胡庭剛，晏子俊，伍曉萍，吳賢麗，夏靚婧，陳 彤*

(1.攀枝花市第三人民醫(yī)院，四川 攀枝花 617002；2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；3.攀枝花市中心醫(yī)院，四川 攀枝花 617067；4.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 藥物研究所，山東 濟南 271016)

細(xì)菌耐藥性已成為全球面臨的問題，現(xiàn)有抗生素已無法滿足臨床治療需求[1]。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是醫(yī)院內(nèi)重要的條件致病菌，可產(chǎn)生毒力因子及生物被膜而引起各種感染，現(xiàn)已被認(rèn)作是醫(yī)院的主要病原菌。2021年上半年中國CHINET耐藥菌種分布結(jié)果顯示，PA占臨床總分離率7.47%，排在第5位。PA具有超強耐藥性[2-3]，其耐藥機制包括群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)、產(chǎn)生修飾酶或滅活酶、主動外排、外膜孔蛋白缺失或通透性降低等[5-7]，多重耐藥PA的出現(xiàn)，使得臨床治療變得越來越棘手，嚴(yán)重威脅人類健康[4]。因此，探究抗菌新策略對治療PA感染刻不容緩。QS是細(xì)菌細(xì)胞密度依賴的一種基因表達(dá)現(xiàn)象[8]，有受體蛋白、合成酶蛋白參與，合成酶蛋白產(chǎn)生N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)作為自體誘導(dǎo)物(AIs)，當(dāng)AIs密度達(dá)閾值時可與受體蛋白結(jié)合，啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[9]，激活特定信號分子調(diào)控特定基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境，協(xié)調(diào)細(xì)菌群體產(chǎn)生耐藥性、免疫逃逸、生物被膜、毒力因子等，發(fā)揮致病作用[10]。Reuter等[11]研究證實PA的QS與其致病力密切相關(guān)。王帥濤等[12]研究表明PA生物被膜受QS調(diào)控。Soukarieh等[13]研究表明PA的QS與耐藥性相關(guān)。因此，細(xì)菌QS可作為藥物作用靶點，研發(fā)QS抑制劑從而發(fā)揮抗菌增效作用[14-16]。諸多學(xué)者一直致力于QS抑制劑的研發(fā)。現(xiàn)有QS抑制劑根據(jù)來源分為天然、合成化合物及臨床已有藥物，其中天然化合物有人參[17]、丁香油[18]等植物來源的提取化合物，合成化合物有呋喃酮類[19]、低分子量海藻酸鹽低聚物[20]等，臨床已有藥物有多尼培南[21]、氯硝柳胺[22]等。研究發(fā)現(xiàn)，QS抑制劑與傳統(tǒng)抗菌藥物不同，作用機制特殊，較少出現(xiàn)耐藥，具有增效作用，有效緩解PA耐藥[23-24]。維拉帕米作為一種鈣離子拮抗藥物，臨床應(yīng)用廣泛，嘗試將其開發(fā)作為QS抑制劑的潛在藥物，可充分發(fā)揮老藥新用的優(yōu)勢，減少未知風(fēng)險的發(fā)生，對發(fā)現(xiàn)新的QS抑制劑有重要意義。因此，本研究首次以鈣離子拮抗藥中的維拉帕米作為QS抑制劑，對維拉帕米抑制PA的QS進(jìn)行體外研究，以明確維拉帕米是否具有抗菌增效作用及其可能機制，為研發(fā)抗菌增效藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 銅綠假單胞菌(Pseudomonaaeruginosa，PA)標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC27853)購自四川省臨床檢驗中心，由攀枝花市中心醫(yī)院中心實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB肉湯培養(yǎng)基(生工生物工程)；②M-H肉湯培養(yǎng)基(鄭州安圖生物)。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 維拉帕米(中國藥品檢驗總所)，純度>99.9%；脫脂奶粉(英國oxoid)；彈性酶-剛果紅(ECR)(美國Sigma-Aldrich)；瓊脂粉(英國oxoid)；DMSO(科隆化學(xué)品)；其他試劑均為西亞試劑。細(xì)菌多點接種儀(MIT-P，日本SAKUMA)；比濁儀(DensiCHEK，法國生物梅里埃)；酶標(biāo)儀(SUNRISE，九州通醫(yī)藥集團(tuán))；生化培養(yǎng)箱(HPS-400B，北京東聯(lián)哈爾)；萬分之一分析天平(ESJ200-4，沈陽龍騰電子)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-4AS，北京市永光明醫(yī)療)；超聲波清洗機(SB25-12DT，寧波新芝生物科技)。

1.2 方法

1.2.1 體外藥敏試驗 參考譚麗等[25]方法測定最小抑制濃度(Minimal inhibit concentration，MIC)。按照CLSI M100-S21[26]的要求，將PA轉(zhuǎn)種平板，分離純化，挑取過夜菌落接種，調(diào)整濁度至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?1×108cfu/mL)，采用M-H肉湯將其稀釋為1×106cfu/mL菌液。選用倍比稀釋法制備維拉帕米溶液，用M-H肉湯將其稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL。將稀釋的維拉帕米藥液與1×106cfu/mL的PA菌液按同等體積混勻，于96孔板中各加入100 μL上述混合液，作為實驗孔。取M-H肉湯每孔100 μL，各濃度組分別設(shè)置3個平行孔做為對照。將加樣后的微孔板于振蕩器混勻，生化培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)48 h。600 nm處酶標(biāo)儀測各孔吸光度值A(chǔ)600。PA未生長的孔含有的藥物濃度即為MIC。

1.2.2 生長曲線的繪制 調(diào)整菌液濁度至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬儆肕-H肉湯稀釋得5×104cfu/mL菌液。倍比稀釋法制備維拉帕米溶液，用M-H肉湯稀釋質(zhì)量濃度至4、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL。參照1.2.1中實驗組設(shè)置方法，于加樣后0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h測定A600。以時間(h)為橫坐標(biāo)，A600為縱坐標(biāo)，繪制維拉帕米作用PA的24 h生長曲線。

1.2.3 維拉帕米對PA毒力因子表達(dá)的影響實驗①維拉帕米菌液的制備：調(diào)整菌液濁度至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，再用M-H肉湯稀釋得到5×104cfu/mL的菌液。倍比稀釋法制備維拉帕米溶液，用M-H肉湯稀釋質(zhì)量濃度至8、16、32、64、128、256、512 μg/mL。參照1.2.1中實驗組設(shè)置方法，制得含維拉帕米質(zhì)量濃度分別為4、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL的菌液，有氧條件下培養(yǎng)24 h，測A600。②維拉帕米對PA彈性蛋白酶表達(dá)的影響：取適量①中的含藥菌液，12 000 r/min、4 ℃離心8 min。移液槍取上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，將濾液與ECR緩沖液按同體積比例混勻，于垂直混合儀15 r/min、37 ℃反應(yīng)16 h，加入適量EDTA (120 mmol/L) 溶液，置于冰上10 min，終止反應(yīng)。再于2 000 r/min、4 ℃離心8 min，取150 μL上清液加入96孔板，酶標(biāo)儀測定A495。設(shè)置菌液對照組和0.5% DMSO對照組，各濃度組設(shè)置3個平行孔。A495/A600比值表示彈性蛋白酶活性。③維拉帕米對PA蛋白水解酶表達(dá)的影響：取適量①中的含藥菌液，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，取濾液150 μL置于含小孔的脫脂牛奶瓊脂平板，37 ℃反應(yīng)24 h。設(shè)置菌液對照組和0.5% DMSO對照組，各濃度組設(shè)置3個平行孔。反應(yīng)24 h后，小孔出現(xiàn)透明圈，測定其直徑L，L/A600比值即為蛋白水解酶活性。④維拉帕米對PA綠膿毒素表達(dá)的影響：取適量①中的含藥菌液，8 000 r/min、25 ℃離心10 min后，移液槍取4 mL上清液，加入3 mL CHCl3，混勻，放置5 min，于8 000 r/min、25 ℃離心5 min，取2.5 mL的CHCl3層，加入一定量HCl，混勻，放置5 min，再于8 000 r/min、25 ℃離心5 min后，取HCl層測A520。設(shè)置菌液對照組和0.5% DMSO對照組，各濃度組設(shè)置3個平行孔。A520/A600比值表示菌液中綠膿毒素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 維拉帕米體外抗PA的最低抑菌濃度

對照組(0.5% DMSO、M-H肉湯)中PA生長良好，表明無抗菌作用。維拉帕米抗PA的MIC90為512 μg/mL，見表1。

表1 維拉帕米體外抗PA的最低抑菌濃度(n=3)Table 1 The results of verapamil against PA activity(n=3)

2.2 維拉帕米體外影響PA的生長曲線

由圖1可知，對照組(0.5% DMSO)對PA的生長無影響。加樣3 h后，當(dāng)維拉帕米質(zhì)量濃度為512 μg/mL時，明顯抑制PA生長(P<0.01)；加樣4 h后，當(dāng)維拉帕米質(zhì)量濃度為256、128、64 μg/mL時，對PA生長的抑制作用明顯(P<0.01)；加樣8 h后，當(dāng)維拉帕米質(zhì)量濃度為32、16 μg/mL時，對PA生長中期具有一定的抑制作用(P<0.05)。當(dāng)維拉帕米質(zhì)量濃度為8、4 μg/mL時，對PA的生長無明顯抑制作用。

圖1 維拉帕米體外影響PA 的生長曲線Fig.1 The growth curve of verapamil on PA n=3)與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01,下圖同VS.control group,*P<0.05；**P<0.01,the same below

2.3 維拉帕米對PA毒力因子表達(dá)的影響

2.3.1 維拉帕米對PA彈性蛋白酶表達(dá)的影響 由圖2可知，兩組對照組對PA的彈性蛋白酶均無影響。與菌液對照組相比，維拉帕米質(zhì)量濃度為256、128、64、32、16 μg/mL時，可明顯抑制彈性蛋白酶的表達(dá)(P<0.01)，8 μg/mL時也可抑制彈性蛋白酶的表達(dá)(P<0.05)，且表現(xiàn)出濃度依賴性。維拉帕米質(zhì)量濃度為4 μg/mL時對彈性蛋白酶無抑制作用。

圖2 維拉帕米對PA彈性蛋白酶的影響Fig.2 Effect of verapamil on expression

2.3.2 維拉帕米對PA蛋白水解酶表達(dá)的影響 由圖3可知，兩組對照組對PA的蛋白水解酶均無影響。與菌液對照組相比，維拉帕米質(zhì)量濃度為512、256、128、64、32 μg/mL時，明顯抑制蛋白水解酶的活性(P<0.01)，質(zhì)量濃度為16 μg/mL時，對蛋白水解酶也有抑制作用(P<0.05)，抑制作用有濃度依賴。維拉帕米質(zhì)量濃度為8、4 μg/mL時對蛋白水解酶活性無抑制作用。

圖3 維拉帕米對PA蛋白水解酶表達(dá)的影響Fig.3 Effect of verapamil on the expression of PA proteolytic enzymes n=3)

2.3.3 維拉帕米對PA綠膿毒素表達(dá)的影響 由圖4可知，兩組對照組對PA綠膿毒素的表達(dá)無明顯影響。與菌液對照組相比，維拉帕米質(zhì)量濃度為512、256、128、64、32 μg/mL時，對綠膿毒素有明顯抑制(P<0.01)，濃度為16 μg/mL時，也有一定的抑制作用(P<0.05)，抑制作用有濃度依賴。維拉帕米質(zhì)量濃度為8、4 μg/mL時對綠膿毒素?zé)o抑制作用。

圖4 維拉帕米對PA綠膿毒素表達(dá)的影響Fig.4 Effect of verapamil on expression of PA green pyotoxin n=3)

3 討 論

研究細(xì)菌毒力因子表達(dá)解決藥物耐藥性，已逐漸成為當(dāng)前抗感染治療研究領(lǐng)域的熱點[1,27-28]。PA耐藥機制復(fù)雜，具有多系統(tǒng)參與、耐藥率高的特點，臨床培養(yǎng)常為多重耐藥菌，難治愈[29-31]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)表明抗PA感染包括干擾或影響毒力因子表達(dá)、破壞細(xì)菌黏附、抑制鐵代謝過程、干擾藥物外排泵、調(diào)節(jié)宿主免疫、影響生物被膜形成及抑制細(xì)菌QS系統(tǒng)等方法[32-33]，而抑制PA的QS可有效抑制其毒力因子表達(dá)[34-35]。

維拉帕米是罌粟堿衍生物，為苯烷胺類鈣離子拮抗藥，常用于心絞痛、心律失常及原發(fā)性高血壓等治療，本身無抗菌活性，但其對PA可能具備抑制細(xì)菌QS的作用。在本研究測定維拉帕米MIC實驗中，當(dāng)維拉帕米質(zhì)量濃度為128 μg/mL時可抑制50%菌株生長，MIC90為512 μg/mL，最低抑菌濃度范圍為128～512 μg/mL。與地爾硫卓(MIC90>512 μg/mL[10])相比，維拉帕米抗菌活性稍好；與硝苯地平(MIC90為256 μg/mL[4])相比，維拉帕米抗菌活性稍差。維拉帕米體外對PA生長曲線的影響表明，維拉帕米質(zhì)量濃度為16 μg/mL時，開始表現(xiàn)出對PA生長的抑制，隨著濃度增加，抑制作用逐漸增大。上述結(jié)果表明維拉帕米對PA有抑制作用，初步明確維拉帕米可能具有抑制QS的作用。

研究證實PA毒力因子的表達(dá)與QS密切相關(guān)[10,36]。QS參與PA特定基因的調(diào)控，可影響PA的彈性蛋白酶、蛋白水解酶、綠膿毒素表達(dá)[37]。本研究中，當(dāng)維拉帕米質(zhì)量濃度為8 μg/mL時，開始表現(xiàn)出抑制彈性蛋白酶的活性，而16 μg/mL時明顯抑制。當(dāng)維拉帕米質(zhì)量濃度為16 μg/mL時，開始表現(xiàn)出抑制蛋白水解酶的活性和綠膿毒素的表達(dá)，而32 μg/mL時，明顯抑制?？赡茉驗镼S由特異性受體和AIs組成，而PA的膜蛋白具備類似真核生物ESCRT-III蛋白的鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可根據(jù)外界環(huán)境刺激調(diào)節(jié)胞內(nèi)外鈣離子濃度，胞內(nèi)鈣離子可與AIs的特異受體結(jié)合，特異受體與AIs結(jié)合位點暴露，從而增加毒力因子表達(dá)[38-39]。研究還表明鈣離子參與細(xì)菌自身生理活性調(diào)控，一定程度上可增強細(xì)菌運動遷移能力，改變細(xì)菌鞭毛運動方向，影響生物被膜形成[40-41]。因此，雖未發(fā)現(xiàn)低濃度維拉帕米具有抑制PA生長的作用，但其可能影響鈣離子分布，從而一定程度上抑制QS，影響毒力因子表達(dá)和生物被膜形成。上述研究表明，維拉帕米可影響彈性蛋白酶、蛋白水解酶、綠膿毒素的表達(dá)，進(jìn)一步明確維拉帕米具有抑制QS的作用。

本研究通過體外研究明確了維拉帕米具有抑制QS的作用，而維拉帕米與抗菌藥物聯(lián)用是否能發(fā)揮協(xié)同抗菌作用，是否增加細(xì)菌對抗菌藥物敏感性等問題有待進(jìn)一步研究，并為研發(fā)新型抗菌制劑提供參考。