基于分子對接技術研究魚源抗凍多肽與魚肌球蛋白的相互作用

江文婷，陳 旭，蔡茜茜，楊傅佳，黃 丹，黃建聯(lián), ，汪少蕓,

（1.福州大學生物科學與工程學院，福建福州 350108；2.福建省冷凍調理水產品加工重點實驗室，福建廈門 361022；3.福建安井食品集團股份有限公司，福建廈門 361022）

我國水域遼闊，生物資源豐富，是世界上漁業(yè)資源最豐富的國家。海鱸魚營養(yǎng)豐富，養(yǎng)殖產量高，常用于加工生產魚糜制品，深受消費者的喜愛，產量和市場需求逐年增加。魚糜及魚糜制品在加工、儲存、運輸等過程中產生的冰晶生長和重結晶問題會導致魚糜蛋白質的冷凍變性，使其分子內部原有的高度規(guī)律性的空間結構發(fā)生變化，導致蛋白質的理化性質和生物學性質都有所改變，是影響凍藏品質的關鍵。其中，魚糜蛋白中的肌球蛋白是凝膠形成最主要的功能成分，影響著肉制品的品質。肌球蛋白重鏈（Myosin Heavy Chain，MHC）具有與完整肌球蛋白形成凝膠的相同能力。而肌球蛋白輕鏈不能單獨形成凝膠，只在肌球蛋白重鏈堿基凝膠形成中起輔助作用。因此，肌球蛋白重鏈在肌球蛋白形成凝膠三維網狀結構的過程中起著非常重要的作用。

抗凍多肽是一類小分子蛋白或蛋白質水解物，它是抗凍蛋白中局部具有抗凍活性的特異多肽鏈結構域?？箖龆嚯脑诮Y冰或亞結冰狀態(tài)下能保護生物體免受傷害，它能非依數性降低溶液冰點、有效降低冰晶生長率、抑制冰晶重結晶的發(fā)生，抑制凍結所造成的低溫損傷。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽，在低溫凍融循環(huán)中對魚糜表現(xiàn)出保護作用。為研究魚源膠原蛋白抗凍多肽對魚糜的保護機制，本文使用不同蛋白酶酶解魚源膠原蛋白，以嗜熱鏈球菌的低溫保護活性為指標篩選出能酶解產生高活性抗凍多肽的蛋白酶。為簡化分離純化及質譜等繁鎖步驟，通過計算機模擬酶解魚源膠原蛋白并預測活性肽性質，得到能與肌球蛋白直接作用的抗凍多肽序列，利用同源建模構建海鱸魚肌球蛋白重鏈的空間結構。通過分子模擬技術探究抗凍多肽與海鱸魚肌球蛋白的相互作用，以期為今后冷凍魚糜產品開發(fā)應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚鱗膠原蛋白（） 安井食品集團股份有限公司；嗜熱鏈球菌（） 上海交通大學農業(yè)與生物學院；風味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑 均為分析純；海鱸魚肌球蛋白重鏈（GenBank Accession No:AGT60847.1） 美國國立生物技術信息中心NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）；魚源膠原蛋白O93484 蛋白質數據庫UniProt（https://www.uniprot.org/）。

SW-CJ-1F 超凈工作臺 上海博迅公司；Genesys 10S 紫外可見分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific 公司；214 差示掃描量熱儀 德國Netzsch 公司；SMZ-745T 體視顯微鏡、D-7500CCD 高清相機日本Nikon 公司；RT4加熱制冷循環(huán)器 德國VIVO 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚源膠原蛋白的酶解 犁齒鯛魚鱗清洗、烘干后粉碎成絮狀。底物濃度3%（w/v），超聲90 min（50 ℃，200 W），高溫處理1 h（121 ℃，0.1 MPa），冷卻后調節(jié)至酶最佳pH，分別加入5%（w/w）酶底比的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶，在酶最適溫度下酶解6 h，沸水浴滅酶后離心取上清液凍干。

1.2.2 抗凍多肽的低溫保護活性測定 取50 μL 二次活化的嗜熱鏈球菌接種到4 mL M17 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 h（37 ℃，180 r/min），5000 r/min 離心10 min，收集菌泥，用等體積的無菌水洗滌兩次后重懸于兩倍的無菌水中，獲得嗜熱鏈球菌菌液。分別從不同酶解液中取540 μL 加60 μL 菌液混勻，540 μL 生理鹽水加60 μL 菌液做空白組。吸取50 μL 到4 mL M17培養(yǎng)液中，培養(yǎng)7 h，檢測600 nm 處的吸光值A，剩余的菌液于-20 ℃冷凍24 h 且在起始時間內間隔2 h 進行兩次凍融循環(huán)。之后將菌液37 ℃水浴解凍10 min，再次取50 μL 接種培養(yǎng)7 h 后測吸光值A。根據公式（1）計算存活率。

式中：A表示冷凍前菌液OD；A表示冷凍后菌液OD。

1.2.3 熱滯活性測定 熱滯活性測定參照Wu 等方法稍作變化。取5 μL 15 mg/mL 樣品或牛血清蛋白到鋁樣品盤，參比組為空白鋁樣品盤，將二者同時置入差示掃描量熱儀中，以-2 ℃/min 速率降溫至-30 ℃，平衡5 min，再以2 ℃/min 速率升溫至保留溫度（-0.5、-0.3、0 ℃），使樣品處于部分熔融狀態(tài)，平衡5 min。根據DSC 熱流曲線分析樣品的抗凍活性。冰晶含量（Φ ）和THA 分別按照公式（2）和（3）計算。

式中：Φ 為樣品中的冰晶含量（%）；△H為保留溫度停留后繼續(xù)降溫過程中體系的放熱焓（J/g）；△H為樣品結晶的總放熱焓（J/g）；T為保留溫度（℃），即樣品熔融峰所涵蓋溫度區(qū)間的某一溫度；T體系融化部分再次凍結時的起始溫度（℃）。

1.2.4 重結晶抑制活性測定 取3 μL AFPs（1.0 mg/mL，20%蔗糖溶液配制）于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于冷臺上。以-20 ℃/min 速率快速冷卻至-20 ℃并維持5 min，使其完全凍結；再以5C/min 速率逐漸升溫至-6 ℃，保持1 min；再以1 ℃/min 讓樣品在-8～-6 ℃之間循環(huán)，模擬溫度波動環(huán)境下的重結晶情況。并在-6 ℃分別保持0、10、30 min，通過CCD 相機采集循環(huán)前后冰晶形態(tài)圖像，通過OPLENIC軟件分析冰晶尺寸變化。20%蔗糖溶液做空白組，BSA（1.0 mg/L，20%蔗糖溶液配制）做對照組。

1.2.5 計算機模擬酶解 在UniProt 數據庫中搜索魚源膠原蛋白，選取O93484 膠原蛋白序列，通過酶切工具Peptide Cutter（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）選擇胰蛋白酶進行模擬酶解。

1.2.6 活性肽的性質預測 使用活性預測工具Peptide Ranker（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）對酶解獲得的多肽片段活性進行預測，篩選高活性（＞0.5）的肽片段。使用毒性預測工具ToxinPred（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/multi_submit.php）篩選無毒的活性肽。使用抗凍蛋白/抗凍多肽數據庫CryoProtect（http://codes.bio/cryoprotect/）篩選屬于抗凍多肽的肽序列。

1.2.7 海鱸魚肌球蛋白重鏈的同源建模 分別使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）、ITASSER（https://zhanggroup.org/I-TASSER/）對肌球蛋白重鏈進行同源建模，選擇準確度高的建模結果。

1.2.8 分子對接 使用Discovery studio 2019 軟件進行分子對接。進行''Prepare Protein''的前處理操作去除肌球蛋白重鏈晶體的水分子和配體并定義為受體。配體活性肽通過''Prepare Ligands''前處理并通過''Full Minimization''進行CHARMm 力場最小化優(yōu)化結構。處理后的肌球蛋白重鏈晶體以及抗凍多肽分別進行Dock Ligands（CDOCKER）分子對接。篩選結果中對接成功的化合物，并選取分值最高的對接結果。

1.2.9 分子動力學模擬 分子動力學模擬使用Discovery studio 2019 軟件進行。將分子對接的蛋白-多肽復合物導入，進行''Prepare Protein''前處理，添加力場charmm36，進行Solvation 流程溶劑化復合物。打開動力學流程Standard Dynamics Cascade，設置Simulation Time（ps）為20、Simulation Time（ps）為200、Number of Processors 為8，其它參數保持默認。

2 結果與分析

2.1 不同酶解產物的抗凍活性

選用五種蛋白酶分別測定不同酶解物的抗凍活性，以嗜熱鏈球菌的低溫保護活性為檢測指標，結果如圖1。由圖可知，經過胰蛋白酶的水解后，魚鱗酶解物對嗜熱鏈球菌存活率顯著提高（＜0.05），達到80.35%±4.39%。后續(xù)對其抗凍活性進行表征，并命名為AFPs。

圖1 不同蛋白酶對嗜熱鏈球菌存活率的影響Fig.1 Effect of different proteases on the viability of S.thermophiles

2.2 熱滯活性

在不同保留溫度下測定了BSA 和AFPs 的部分融化過程DSC 曲線，二者相應的DSC 熱流曲線結果如表1 所示。隨著保留溫度T的上升，BSA 組的冰核百分含量（Φ）從91.8%下降到38.2%，而AFPs組的冰核百分含量（Φ）從44.7%下降到5.3%。在相同保留溫度時，AFPs 的冰核含量明顯低于BSA，而熱滯活性高于BSA。說明當T越接近樣品融點時，Φ 含量越低，THA 越高，THA 與冰核百分含量（Φ）存在一定的負相關關系。

表1 BSA 和AFPs 的凍結起始溫度、保留溫度、冰晶含量和熱滯活性Table 1 Freezing initiation temperature,retention temperature,ice crystal content and thermal hysteresis activity of BSA and AFPs

2.3 重結晶抑制活性

大冰晶的表面能小于小冰晶的表面能，凍融過程中小冰晶不斷聚合形成大冰晶，產生冰重結晶現(xiàn)象。而抗凍多肽可以使冷凍溶液中冰晶保持小尺寸狀態(tài)，抑制冰晶的重結晶。如圖2 所示，在含有AFPs 的溶液中，冰晶尺寸小于同濃度的BSA 溶液和空白組。

圖2 水分子重結晶顯微成像Fig.2 Photomicroscope images showing inhibition of ice recrystallization

2.4 計算機輔助挖掘魚源抗凍多肽

選擇PeptideCutter 中的胰蛋白酶對魚源膠原蛋白進行酶解切割，通過模擬酶解方法，省去分離純化及質譜等步驟。經模擬酶解后1356 個氨基酸的魚源膠原蛋白序列被酶解為115 條肽段，具體結果如表2 所示。

表2 模擬酶解肽段序列及切割位點Table 2 Mimic enzymatic hydrolysis peptide sequence and cleavage site

2.5 魚源抗凍多肽的篩選

將所有肽段進行Peptide Ranker 活性預測，選擇預測活性分數大于0.5 的共47 條肽段序列，并對其進行ToxinPred 毒性預測，結果表明除GATGPGGIR序列外其余序列皆無毒，使用抗凍蛋白/抗凍多肽數據庫CryoProtect 篩選，結果表明除R 序列外其余序列皆屬于潛在的抗凍多肽。具體結果如表3。

表3 肽段序列活性、毒性分析及抗凍活性預測Table 3 Peptide sequence activity,toxicity analysis and antifreeze activity prediction

2.6 魚肌球蛋白的同源建模

對海鱸魚肌球蛋白重鏈進行同源建模，采用SWISS-MODEL 構建的三維結構模型見圖3a，ITASSER 構建的三維結構模型見圖3b。為進一步說明同源建模結果的合理性，通過SAVESv6.0（https://saves.mbi.ucla.edu/）對建模結果進行評估。拉式構像圖（Ramachandran plot）是描述蛋白質結構中氨基酸殘基二面角ψ 和φ 是否在合理區(qū)域的一種可視化方法，也可以反映出該蛋白質的構象是否合理。由圖4a、圖4c 可知，SWISS-MODEL 構建的三維結構模型有氨基酸88.9%落在完全允許區(qū)，9.2%落在允許區(qū)，0.9%落在最大允許區(qū)，0.9%落在不允許區(qū)，99.1%落在合理的區(qū)域。I-TASSER 構建的三維結構模型有氨基酸81.6%落在完全允許區(qū)，16.1%落在允許區(qū)，2.3%落在最大允許區(qū)，沒有落在不允許區(qū)氨基酸，100%落在合理的區(qū)域。

圖3 海鱸魚肌球蛋白重鏈同源建模的三維結構Fig.3 3D structure of sea bass myosin heavy chain homology modeling

蛋白三維結構準確性隨著整體質量因素值的增加而增加。通常，高分辨率晶體結構的值可以達到95%，而分辨率較低的結構的值只能達到大約91%。由圖4b、圖4d 可知，SWISS-MODEL 構建的三維結構模型精確值為92.661%，I-TASSER 構建的三維結構模型精確值為96.154%。與高分辨率晶體結構更接近，表明I-TASSER 構建的三維結構模型的準確性相對較高。故I-TASSER構建的三維蛋白結構模型更可靠，用于后續(xù)的分子對接研究。

圖4 建模結果評估Fig.4 Modeling result evaluation

2.7 抗凍多肽與魚肌球蛋白重鏈的分子對接

與肌球蛋白重鏈對接上的抗凍多肽序列共有GR、GMK、GAR、GPR、GPAGGK 五條。Graham等從雪蚤中純化的抗凍蛋白氨基酸序列為GAA GAGSSGP。Cao 等通過序列分析推導出AP-3 抗凍蛋白氨基酸組成為GLLGPLGPRGL。Wang 等純化的鯊魚皮膠原蛋白抗凍多肽氨基酸序列為GAIGPAGPLGP。Nikoo 等從黑龍江鱘魚皮明膠中提取的抗凍多肽是PAGT，并驗證出PAGT 在肉糜模型系統(tǒng)中具有抗氧化和冷凍保護作用。Damodara 等分離的魚明膠抗凍多肽氨基酸序列為KDGTPGQFGP（OH）PGAPGKGN（OH）H、NEGT PGTGPAGPP（OH）GFHTPK（OH）W，它們都含有GTPG-和GPP（OH）G-結構指紋。綜上，選擇更符合膠原蛋白抗凍多肽的序列GPR 與GPAGGK 進行進一步對接及動力學分析。

選擇的對接結合空腔坐標為64.5359、85.5816、76.7437、半徑為8，GPR 和GPAGGK 與肌球蛋白重鏈的對接結果如圖5a、圖5b 所示，對接位點2D 示意圖如圖6 所示，模擬酶解肽段GPR 可以與MHC 中Ile34 氨基酸形成碳氫鍵，與Asp76 氨基酸形成靜電作用，與Ala75、Asp76、Ile77 氨基酸形成氫鍵，還能以范德華力與Ile9、Gln33、Asn38、Ala40、Ile62、Arg63、Ile64、Phe155 氨基酸結合。模擬酶解肽段GPAGGK 可以與MHC 中Ala75 氨基酸形成氫鍵，還能以范德華力與Gln33、Ala37、Leu41、Phe58、Gly59、Phe61、Ile62、Ser74、Asp76、Ile77、Glu78、Thr79、Tyr80、Leu153 氨基酸結合。

圖5 抗凍多肽與肌球蛋白重鏈的分子對接Fig.5 Molecular docking of antifreeze peptides and myosin heavy chain

圖6 對接2D 示意圖Fig.6 2D diagrams of docking

在凍藏過程中，首先被凍結的為組織內的自由水。隨著凍結時間的延長，自由水完全轉化為冰后與蛋白質結合的結合水也開始發(fā)生凍結，脫離蛋白，從而導致疏水鍵及二硫鍵等化學鍵的形成并聚集，蛋白的各個側鏈相互聚集，發(fā)生不可逆的變性?？箖龆嚯目梢酝ㄟ^氫鍵、疏水相互作用和范德華力等分子之間作用力，吸附在液體冰晶表面，阻礙了冰晶在固、液界面位移及與水分子的結合。通過抗凍多肽與肌球蛋白重鏈的分子對接發(fā)現(xiàn)，抗凍多肽還可以通過氫鍵、范德華力等分子間作用力與肌球蛋白直接作用，結合在肌球蛋白的結構空腔上，影響疏水鍵及二硫鍵等化學鍵的形成，阻礙蛋白側鏈聚集與結構改變，對冰晶的位移也有一定影響作用。

2.8 抗凍多肽與海鱸魚肌球蛋白重鏈的分子動力學模擬

通過繪制蛋白質的RMSD 作為構象變化的函數，可以可視化整體蛋白質穩(wěn)定性。在分子動力學模擬中，RMSD 用于評估與初始蛋白質結構的結構偏差（即估計蛋白質完整性）。RMSD 連續(xù)增加至高值表明構象不穩(wěn)定。MHC、MHC-GPR 和MHCGPAGGK 計算出的RMSD 值如圖7a 所示。RMSD值隨著構象變化逐漸增加，MHC 的RMSD 值在構象60 時達到最大，波動約為0.8 ?；MHC-GPR 的RMSD 值在構象73 時達到最大，波動約為1.5 ?；MHC-GPAGGK 的RMSD 值相較其他較為穩(wěn)定，波動約為0.5 ?，這些波動可能是因為肌球蛋白三級和二級結構的變化。與單獨的MHC 相比MHC-GPR初始穩(wěn)定性會提高，但隨著溫度和時間變化，構象會變得更不穩(wěn)定，這可能是因為GPR 與MHC 的結合并不牢固。而MHC-GPAGGK 可以使蛋白在溫度和時間的變化中變得構象更加穩(wěn)定。

圖7 分子動力學模擬結果Fig.7 Molecular dynamics simulation results

為了進一步表征肌球蛋白重鏈的構象靈活性，繪制了RMSF 作為殘基數的函數。RMSF 值是殘留靈活性的標準。如圖7b 所示，殘基17～32，173～187和214～231 的RMSF 值顯著增加。這些具有較大RMSF 波動的位置是肌球蛋白重鏈柔性較大的區(qū)域，推測是肌球蛋白重鏈與抗凍多肽作用的位置。通過RMSD 與RMSF 的結果，可以發(fā)現(xiàn)，抗凍多肽GPAGGK 與肌球蛋白結合可以在溫度變化的過程中，穩(wěn)定構象，延緩蛋白變性。

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)魚源膠原蛋白的胰蛋白酶酶解物具有較高的抗凍活性，使用胰蛋白酶模擬酶解魚源膠原蛋白，運用計算機篩選得到抗凍多肽，省去分離純化及質譜等步驟。并與同源建模后的海鱸魚肌球蛋白重鏈進行分子模擬，以研究魚源膠原蛋白抗凍多肽對肌球蛋白的保護機制。分子對接結果表明，肽段GPR 和GPAGGK 能夠通過碳氫鍵、氫鍵和范德華力等分子作用力對海鱸魚肌球蛋白的結構及聚集行為產生影響，阻礙蛋白側鏈聚集、結構改變和冰晶的位移等。分子動力學結果表明，肽段GPAGGK 比肽段GPR 結合的更穩(wěn)定，由此結果可預測肽段GPAGGK 對魚糜及魚糜制品在冷凍貯藏中的品質保持起到更明顯的作用，GPAGGK 可作為潛在的抗凍劑應用于后續(xù)抗凍魚糜產品的研發(fā)。