彭利君 方婷婷 蔡龍

當(dāng)前，結(jié)核病(tuberculosis，TB)仍然是嚴(yán)重危害人類健康的重大傳染病，特別是新型冠狀病毒肺炎的全球大流行給全球TB的防控帶來了新的挑戰(zhàn)[1-2]。據(jù)估計(jì)約有40%的TB患者由于診斷率過低而未能及時(shí)確診和報(bào)告[3]。因此，TB的快速診斷對(duì)于患者早診斷、早治療、臨床預(yù)后和傳播極為重要。結(jié)核分枝桿菌循環(huán)游離DNA(Mycobacteriumtuberculosiscirculating free DNA，MTB-cfDNA)可表明病原體的存在，是TB診斷和治療監(jiān)測(cè)有吸引力的生物標(biāo)志物。本文將對(duì)血液、尿液及胸、腹腔積液和腦脊液標(biāo)本的檢測(cè)現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，綜合評(píng)價(jià)MTB-cfDNA對(duì)TB的診斷效果，并對(duì)基于cfDNA的TB檢測(cè)開發(fā)的主要挑戰(zhàn)進(jìn)行總結(jié)。

一、常用TB檢測(cè)方法和新的cfDNA檢測(cè)

分枝桿菌培養(yǎng)是TB診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測(cè)周期較長(zhǎng)；痰涂片顯微鏡檢查和血清結(jié)核抗體便宜、簡(jiǎn)單、快速，且后者生物風(fēng)險(xiǎn)低，但兩者敏感性均較低；γ-干擾素釋放試驗(yàn)的敏感度和特異度良好，但結(jié)果易受宿主年齡、疾病和免疫狀態(tài)的影響，也不能確定是否為活動(dòng)性TB[4]。而尚處于研究階段的血清蛋白檢測(cè)因與其他慢性肺部疾病有重疊，缺乏診斷特異性，通常需要檢測(cè)一組蛋白才能進(jìn)行結(jié)核病診斷[5-6]。近年來，已經(jīng)開發(fā)了較多針對(duì)MTB基因組DNA的快速分子檢測(cè)方法，例如實(shí)時(shí)定量PCR，以及世界衛(wèi)生組織認(rèn)可的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、GeneXpert MTB/RIF和Xpert Ultra等[7-8]。然而，這些方法通常檢測(cè)痰液等呼吸道標(biāo)本，對(duì)難以提供痰液的肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)患者(如兒童、長(zhǎng)期臥床等咳痰困難患者)和通常需要侵入性活檢的非呼吸道標(biāo)本的肺外結(jié)核(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)患者的適用性有限，而現(xiàn)有的診斷方法并未針對(duì)這些樣本進(jìn)行優(yōu)化。

cfDNA也被稱為細(xì)胞游離DNA(cell-free DNA)或無細(xì)胞DNA，于1948年首次在人類血液中被發(fā)現(xiàn)[9]。cfDNA是存在于人體血液和其他體液的無細(xì)胞部分的核酸片段[10]，即將死亡的人類細(xì)胞和微生物分解時(shí)將cfDNA釋放入血液，隨著血液循環(huán)進(jìn)入體液的各個(gè)組分，可通過PCR或測(cè)序進(jìn)行分析。cfDNA的特征和數(shù)量可在不同的生理和疾病條件下發(fā)生改變，這可能是由于宿主細(xì)胞在惡性腫瘤、生理狀態(tài)(如妊娠)和存在傳染源(如病毒、細(xì)菌或寄生蟲)等情況下的過度損傷或更替導(dǎo)致[9]。cfDNA在癌癥檢測(cè)[11-13]、器官移植監(jiān)測(cè)[14]、產(chǎn)前基因篩查[15]等方面的應(yīng)用已較為成熟，如早在1999年就有使用cfDNA檢測(cè)EB病毒篩查鼻咽癌的報(bào)道[16]，在診斷侵襲性真菌[17]、寄生蟲和HIV等感染方面也有報(bào)道[10, 18-19]。對(duì)于TB診斷，cfDNA是一種很有潛力的生物標(biāo)志物，在胸腔積液、腹腔積液和腦脊液等體液樣本中檢測(cè)MTB-cfDNA顯示出比GeneXpert MTB/RIF等基因組DNA更高的TB診斷準(zhǔn)確度[20-27]，而血液和尿液中檢測(cè)MTB-cfDNA適用于任何年齡組患者，尤其是無痰的PTB患者和EPTB患者。

二、血液標(biāo)本的MTB-cfDNA檢測(cè)

血液cfDNA診斷TB的敏感度在不同的研究中差異較大，介于27%～100%之間[28-34]，可能與多個(gè)原因相關(guān)。其一，MTB-cfDNA在血液中含量甚微，易受血液中含量較高的核酸(包括DNA、rRNA、mRNA等)、蛋白質(zhì)及其他物質(zhì)的影響，使目標(biāo)核酸提取不足[28, 30]。其二，檢測(cè)靶標(biāo)和檢測(cè)方法不一致也可能是一個(gè)原因。從以往的研究來看，以IS6110為靶標(biāo)能獲得更好的檢測(cè)敏感度和特異度，相對(duì)于其他檢測(cè)方法數(shù)字PCR的檢測(cè)結(jié)果更好(表1)。2021年P(guān)an等[33]的前瞻性研究證實(shí)，在2名結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者的血液中檢出MTB-cfDNA，這提示血液中MTB-cfDNA的檢測(cè)可用于篩查L(zhǎng)TBI者，但需要更大規(guī)模的隊(duì)列研究或使用更敏感的方法來評(píng)估其在該人群中的應(yīng)用價(jià)值。

三、尿液標(biāo)本的MTB-cfDNA檢測(cè)

70%以上的血漿cfDNA小于300 bp，峰值長(zhǎng)度為160～167 bp[35-37]，這將允許其穿過腎小球屏障進(jìn)入尿液中，且尿液中的MTB-cfDNA平均片段長(zhǎng)度(19～52 bp)明顯短于人基因組cfDNA(42～92 bp)[38]。尿液MTB-cfDNA診斷TB的敏感度和特異度分別為43%～83.7%和89%～100%的范圍內(nèi)[39-43]，且檢測(cè)的敏感度隨著擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度的減少而增加[40]。但不同的提取方法在捕獲尿液中短、微量cfDNA的能力上存在較大差異[37]，其中Oreskovic和Lutz[40]、Oreskovic等[41]開發(fā)的一種超靈敏探針雜交方法表現(xiàn)優(yōu)異。該方法使用固定在磁珠上的序列特異性寡核苷酸捕獲探針來提取10 ml尿液樣本中的MTB-cfDNA，有效捕獲和擴(kuò)增短至25 bp的片段，檢測(cè)限可達(dá)0.5 copies/ml，敏感度和特異度分別達(dá)到了83.7%和100%。

與傳統(tǒng)的PTB診斷標(biāo)本類型相比較，尿液是一種易于收集、樣本量大、生物安全風(fēng)險(xiǎn)低的樣本，從尿液中檢出MTB可能可以發(fā)現(xiàn)許多未得到充分檢測(cè)的TB人群，尤其是那些細(xì)菌載量低的人群，包括兒童和患有EPTB的人群，尿液cfDNA是十分有潛力的MTB診斷生物標(biāo)志物。但由于尿液中MTB-cfDNA 的片段短，應(yīng)該更加關(guān)注cfDNA的富集和提取，因此，設(shè)計(jì)針對(duì)超短片段的樣本制備和擴(kuò)增方法至關(guān)重要。

四、胸、腹腔積液和腦脊液標(biāo)本的MTB-cfDNA檢測(cè)

胸、腹腔積液和腦脊液cfDNA診斷TB的敏感度為53%～100%，特異度為96%～100%[20-22]，其敏感度高于培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF約2～4倍，可能由以下兩個(gè)原因造成：首先，胸、腹腔積液和腦脊液處于相對(duì)封閉的環(huán)境，大部分MTB被體內(nèi)免疫細(xì)胞吞噬后，經(jīng)溶酶體降解釋放出大量的cfDNA，由于胸膜和腹膜都有半透膜特性，cfDNA不易透過，使得cfDNA濃度較高；而GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)的是沉淀中完整菌體的基因組DNA，相對(duì)MTB-cfDNA而言濃度更低，這可能是其敏感度低于MTB-cfDNA檢測(cè)的主要原因[21-24]。其次，GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)的是RNA聚合酶rpoB基因的81 bp耐藥決定區(qū)的單拷貝基因，而MTB-cfDNA 檢測(cè)的是MTB特異性多拷貝重復(fù)插入序列IS6110。Haldar等[24-25]研究表明，結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液的沉淀物檢測(cè)MTB的敏感度較濾液低2～3倍，提示濾液較沉淀物是更好的診斷疑似結(jié)核性腦膜炎的分子檢測(cè)樣本。

五、綜合評(píng)價(jià)MTB-cfDNA對(duì)TB的診斷效能

考慮到是世界衛(wèi)生組織發(fā)布的目標(biāo)產(chǎn)品的特性，推薦非痰標(biāo)本生物標(biāo)志物檢測(cè)的最低可接受敏感度和特異度分別為65%和98%、最佳敏感度和特異度分別為80%和98%[44]，依據(jù)目前研究的性能結(jié)果，MTB-cfDNA未來極有可能成為TB檢測(cè)主要的生物標(biāo)志物。表1總結(jié)了國(guó)內(nèi)外MTB-cfDNA診斷TB研究的性能評(píng)估，數(shù)據(jù)顯示不同樣本類型的MTB-cfDNA診斷敏感度不同，用途也可能不同。對(duì)于獲得呼吸道樣本有困難的人群，檢測(cè)其尿液和血液的MTB-cfDNA會(huì)更有優(yōu)勢(shì)，預(yù)測(cè)未來尿液樣本的cfDNA檢測(cè)有可能用于常規(guī)TB篩查，而血液cfDNA檢測(cè)有可能在LTBI篩查方面有所突破；另外，相比于GeneXpert MTB/RIF等基因組DNA診斷TB，檢測(cè)胸、腹腔積液和腦脊液的cfDNA 看起來是更好的選擇。

六、開發(fā)基于cfDNA診斷TB檢測(cè)方法的主要挑戰(zhàn)

cfDNA廣泛用于臨床需要進(jìn)一步提高其敏感度，面臨的挑戰(zhàn)主要包括以下幾個(gè)方面：

1.標(biāo)準(zhǔn)化的前處理程序：體液中的cfDNA濃度較低，當(dāng)進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，其效率主要取決于分離方法的質(zhì)量控制和穩(wěn)健性。進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚?即在擴(kuò)增和檢測(cè)步驟之前進(jìn)行樣品處理)是提高檢測(cè)敏感度的關(guān)鍵點(diǎn)之一[45]。cfDNA的前處理程序包括：樣品采集(采集多大樣本量、使用何種收集管)、樣品儲(chǔ)存(防腐劑)、cfDNA 提取(最佳的提取試劑盒/方法)及其提取物的儲(chǔ)存(-20 ℃和-80 ℃可以儲(chǔ)存多長(zhǎng)時(shí)間)。

表1 國(guó)內(nèi)外結(jié)核分枝桿菌cfDNA診斷結(jié)核病的性能評(píng)估

樣本離心取上清或用0.22 μm濾膜過濾的前處理步驟可以避免提取到沉淀中的基因組DNA稀釋cfDNA。目前市售的提取試劑盒對(duì)MTB-cfDNA的提取都是非特異性的，參考Oreskovic和Lutz[40]、Oreskovic等[41]開發(fā)的特異捕獲病原cfDNA的核酸富集方式，為提高以cfDNA為靶標(biāo)診斷其他疾病的敏感度提供了新的思路。Murugesan等[46]對(duì)影響血液和尿液中病原體cfDNA分析前的變量的研究表明，對(duì)于血液標(biāo)本最好使用K2EDTA抗凝的采血管，而尿液標(biāo)本最好使用Tris-EDTA作為防腐劑。使用防腐劑后血液和尿液標(biāo)本可以在室溫下延遲處理24 h。在-80 ℃保存24周后，新鮮和解凍血漿與尿液間沒有觀察到顯著差異，且使用更大的樣本量能獲得更多cfDNA。EI Messaoudi等[45]建議血液樣本進(jìn)行兩次離心，而Murugesand等[46]發(fā)現(xiàn)兩次離心(第一次500×g、第二次16 000×g)會(huì)使血液樣本的cfDNA濃度下降，這可能是由于第二次離心力過大導(dǎo)致白細(xì)胞基因組DNA釋放，降低cfDNA的比例，造成cfDNA被稀釋。這些發(fā)現(xiàn)表明，使用防腐劑后延遲24 h處理大容量單次離心的K2EDTA血漿和Tris-EDTA尿液可能會(huì)優(yōu)化cfDNA檢測(cè)。此外，也需要MTB-cfDNA標(biāo)準(zhǔn)品作為質(zhì)量控制，以驗(yàn)證cfDNA不同的檢測(cè)方法，最終實(shí)現(xiàn)以檢測(cè)體液MTB-cfDNA 濃度來進(jìn)行臨床診斷和治療監(jiān)測(cè)。

2.需要大規(guī)模的臨床驗(yàn)證：從患者數(shù)量來看，既往研究的患者數(shù)量不多，需要更大規(guī)模的隊(duì)列研究進(jìn)行臨床驗(yàn)證來評(píng)估MTB-cfDNA在TB中的應(yīng)用價(jià)值。從研究人群來看，在特定人群中的研究，特別是基于MTB-cfDNA的HIV感染者診斷的研究數(shù)量有限，針對(duì)兒科患者的研究更是極少。對(duì)于這些難以留取痰液的人群，更適合檢測(cè)體液中MTB-cfDNA進(jìn)行診斷，因此更需要進(jìn)行大規(guī)模的臨床驗(yàn)證。

七、展望

由于新型冠狀病毒肺炎的大流行，我國(guó)的集中檢測(cè)能力有所提高，未來TB的快速分子篩查可能受益于這些進(jìn)步。cfDNA可以識(shí)別身體任何部位的結(jié)核感染，并有可能檢測(cè)出目前傳統(tǒng)微生物學(xué)方法無法識(shí)別的疾病狀態(tài)(如LTBI)。除了檢測(cè)MTB外，分析cfDNA還可以使我們更深入地了解其遺傳特征[47]，如耐藥基因等，以指導(dǎo)臨床用藥。但值得注意的是，病原體cfDNA不如基因組DNA穩(wěn)定，尤其在患者治療后，其體內(nèi)病原體cfDNA會(huì)很快被免疫細(xì)胞清除[43]，若仍可檢測(cè)到MTB-cfDNA，則很可能是新釋放到體液循環(huán)中的MTB，故認(rèn)為檢測(cè)MTB-cfDNA可用于反映當(dāng)前的疾病狀況，對(duì)治療有監(jiān)測(cè)作用。

總之，cfDNA作為TB診斷生物標(biāo)志物的研究仍處于起步階段，未來需要更大型、納入患者類型更全面的臨床研究來評(píng)估其效用。隨著檢測(cè)cfDNA方法的進(jìn)一步優(yōu)化，其敏感度和特異度將進(jìn)一步提高，有助于改善TB診斷，并很可能使其成為“游戲規(guī)則的改變者”。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)彭利君：文章撰寫和修改；方婷婷：文獻(xiàn)查找；蔡龍：文章修改和審閱