葛根芩連湯抑制特應(yīng)性皮炎小鼠模型炎癥反應(yīng)及恢復(fù)皮膚屏障功能的實驗研究

李昱達 鄭豐杰 王航 張淑靜 馮婧 劉錦鋼 湯陽 孫燕 李宇航

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)，又稱特應(yīng)性濕疹，屬中醫(yī)“四彎風”“奶癬”“胎瘡”等范疇，其發(fā)病與先天稟賦不足、胎毒遺熱、脾虛失運，風、濕、熱邪蘊結(jié)肌膚有關(guān)，具有表里同病、虛實夾雜的病證特點[1-2]。

近年來，對腸道與皮膚相互作用對過敏性疾病發(fā)病機制認識的日益增加，為治療AD提供了新的思路與途徑[3]，如發(fā)現(xiàn)腸道菌群可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)影響AD的發(fā)生發(fā)展，使用益生菌影響腸道菌群的組成對AD具有積極影響[4]?！秱摗犯鸶诉B湯具有外解表熱、內(nèi)清濕熱之功，為表里雙解之劑?，F(xiàn)今臨床應(yīng)用葛根芩連湯辨證治療潰瘍性結(jié)腸炎、2型糖尿病等為研究熱點，其作用機制與炎癥因子、腸道菌群、脂聯(lián)素相關(guān)信號通路等相關(guān)[5]。本文旨在觀察葛根芩連湯對2,4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene,DNFB)反復(fù)刺激皮膚誘導(dǎo)致敏的小鼠模型的干預(yù)作用，并從改善皮膚屏障功能和調(diào)控免疫炎癥角度初步探討其效應(yīng)機制，以期為中醫(yī)臨床辨證治療AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24只SPF級BALB/c小鼠，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SYXK(北京)2016-0006。適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，自由飲水和進食。所有實驗程序和實驗動物使用均符合北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會規(guī)定，倫理批準號：BUCM-4-2021051701-2061。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器

葛根芩連湯由葛根24 g、炙甘草6 g、黃芩9 g、黃連9 g組成[6]，中藥材全部購自北京同仁堂藥店。常規(guī)煎煮后，80℃水浴濃縮為濃度為1 g生藥/mL的藥液，4℃冰箱儲存?zhèn)溆?。糠酸莫米松凝膠[規(guī)格：0.1%，華潤三九(南昌)藥業(yè)有限公司，批號：2006007J]。

DNFB(美國Sigma公司，批號:M24318031)，丙酮(北京化工廠，批號：20170209)，橄欖油(西班牙 Mueloliva公司，貨號：fTYKZEeC)，脫毛膏(英國 Dimples公司，批號：20210621)，二甲苯(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號：20190325)，無水乙醇(北京化工廠，批號：20200417)，蘇木素染色液(中杉金橋，批號：20042002)，伊紅染色液(中杉金橋，批號：20060901)；小鼠血清總免疫球蛋白E (immunoglobulin E，IgE)酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa)試劑盒(批號:KT2056-A)，小鼠血清白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)Elisa試劑盒(批號:KT2163-A)，小鼠血清白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)含量Elisa試劑盒(批號:KT2176-A)，均購自江蘇科特生物科技有限公司。細胞組織RNA 提取試劑盒(Qiagen 批號: 74134)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo ，批號:K1622)；DNase/RNase-Free 水(索萊寶， 批號:R1600);Power SYBR Green PCR Master Mix熒光定量試劑盒(ABI，批號: 4367659)；高透光度粘性蓋膜 (ABI，批號:4360954)；MicroAmp?Fast96孔反應(yīng)板(ABI，批號: 4346906)；RNA引物(上海英俊生物技術(shù)有限公司)；普通 RIPA裂解液(索萊寶，批號:R0020)；蛋白酶抑制劑混合液(索萊寶，批號:P6730)； Filaggrin antibody(Proteintech公司，批號: 0900096)、密封蛋白1 antibody (Bioss公司，批號:AI100918); β-actin antibody(Bioss公司，批號:AH1 1286487)；HRP標記羊抗兔(Bioss公司，批號:AI100918)。

獨立通氣籠IVC飼養(yǎng)籠(江蘇·蘇杭科技器材有限公司)，皮膚多探頭測試儀(德國Courage+Khazakz)；HistoCore全自動封閉式組織脫水機，HistoCore Arcadia H石蠟包埋機，HistoCore Arcadia C組織切片冷臺，RM2255全自動切片機，HI1210攤片機和HI1220烤片機均購自德國Leica公司。Revolve FL正倒置一體熒光顯微鏡(美國Echo公司)，酶標儀(美國Biorad公司)，冷凍高通量組織研磨機(恩茨生物技術(shù)公司)，電泳儀器(Bio-Rad公司)，雙垂直電泳槽(Bio-Rad公司)，超靈敏多功能成像儀(Azure生物系統(tǒng)公司)，PCR擴增儀(Biorad公司)，StepOnePlus實時熒光定量 PCR儀(ABI公司)。

1.3 分組與造模

采用隨機數(shù)字表法將24只雄性BALB/c小鼠分為正常組、模型組、對照組(糠酸莫米松治療)和中藥組(葛根芩連湯治療)。參照文獻[7]采用DNFB半抗原反復(fù)刺激的方法制備AD小鼠模型。具體方法如下(見圖1)：致敏前用電推剪和脫毛膏除去小鼠背部毛發(fā)，面積約2.0 cm × 3.0 cm。在1 cm×1 cm的紗布上滴涂2% 的DNFB溶液200 μL，均勻涂抹在背部皮膚，每周2次(即第1、4、8、11天)。14天后改用0.2%的DNFB溶液200 μL，均勻涂抹在背部皮膚，2次/周，第15、18天重復(fù)上述操作，持續(xù)1周，模型組和各藥物治療組給予上述處理；正常組小鼠在相應(yīng)時間點在背部涂抹等量基質(zhì)溶液(丙酮∶橄欖油=4∶1)。

圖1 小鼠AD模型制備流程

1.4 藥物干預(yù)方法

在實驗第22天開始給藥。中藥組用葛根芩連湯灌胃6.24 g/(kg·d)，每日兩次，連續(xù)7天；對照組于小鼠皮損處均勻涂抹適量0.1% 糠酸莫米松凝膠，每日一次，連續(xù)7天；同時，正常組和模型組給予等量常溫蒸餾水灌胃，每日兩次，連續(xù)7天。

1.5 取材方法

于實驗第29天，對各組小鼠進行10 %水合氯醛麻醉后，采用摘眼球取血法獲得小鼠全血0.5～1 mL，室溫靜置2小時后，使用4℃離心機，高速離心15分鐘，3 000 r/min，抽取血清后置于冰箱保存待測。無菌條件下取小鼠皮損處皮膚組織，取部分皮膚以提取組織蛋白及RNA，其他皮膚組織以4%多聚甲醛溶液固定保存。

1.6 指標觀測

1.6.1 皮損評估 于實驗第1、7、14、28天，參考濕疹面積及嚴重程度指數(shù)(eczema area and severity index，EASI)[8]評價皮損情況與評估。背部皮損炎癥的評價指標:紅斑(出血)、水腫、表皮剝脫、鱗屑。0：無癥狀；1：輕；2：中；3：重。最高為12分。

1.6.2 小鼠搔抓行為觀察 觀察小鼠一般情況，參照Kuraishi方法[9]，在實驗第1、7、21、28天對小鼠搔抓行為進行觀察，記錄小鼠前后肢對頭面部、腹部、背部的搔抓次數(shù)并進行統(tǒng)計。

1.6.3 經(jīng)皮水分流失檢測 于實驗第1、7、21、28天對小鼠進行經(jīng)皮失水數(shù)值測量。使用皮膚多探頭測試儀的Tewameter TM300探頭測定小鼠背部皮損處經(jīng)皮失水率，使用標準測量法，設(shè)置測定時間為20秒/次，讀取前15秒的平均值。

1.6.4 皮膚pH值 于實驗第1、7、21、27天對小鼠進行皮膚pH值檢測。使用pH905探頭測定皮損及非皮損處 pH值，每次重復(fù)檢測3次，結(jié)果取平均值。保持每次檢測時間、室內(nèi)環(huán)境、檢測人及其他條件的相對一致性。

1.6.5 皮膚組織病理學(xué) 取小鼠剃毛區(qū)域皮膚組織，用4%多聚甲醛溶液固定后，將組織標本脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.6.6 血清總IgE、IL-6、IL-10水平檢測 使用ELISA試劑盒進行血清相關(guān)指標檢測，具體步驟參考試劑盒說明書進行。反應(yīng)結(jié)束后，使用酶標儀在450 nm測量96孔板中各孔樣本的吸光值(OD值)，根據(jù)標準曲線，計算樣本濃度。

1.6.7 絲聚合蛋白、密封蛋白1 mRNA表達 在皮膚組織中加入適量的裂解液和研磨珠，放入冷卻組織研磨機粉碎，用RNA提取試劑盒取組織上清液，測定濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將 GAPDH 作為內(nèi)參，SYBR Green 作為染料進行熒光定量 PCR 擴增。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 分鐘； 95 ℃變性5秒，60 ℃退火30秒，40個擴增循環(huán)；熔解曲線放大，95℃ 15秒，60℃ 1分鐘；在 95 ℃下延長15秒。通過計算2-ΔΔCt法進行相對表達量分析。引物序列見表1。每組隨機取3只小鼠的皮膚組織進行檢測。

表1 引物序列

1.6.8 絲聚合蛋白、密封蛋白1的蛋白表達 在皮膚組織中加入適量的含有苯甲磺酰氟的組織裂解液和研磨珠，放入組織研磨機粉碎，離心提取組織上清液并通過變性buffer使其變性。SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，并進行恒壓轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，孵育一抗過夜、TBST洗3次，孵育二抗，TBST洗3次，顯色、拍照。運用Image J軟件分析灰度值，并計算與目標蛋白灰度值/β-actin灰度值的相對表達。每組隨機取3只小鼠的皮膚組織進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮損評估

用2%DNFB丙酮、橄欖油溶液刺激后，小鼠情緒躁動不安，頻繁搔抓背部，背部皮膚出現(xiàn)輕微紅斑、水腫、小面積表面剝脫等表現(xiàn)。 隨著涂抹次數(shù)的增加, 出現(xiàn)紅斑加重、皮膚結(jié)痂并伴有干燥、脫屑、皮膚肥厚增生等慢性改變。給藥后，與模型組比較, 中藥組、對照組小鼠背部皮損的紅斑、結(jié)痂逐漸消退，皮膚肥厚增生較少。

造模第1、7、21天，與正常組相比，模型組皮損程度嚴重(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組皮損程度無明顯差異(P>0.05)。第28天，與正常組相比，模型組皮損程度嚴重(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組皮損顯著改善(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 各組AD小鼠皮損嚴重程度評分比較分)

注：A 正常組；B 模型組；C 中藥組；D 對照組。

2.2 搔抓行為觀察

在各組小鼠造模的第1天，觀察其30分鐘內(nèi)搔抓次數(shù)。與正常組比較，模型組搔抓次數(shù)明顯增高(P<0.05)；與模型組相比較，中藥組、對照組搔抓次數(shù)無明顯差異(P>0.05)。造模的第7、21天，觀察其30分鐘內(nèi)搔抓次數(shù)，與正常組比較，模型組搔抓次數(shù)明顯增高(P<0.05)；與模型組相比較，中藥組、對照組搔抓次數(shù)無明顯差異(P>0.05)。造模第28天觀察其30分鐘內(nèi)搔抓次數(shù)，與正常組比較，模型組搔抓次數(shù)明顯增高(P<0.05)；與模型組相比較，中藥組、對照組搔抓次數(shù)有明顯減少(P<0.05)。見表3。

表3 各組AD小鼠30分鐘內(nèi)搔抓次數(shù)比較次)

2.3 經(jīng)皮水分流失分析

造模第1天，與正常組相比，模型組經(jīng)皮失水升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組無明顯差異(P>0.05)。第7、14、21天，與正常組相比，模型組經(jīng)皮失水顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組無明顯差異(P>0.05)。第28天，與正常組相比，模型組經(jīng)皮失水升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組經(jīng)皮失水明顯下降(P<0.05)。見表4。

表4 各組AD小鼠經(jīng)皮失水比較

2.4 皮膚pH值

造模第1、7、21天，與正常組相比，模型組皮膚pH值顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組皮膚pH值無明顯差異(P>0.05)；第27天，與正常組相比，模型組皮膚pH值顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組皮膚pH值明顯下降(P<0.05)。見表5。

表5 各組AD小鼠皮膚pH值比較

2.5 皮膚組織病理學(xué)觀察

治療后，正常組表皮及真皮各層結(jié)構(gòu)完整且正常;模型組表皮層不完全角化，顆粒層和棘層增厚，表皮、真皮層均有大量炎細胞浸潤;中藥組及對照組小鼠表皮層角化不全嚴重程度較輕，顆粒層、棘層輕微增厚，中等量炎細胞浸潤。見圖3。

注：A 正常組；B 模型組；C 中藥組；D 對照組。

2.6 血清總IgE、IL-6、IL-10

血清總IgE水平:與正常組相比，模型組數(shù)值較高，存在顯著差異(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組IgE數(shù)值均明顯降低(P<0.05)。血清IL-6水平:與正常組相比，模型組數(shù)值較高，存在顯著差異(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、對照組IL-6數(shù)值均明顯降低(P<0.05)。血清IL-10:與正常組相比，模型組明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，中藥組與對照組無顯著差異(P>0.05)。見表6。

表6 各組AD小鼠血清總IgE、IL-6、IL-10水平比較

2.7 皮膚組織絲聚合蛋白、密封蛋白1 mRNA表達

與正常組相比，模型組絲聚合蛋白的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，密封蛋白1的mRNA表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，中藥組與對照組各指標mRNA表達均明顯升高(P<0.05)。結(jié)果見表7。

表7 各組AD小鼠皮膚組織絲聚合蛋白、密封蛋白1 mRNA表達情況

2.8 皮膚組織絲聚合蛋白、密封蛋白1蛋白表達

與正常組相比， 模型組絲聚合蛋白的蛋白含量顯著降低(P<0.05)，密封蛋白1的蛋白含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，中藥組與對照組各指標蛋白含量均明顯升高(P<0.05)。結(jié)果見表8，圖4。

表8 各組AD小鼠皮膚組織絲聚合蛋白、密封蛋白1 蛋白表達情況

注：A 正常組；B 模型組；C 中藥組；D 對照組。

3 討論

AD確切病因及發(fā)病機制尚未完全闡明，目前占主導(dǎo)地位的是美國學(xué)者Peter M. Elias提出的“內(nèi)外串擾病機學(xué)說”，即AD發(fā)生發(fā)展是在皮膚屏障功能受損基礎(chǔ)上，變應(yīng)原引發(fā)免疫功能紊亂和調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致過敏性炎癥反應(yīng)；而異常免疫炎癥反應(yīng)進一步破壞皮膚屏障。內(nèi)外串擾，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致本病遷延難愈[10-11]?，F(xiàn)今臨床治療AD，主張改變生活習(xí)慣、避免接觸過敏原、外用保濕潤膚劑等基礎(chǔ)治療，輕中度患者可局部外用糖皮質(zhì)激素、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑、磷酸二酯酶4等緩解或消除癥狀，重度患者口服抗組胺藥物、免疫抑制劑、系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等[12]；尋找和研究治療AD作用確切、副作用低的有效方藥或成分，一直是皮膚科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。

AD屬于中醫(yī)學(xué)“奶癬”“胎斂瘡”“四彎風”“血風瘡”“浸淫瘡”等病證范疇，中醫(yī)學(xué)對其病因病機的認識和治療積累了豐富經(jīng)驗，中醫(yī)中藥或中西醫(yī)結(jié)合辨證治療AD安全有效，且具有不易復(fù)發(fā)、不良反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)勢[13-15]。世界中醫(yī)藥聯(lián)合會皮膚科專業(yè)委員會2021年發(fā)布的特應(yīng)性皮炎中醫(yī)診療指南中[1]，將AD分為心脾積熱、心火脾虛、脾虛濕蘊、風濕熱蘊、脾虛血燥、脾腎陽虛6個證型辨證施治，并提出AD急性期治療當以祛除蘊結(jié)在肌膚之風濕熱邪為要，輔以健脾祛濕，推薦選用三心導(dǎo)赤飲、培土清心方、小兒化濕湯、消風散等加減，側(cè)重從心、脾兩臟論治。有學(xué)者提出基于“肺主皮毛”理論，運用宣、補、潤、清等法從肺論治AD[16]。本課題組采用經(jīng)方麻黃連軺赤小豆湯加減辨治AD證屬風濕熱邪蘊結(jié)肌膚者，臨床療效滿意，并從調(diào)控非組胺依賴性神經(jīng)信號傳導(dǎo)、皮膚屏障功能等方面探討了其效應(yīng)機制[17-19]。

“皮應(yīng)大腸”是中醫(yī)學(xué)藏象學(xué)說代表性理論之一。對此，《靈樞·本藏》云：“大腸者，皮其應(yīng)”“皮厚者，大腸厚，皮薄者，大腸薄；皮緩，腹里大者，大腸大而長；皮急者，大腸急而短；皮滑者，大腸直；皮肉不相離者，大腸結(jié)”，強調(diào)了皮膚與大腸生理上相互聯(lián)系、病理上相互影響。多項臨床研究證實腸道疾病與皮膚病存在共病風險：2020年韓國一項基于全國人群的研究發(fā)現(xiàn)，患AD可導(dǎo)致克羅恩病與潰瘍性結(jié)腸炎患病風險增加[20]；2021年又一項前瞻性隊列研究表明，特應(yīng)性皮炎、銀屑病和酒糟鼻患者克羅恩病的發(fā)病風險增加[21]。這些研究為中醫(yī)“皮應(yīng)大腸”理論和皮膚病從腸論治提供了臨床證據(jù)和思路。

葛根芩連湯出自《傷寒論》，主治太陽病誤用攻下、里熱挾表邪下利證，是后世用以治協(xié)熱下利的代表方劑，現(xiàn)今臨床多用其治療腸炎、結(jié)腸炎等腸道炎癥證屬濕熱者。需要指出的是，《傷寒論》第34條原文中“下利”“脈促”“喘而汗出”不僅反映了里(腸、肺)熱挾表邪為病的特點，而且以主癥“下利”強調(diào)邪熱在“腸”，以兼癥“喘而汗出”提示邪熱在“肺”“皮毛”間攻沖串擾，故亦可用于治療呼吸、皮膚相關(guān)疾病。

經(jīng)皮失水、皮膚pH值是檢測皮膚屏障的無創(chuàng)指標，兩者都可反映出皮膚屏障是否出現(xiàn)功能障礙。研究表明AD患者的經(jīng)皮失水及皮膚pH值均有升高[22]。絲聚合蛋白參與表皮角質(zhì)形成細胞的分化，對皮膚屏障的形成發(fā)揮關(guān)鍵作用。密封蛋白1是緊密連接的重要組成，其可維持皮膚屏障完整性。有實驗研究表明當密封蛋白1水平下降到閾值，會導(dǎo)致緊密連接和表皮屏障功能受損，并發(fā)生AD[23]。本課題研究表明，葛根芩連湯用于治療AD模型小鼠有較好療效，可有效緩解小鼠背部皮膚損傷情況，減少小鼠搔抓次數(shù)，降低經(jīng)皮水分流失及皮膚pH值，抑制炎癥反應(yīng)并可提高小鼠皮膚組織絲聚合蛋白、密封蛋白1含量從而改善皮膚屏障功能，為進一步深入探討葛根芩連湯從腸防治AD的相關(guān)機制奠定了實驗基礎(chǔ)。