陳曉龍， 應(yīng)多， 包斐， 方瑞秋

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 玉米與特色旱糧研究所，浙江 東陽 322100)

甜玉米作為普通玉米育種改良后的產(chǎn)物，不僅營養(yǎng)豐富，而且由于其果皮薄、口感脆甜、皮渣率低等特點，能克服普通玉米的很多缺點，起到改善人們膳食結(jié)構(gòu)的作用，因此，越來越被大眾所喜愛，然而大部分的甜玉米自交系并沒有詳細系譜記載，極大地影響了后續(xù)種質(zhì)改良及其雜交組合組配，使其育種效率大大降低[1]。玉米的生產(chǎn)模式是雜種優(yōu)勢利用[2]，借助這種模式可以顯著提高鮮食玉米的品質(zhì)以及產(chǎn)量，同時，不同雜種優(yōu)勢群之間雜交后代表現(xiàn)出的雜種優(yōu)勢存在一定差異[3]，因此，合理充分地利用甜玉米的雜種優(yōu)勢就需要對雜種優(yōu)勢群進行準(zhǔn)確劃分并建立對應(yīng)的雜種優(yōu)勢模式[4]。

傳統(tǒng)的育種方式依靠田間農(nóng)業(yè)性狀調(diào)查結(jié)果，對實驗的自交系類群進行表型聚類分析，其結(jié)果與系譜圖比較存在一定誤差，其可靠性仍值得商榷。但DNA分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為種質(zhì)資源遺傳多樣性研究提供了新的手段。其中SSR標(biāo)記由于基因組中分布廣泛、標(biāo)記無功能、標(biāo)記序列兩側(cè)順序較保守、共顯性遺傳以及DNA質(zhì)量要求低等特性，已逐漸被育種家們廣泛使用[5]。在SSR引物的開發(fā)上，楊珊等[6]利用20份自交材料的24個SSR引物篩選出了4個對玉米耐鹽堿性相關(guān)的SSR引物。李余良等[7]從玉米基因數(shù)據(jù)庫中開發(fā)了251對SSR引物，電泳檢測出12對關(guān)于雌穗發(fā)育差異的高多態(tài)性SSR引物。在SSR引物的應(yīng)用上，張微微等[8]利用篩選出的40對SSR核心引物對213份背景模糊的鮮食玉米進行遺傳多樣性分析，將213份鮮食玉米品系劃分為3大類群，其結(jié)果與自交系譜系及來源相符。

本研究利用北京農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心研發(fā)的針對中國玉米種質(zhì)開發(fā)的40對SSR核心引物對50份浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米與特色旱糧研究所搜集的甜玉米自交系進行遺傳多樣性分析，并依據(jù)結(jié)果進行針對性地組合配對實驗，為合理挑選優(yōu)良甜玉米自交系和選育新品種提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用的50份甜玉米自交系都來自于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米與特色旱糧研究所且都是通過多代自交純化而來，遺傳性狀良好穩(wěn)定。

1.2 DNA的提取與檢測

分別取50份甜玉米自交系的籽粒10顆，在恒溫光照培養(yǎng)箱里恒溫培養(yǎng)，待生長至3葉期時，同一自交系混合取樣，液氮磨成粉末，采用CTAB法抽提DNA[9-10]，并通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000分光光度計進行檢測。

1.3 40對SSR核心引物的合成與多態(tài)性統(tǒng)計分析

選用的SSR引物為北京農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心針對中國玉米種質(zhì)開發(fā)的40對核心SSR標(biāo)記[11-12]，引物名稱及序列見表1，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過提取的50份甜玉米自交系DNA進行PCR擴增，產(chǎn)物用8.0%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，180 V恒壓電泳1.5～4.0 h，并利用銀染顯色[13]。擴增產(chǎn)物以“0、1、2”統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)庫，在相同遷移位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，數(shù)據(jù)缺失記為“2”。標(biāo)記位點的多態(tài)性信息量(PIC)按公式PIC=1-∑fi2計算，其中，fi表示某標(biāo)記位點第i等位基因的基因頻率[14]。利用軟件NTsys 2.10e處理數(shù)據(jù)，并按UPGMA(unweight pair group method arithmetic averages)方法進行聚類分析。

表1 40對核心SSR標(biāo)記的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記結(jié)果分析

近年來，SSR分子標(biāo)記技術(shù)在B73、Mo17等骨干玉米自交系基因組序列的公布下得到了廣泛的應(yīng)用[15]，截至目前，已有2 000多對玉米SSR引物發(fā)布于MaizeGDB，對所獲得的SSR引物用PCR進行擴增，再利用聚丙烯酰胺凝膠電泳，將所擴增出來的微衛(wèi)星片段進行觀察比較，可清晰且高效地應(yīng)用于甜玉米自交系的遺傳多樣性分析。如表2所示，40對SSR核心標(biāo)記引物在50份甜玉米自交系材料中進行擴增，共檢測到228個等位基因變異，不同的SSR標(biāo)記檢測到的等位基因變異為3～13個，平均為5.65個。40對SSR標(biāo)記引物位點的PIC值變化范圍在0.32～0.89，平均為0.59，其中，以擴增SSR引物umc1125y3、umc1492y13和umc1231k4為例(圖1)，在聚丙烯凝膠圖中發(fā)現(xiàn)該SSR標(biāo)記可以擴增出清晰穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。以上結(jié)果證明，實驗的SSR標(biāo)記具有高度的變異性，可以較好地滿足本實驗的要求。

表2 40對核心SSR引物的等位基因與多態(tài)性信息量

A、B、C分別代表引物umc1125y3、umc1492y13和umc1231k4對部分甜玉米自交系的擴增。

2.2 50份甜玉米自交系的聚類劃分

現(xiàn)階段面臨的現(xiàn)狀是新品種的選育遺傳基礎(chǔ)狹窄，國內(nèi)外種質(zhì)資源未進行有效整理和分類，極大地抑制了種質(zhì)的擴增、改良與創(chuàng)新[16]。因此，在育種中將擬組配用的甜玉米自交系材料先進行遺傳多樣性分析，再結(jié)合雜交優(yōu)勢原理組配雜交組合，有助于更高效地選育出優(yōu)良玉米品種。本研究利用NTsys 2.10e軟件計算出50份甜玉米自交系材料的遺傳相似系數(shù)，并通過UPGMA法進行聚類分析。由表3可知，在相似系數(shù)為0.57時，可將以上50份甜玉米自交系材料劃分為6大類，分別是包含33個親本的第Ⅰ大類、4個親本的第Ⅱ大類、3個親本的第Ⅲ大類、4個親本的第Ⅳ大類、5個親本的第Ⅴ大類和1個親本的第Ⅵ大類。

表3 50份甜玉米自交系聚類分析結(jié)果

2.3 優(yōu)良甜玉米自交系的組合配對實驗

研究現(xiàn)有不同種質(zhì)(品種)的遺傳多樣性，對深入剖析及挖掘優(yōu)異品種的基因組成和提高育種效率具有重要的理論和實踐意義[17-18]。通過前期對實驗材料的表型鑒定，篩選出具有代表性的優(yōu)質(zhì)甜玉米自交系，并結(jié)合聚類劃分結(jié)果選擇親緣關(guān)系較遠的自交系進行組合配對實驗。結(jié)果如圖2，以57和59的雜交組合為例，相比于父本和母本，雜交組合F1植株更加高大、強壯，果穗籽粒數(shù)量顯著增加且更加飽滿。由表4可知，參與實驗的10組雜交組合F1在株高、穗位高、穗行數(shù)、行粒數(shù)、穗長、穗粗、莖粗等農(nóng)藝性狀上都表現(xiàn)良好。這些結(jié)果暗示著聚類劃分能更好地輔助育種人員進行甜玉米自交系材料的選配，并結(jié)合雜種優(yōu)勢在甜玉米品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性方面的提升作用，能更好地用于選育性狀優(yōu)良的甜玉米品種。

圖2 甜玉米自交系F1雜交后代農(nóng)藝性狀

表4 甜玉米自交系F1雜交后代性狀調(diào)查

3 小結(jié)與討論

3.1 甜玉米遺傳多樣性分析的意義

遺傳多樣性分析可以輔助育種家更全面地了解甜玉米種質(zhì)資源的遺傳背景，是選育優(yōu)良甜玉米品種的重要前提。甜玉米作為甜質(zhì)型玉米亞種，籽粒含糖量高、口感脆甜，富含維生素、游離氨基酸和礦物質(zhì)，是一種深受廣大消費者青睞的玉米類型。然而，我國在甜玉米育種上還存在較多問題，例如種質(zhì)資源匱乏、耐熱和耐寒品種較少等[19]，極大地抑制了優(yōu)質(zhì)甜玉米品種的開發(fā)和應(yīng)用。持續(xù)引進和鑒定出與當(dāng)前主導(dǎo)種質(zhì)遺傳距離較遠的優(yōu)良新種質(zhì)，是拓展種質(zhì)基礎(chǔ)和創(chuàng)新種質(zhì)的重要渠道[20]。因此，本研究通過40對SSR分子標(biāo)記對50份甜玉米自交系分別進行了擴增，并依次利用電泳進行基因分型，然后利用UPGMA方法進行聚類分析，最終將50份甜玉米自交系材料劃分為6大類，較好地劃分了供試甜玉米自交系的遺傳背景。結(jié)合聚類劃分結(jié)果進行優(yōu)良甜玉米自交系的組合配對實驗，發(fā)現(xiàn)雜交F1農(nóng)藝性狀都表現(xiàn)良好，說明本研究的甜玉米遺傳多樣性分析可以快速對實驗種質(zhì)資源進行歸類，確定雜交種為基礎(chǔ)的自交系與父母本的遺傳距離遠近，將調(diào)控優(yōu)良性狀的基因高效地進行集合，對遺傳基礎(chǔ)方向的探索和途徑的拓展帶來極大的幫助。

3.2 SSR標(biāo)記技術(shù)的特點及其存在的問題

前人研究結(jié)果表明，群體遺傳多樣性與PIC值緊密相關(guān)，即群體的平均PIC值越高，DNA標(biāo)記位點變異程度越高，群體的遺傳多樣性就越豐富[21]，而PIC值的提高可以通過選擇更多的均勻分布在各個染色體上的SSR引物來實現(xiàn)[22]。在本研究中，40對SSR核心標(biāo)記引物均勻地分布在玉米的10條染色體上，在50份甜玉米自交系材料中共檢測到228個等位基因變異，不同的SSR標(biāo)記檢測到的等位基因變異為3～13個，平均為5.65個，40對SSR標(biāo)記引物位點的PIC值變化范圍在0.32～0.89，平均為0.59，PIC值較高，可以較好地揭示50份甜玉米自交系的遺傳差異。分子標(biāo)記的出現(xiàn)為遺傳多樣性分析提供了新的方法。隨著玉米基因組學(xué)的迅猛發(fā)展及分子育種實踐的持續(xù)深入，SSR標(biāo)記技術(shù)將會得到快速發(fā)展與改進[23-25]。SSR標(biāo)記技術(shù)的深入應(yīng)用，方便了育種者從分子層次上揭示表型性狀與基因之間的關(guān)系。但是，SSR標(biāo)記所面臨的問題是開發(fā)新的SSR引物投入高、難度相對較大并且在構(gòu)建玉米高密度遺傳圖譜時需要引入其他的標(biāo)記技術(shù)。但未來隨著科學(xué)家們對SSR標(biāo)記技術(shù)運用程度的逐步加深，SSR標(biāo)記技術(shù)面臨的難題將會被逐一攻破。