的基礎(chǔ)也是必不可少的步驟。本文通過正交實驗對中藥南葶藶子及其炮制品進(jìn)行粉碎均勻化研究，經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)最佳均勻化方法制備的樣品其不同測定指標(biāo)值均可以穩(wěn)定實現(xiàn)，研究結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)性研究材料。

單一指標(biāo)通常會導(dǎo)致優(yōu)化結(jié)果的不準(zhǔn)確，多指標(biāo)優(yōu)化不僅避免單指標(biāo)優(yōu)化的缺陷，還可以較為合理地優(yōu)選南葶藶子及炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化方法，使研究更具有專屬性，說服性[18-19]。本研究選擇3個關(guān)鍵考察指標(biāo)對標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化工藝進(jìn)行優(yōu)選，其中飲片出粉率反映了飲片的粉碎效率，通過調(diào)節(jié)粉碎過程的關(guān)鍵因素來實現(xiàn)出粉率最大化；本研究所選的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷3個含量測定的化合物是南葶藶子樣品中含量相對較高且又具有代表性的黃酮類成分，將其作為南葶藶子藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[20]；指紋圖譜可以較好地反映藥材中化合物信息，為飲片中化學(xué)成分系統(tǒng)的研究提供了研究方法，同時在265 nm波長下測定的色譜峰響應(yīng)值高，出峰較多，各色譜峰之間分離度較好，保留時間適中，故選擇265 nm下總峰面積，更能相對全面地評價南葶藶子的飲片質(zhì)量[21]。研究選用多指標(biāo)優(yōu)化均勻化工藝不僅填補(bǔ)了研究空白，也為后期標(biāo)準(zhǔn)飲片相關(guān)質(zhì)量控制提供可資借鑒的案例。南葶藶子及炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片粉碎工藝研究，為中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化技術(shù)研究提供支撐材料[22]。

5 結(jié)論

以出粉率、3個黃酮類化合物的總含量、指紋圖譜總峰面積作為指標(biāo)，對投料量、單次粉碎時間、粉碎次數(shù)3個因素進(jìn)行考察，優(yōu)化南葶藶子和炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片的均勻化方法，確定南葶藶子最佳均勻化工藝：投料量150 g，單次粉碎時間10 s，粉碎4次；炒南葶藶子飲片最佳均勻化工藝：投料量100 g，單次粉碎時間10 s，粉碎3次。標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化研究確保了中藥臨床用藥的安全性和有效性，為建立健全中藥標(biāo)準(zhǔn)體系提供基礎(chǔ)性研究方案。