利清通方對高尿酸血癥大鼠的降血尿酸作用及對尿酸生成限速酶與尿酸轉(zhuǎn)運體的影響

邸松蕊 劉金蓮 余淑惠 南海鵬 方文娟 陳洪璋 王淳 王林元 李波 張建軍

高尿酸血癥是血尿酸異常升高的代謝性疾病[1]，屬于中醫(yī)“伏邪”“膏濁病”范疇[2]，多由濕熱內(nèi)生、脾腎兩虛所致，可以清熱利濕佐以健脾補腎之法進行治療[3]。本課題組基于臨床經(jīng)驗及病證結(jié)合、方證相應(yīng)形成了降血尿酸的新復(fù)方——利清通方。利清通方由土茯苓、車前子、茯苓、菊苣、葛根和川牛膝組成，方中土茯苓清熱利濕，車前子利尿通淋，二者同用，共奏通利水道之效，共為君藥；茯苓和菊苣利水消腫以祛邪，健運脾胃以扶正，同為臣藥；葛根升清陽助臣藥運化，生津防利水太過，是為佐藥；川牛膝利尿通淋，且兼補肝腎，是為使藥。諸藥合用，共奏清利濕熱之功，又兼調(diào)補脾腎、顧護正氣之效。

本實驗擬通過高尿酸血癥大鼠模型，探討中藥復(fù)方——利清通方降血尿酸作用，并進一步通過對尿酸生成限速酶、腎臟尿酸轉(zhuǎn)運體等的影響研究其可能的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量(180±20)g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物中心，動物房室溫為20～22℃，相對濕度60～70%，光照周期12小時。

1.2 藥物、試劑與儀器

利清通方由中藥飲片煎煮濃縮制備：車前子、土茯苓、茯苓、葛根、川牛膝、菊苣。加水煎煮濃縮而成，分兩次煎煮，放于4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩＼嚽白?批號：21011404，安國市一方藥業(yè)有限公司)，土茯苓(批號：Y20121015，安國市一方藥業(yè)有限公司)，茯苓(批號：20112013，安國市一方藥業(yè)有限公司)，葛根(批號：Y20121011，安國市一方藥業(yè)有限公司)，川牛膝(批號：Y20120102，安國市一方藥業(yè)有限公司)，菊苣(批號：WLJJ191201，江山市萬里中藥材有限公司)。

氧嗪酸鉀(批號：Y18M11C113291，上海源葉生物科技有限公司)，別嘌呤醇[批號：ANW369，華恒威科(北京)科技有限公司]。血尿酸(serum uric acid，SUA)試劑盒(批號：20210107，南京建成生物工程研究所)，血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)試劑盒(批號：20210107，南京建成生物工程研究所)，血肌酐(serum creatinine，Scr)試劑盒(批號：20210107，南京建成生物工程研究所)，黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)試劑盒(批號：20210127，南京建成生物工程研究所)，腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)試劑盒(批號：20210127，南京建成生物工程研究所)。

臺式離心機(型號：TGL-16c，上海安亭科學(xué)儀器廠)；冷凍離心機(型號：neofuge 15R，Heal Force)；全自動放免技術(shù)儀(型號：XH-6020，西安核儀器廠)；全自動生化分析儀(型號：Chemray-240，深圳雷杜生命科技)；酶標(biāo)分析儀(型號：DR-200BS，無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)；電子天平[型號：PL-203，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.3 分組與造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，48只大鼠按照體質(zhì)量進行編號，再按照隨機數(shù)字表法分為6組，每組8只，分別為：空白組、模型組、別嘌呤醇組、利清通方低劑量組(1.25 g/kg，相當(dāng)于人15 g/天)、利清通方中劑量組(2.5 g/kg，相當(dāng)于人30 g/天)和利清通方高劑量組(5 g/kg，相當(dāng)于人60 g/天)。采用灌胃氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥大鼠模型：每日上午9：00灌胃氧嗪酸鉀750 mg/kg，空白組灌胃等劑量蒸餾水，灌胃劑量為1 mL/100 g。每周測量大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整灌胃劑量，連續(xù)造模30天。

1.4 給藥方法

造模同時，各組均在每日下午15：00給藥，空白組和模型組灌胃等劑量生理鹽水，別嘌呤醇組灌胃給予別嘌呤醇27 mg/kg，利清通方低、中、高劑量組灌胃給予稀釋至同體積的不同濃度的受試樣品，灌胃劑量為1 mL/100 g，連續(xù)給藥30天。

1.5 取材方法

實驗第31天，采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.5 mL/100 g麻醉大鼠，腹主動脈采血，室溫靜置2小時，在4℃條件下以3 000 r/min離心15分鐘后取上層血清，留存用于血清指標(biāo)的檢測。冰上取大鼠腎臟快速放于液氮中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，用于后續(xù)指標(biāo)檢測。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 一般狀態(tài)觀察 實驗期間記錄各組大鼠造模給藥后毛發(fā)、精神活動狀態(tài)以及每周大鼠體質(zhì)量的變化。

1.6.2 血清SUA、BUN、Scr、XOD、ADA含量測定 采用比色法，全自動生化儀檢測SUA、BUN、Scr、XOD、ADA含量。

1.6.3 尿酸轉(zhuǎn)運體相關(guān)指標(biāo) 采用實時熒光定量PCR測定腎尿酸轉(zhuǎn)運體[三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白2(ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2)、尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運體1(recombinant urate transporter 1，URAT1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白9(glucose transporter 9，GLUT9)]mRNA表達。采用蛋白免疫印跡法測定腎臟組織中ABCG2、URAT1蛋白表達。從各組大鼠中隨機抽取3只進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

適應(yīng)性喂養(yǎng)期間，大鼠毛發(fā)及精神狀況良好。造模后，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)毛發(fā)干枯發(fā)黃、形體消瘦且精神狀況差的現(xiàn)象。與模型組相比，各給藥組大鼠毛發(fā)整齊，精神狀態(tài)佳，活動度良好。

與空白組相比，模型組體質(zhì)量在造模第14天、21天、28天下降(P<0.05)；與模型組相比，別嘌呤醇組體質(zhì)量在造模第21天上升(P<0.05)，利清通方中劑量組體質(zhì)量在造模第7天上升(P<0.05)，利清通方中、高劑量組體質(zhì)量在造模第21天、28天上升(P<0.05)。見表1。

表1 利清通方對高尿酸血癥大鼠體質(zhì)量的影響

2.2 利清通方對高尿酸血癥大鼠血清SUA、BUN、Scr含量的影響

與空白組相比，模型組SUA含量升高(P<0.05)；與模型組相比，利清通方高劑量組SUA含量顯著降低(P<0.05)，別嘌呤醇組和利清通方中劑量組有降低趨勢，別嘌呤醇組Scr含量降低(P<0.05)，各給藥組BUN含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 利清通方對高尿酸血癥大鼠血清SUA、BUN、Scr的影響

2.3 利清通方對高尿酸血癥大鼠ABCG2、URAT1、GLUT9 mRNA表達的影響

與空白組相比，模型組URAT1、GLUT9 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，ABCG2 mRNA表達量有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；與模型組相比，別嘌呤醇組、利清通方低、中、高劑量組ABCG2 mRNA表達量升高(P<0.05)，URAT1 mRNA表達量降低(P<0.05)，GLUT9 mRNA表達量降低(P<0.05)。見表3。

表3 利清通方對高尿酸血癥大鼠ABCG2、URAT1、GLUT9 mRNA表達的影響

2.4 利清通方對高尿酸血癥大鼠血清XOD、ADA含量的影響

與空白組相比，模型組XOD、ADA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，利清通方低、中、高劑量組XOD含量降低(P<0.05)，別嘌呤醇組和利清通方高劑量組ADA含量降低(P<0.05)，利清通方中劑量組有降低趨勢。見表4。

表4 利清通方對高尿酸血癥大鼠血清XOD、ADA的影響

2.5 利清通方對高尿酸血癥大鼠腎臟組織ABCG2、URAT1蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組ABCG2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，URAT1蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，利清通方高劑量組ABCG2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，別嘌呤醇組、利清通方低、中、高劑量組URAT1蛋白表達量降低(P<0.05)。見圖1，表5。

注：A 空白組；B 模型組；C 利清通方低劑量組；D 利清通方中劑量組；E 利清通方高劑量組；F 別嘌呤醇組

表5 利清通方對高尿酸血癥大鼠腎臟組織ABCG2、URAT1蛋白表達的影響

3 討論

利清通方基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床用藥經(jīng)驗進行配伍，配方中土茯苓、車前子和川牛膝為常用中藥，茯苓、菊苣和葛根屬于藥食兩用中藥，每日用量僅為15 g，安全性高且用量小，可用于高尿酸血癥的干預(yù)。方中土茯苓、車前子和菊苣清熱利濕通淋以祛邪，可通過減少尿酸生成發(fā)揮降血尿酸作用[4-6]；茯苓、葛根和川牛膝健脾補腎以扶正，且均可通過增加尿酸排泄達到降血尿酸的效果[7-9]。本研究針對該中藥復(fù)方抑制高尿酸血癥作用進行研究并對其作用機制進行探討。

高尿酸血癥模型常通過以下3種途徑單獨或組合建立：抑制尿酸分解酶作用、增加尿酸來源和抑制尿酸排泄。其中通過氧嗪酸鉀抑制尿酸分解酶作用是目前使用最廣泛的高尿酸血癥模型制備方法[10]。崔博等[11]采用連續(xù)6周灌胃750 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀的方法建立高尿酸血癥模型，結(jié)果顯示SUA水平穩(wěn)定增高，且并未對腎臟造成損傷。陳健文等[12]通過連續(xù)30天灌胃1 500 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型，造模結(jié)束后大鼠腎組織出現(xiàn)局部炎癥等輕度病理改變。梁山泉等[13]采用50 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀聯(lián)合250 mg/(kg·d)腺嘌呤灌胃28天造成高尿酸血癥模型，造模結(jié)束后大鼠腎小管間質(zhì)可見尿酸鹽結(jié)晶出現(xiàn)。本研究在文獻[11]基礎(chǔ)上適當(dāng)減少造模天數(shù)，采用連續(xù)30天灌胃750 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥大鼠模型的方法，結(jié)果表明造模成功，與文獻研究一致。本實驗利清通方能夠降低大鼠血清尿酸含量，表明利清通方能夠明顯抑制高尿酸血癥。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，尿酸異常升高主要由尿酸產(chǎn)生過多或尿酸排泄減少導(dǎo)致[14]。一方面，尿酸產(chǎn)生過多與調(diào)控尿酸生成的關(guān)鍵酶XOD和ADA活性增強有關(guān)[15]。在尿酸生成過程中，XOD和ADA是將嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的限速酶[16]。XOD和ADA活性變強，會加快機體嘌呤代謝，將次黃嘌呤和黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸[17-18]。因此，抑制XOD和ADA活性可有效控制尿酸水平。研究結(jié)果表明利清通方能夠通過抑制尿酸生成限速酶XOD和ADA活性，減少尿酸的生成，提示利清通方能夠抑制尿酸生成發(fā)揮降血尿酸作用。另一方面，在正常的機體中，70%的尿酸由腎臟排出[19]，尿酸排泄減少多與腎臟尿酸轉(zhuǎn)運功能障礙相關(guān)[20]。ABCG2、URAT1和GLUT9三種轉(zhuǎn)運體是直接參與尿酸轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)，通常被認(rèn)為是對血清尿酸穩(wěn)態(tài)最有影響的調(diào)節(jié)因子[21-23]。ABCG2是尿酸分泌蛋白，可將尿酸分泌入尿排出體外，在尿酸排泄過程中起到正向作用[24-25]。URAT1和GLUT9是尿酸重吸收轉(zhuǎn)運蛋白，兩者共同對尿酸進行重吸收，使尿酸再次回到血液，在尿酸排泄過程中起到負向作用[26]。本研究結(jié)果提示利清通方既能夠上調(diào)腎臟組織中ABCG2蛋白表達，又能下調(diào)URAT1和GLUT9蛋白表達，增加尿酸分泌，減少尿酸重吸收，從而促進尿酸排泄，最終降低血尿酸水平。這表明利清通方不僅能夠抑制尿酸生成，還可促進尿酸排泄發(fā)揮作用。

綜上，本實驗選擇研究豐富的高尿酸血癥動物模型研究利清通方降血尿酸作用，并對其機制進行探討，為其更廣泛的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。但利清通方作為中藥復(fù)方，由于其含多成分以及作用多靶點的特點，仍需從中醫(yī)功效角度開展研究，進一步闡明其清利濕熱的作用機制。