尹為治，李佳靈，2，黃良鴻，方正

1.海南熱帶雨林國家公園管理局五指山分局，海南五指山 572299；2.海南大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，海南?？?570228

密碼子不均衡使用的特性，被稱為密碼子使用偏性，所有已知物種的基因組都存在密碼子偏好性，但偏好性各不相同[1]。對(duì)密碼子使用偏性的研究有助于理解環(huán)境適應(yīng)的分子機(jī)制、探討物種間的親緣關(guān)系[2]。目前，竹亞科[2]、槲蕨屬[3]、柿屬[4]、大戟科[5]等許多研究證實(shí)了密碼子使用偏性對(duì)植物葉綠體基因組水平的適用性。

葉綠體基因組功能與光合作用聯(lián)系密切[6]，且具有基因組小，攜帶遺傳信息多，在分子水平上差異大等特點(diǎn)[7]。被廣泛應(yīng)用于植物的物種鑒定[8-9]、遺傳多樣性分析[10]、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[11]等方面的研究。目前，有兩千多種植物的葉綠體基因組已被測序，并在NCBI 發(fā)表。其中，包含了廣南天料木(Homalium paniculiflorum)[12]、斯里蘭卡天料木(Homalium ceylanicum)[12]、狹葉天料木 (Homalium stenophyllum)[12]、天料木(Homalium cochinchinense)[13]等天料木屬植物的葉綠體基因組序列。

天料木屬植物屬于大風(fēng)子科，中國有12 種和3個(gè)變種，主要分布于海南、廣東、廣西、云南等省的低海拔雨林中[14]。海南省原記載有7 種[15]。該屬植物除較高的觀賞和材用價(jià)值外，根、莖、葉等部位均有較高的藥用價(jià)值[16-18]。近年來，天料木屬植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)不斷增加。目前在密碼子水平上對(duì)天料木屬植物的葉綠體分子進(jìn)化分析尚未報(bào)道。該文以NCBI 中登錄的廣南天料木、斯里蘭卡天料木、狹葉天料木、天料木的葉綠體基因組為研究對(duì)象，揭示天料木屬植物葉綠體基因組密碼子偏性之間的差異、進(jìn)化關(guān)系等，同時(shí)為更深入研究和應(yīng)用提供支持。

1 數(shù)據(jù)來源與研究方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

在NCBI 數(shù)據(jù)庫獲取廣南天料木、斯里蘭卡天料木、狹葉天料木、天料木的葉綠體基因組序列，登錄號(hào)分別為：NC_045233、NC_045235、NC_045234、NC_045919。為避免抽樣誤差，篩選CDS(Coding sequence) 中序列長度≥300bp，以ATG 起始，TAA、TAG、TGA 終止，且序列中間不存在終止密碼子的序列，排除重復(fù)序列[19]。分別獲得了51、51、52、51 條CDS。

1.2 研究方法

將獲得的CDS 的運(yùn)用codonW1.4.2 分析軟件計(jì)算ENC、CAI 及RSCU 等數(shù)值，運(yùn)用Bioinformatics.org 的SMS(Sequence Manipulation Suite)在線工具箱計(jì)算密碼子第1 位(GC1)、第2 位(GC2)、第3 位(GC3)點(diǎn)的GC 含量。分析時(shí)排除三個(gè)終止密碼子及無偏性的蛋氨酸ATG、色氨酸TGG。運(yùn)用R 語言和SPSS22 等軟件分析制圖。

1.2.1 中性繪圖分析

根據(jù)曲線回歸的斜率分析影響密碼子偏性的主要因素，當(dāng)斜率為零時(shí)，表示偏性不受定向突變壓力的影響，而完全受選擇性限制。斜率為1 時(shí)，表示密碼子使用偏性完全受定向突變壓力的影響[5]。取第1位堿基與第2 位堿基平均值GC12 和GC3 為縱橫坐標(biāo)作散點(diǎn)圖。

1.2.2 PR2 繪圖分析

PR2 分析(Parity Rule 2)用來研究密碼子第3 位堿基A 與T 和C 與G 之間是否有突變不平衡現(xiàn)象[20]。分析時(shí)僅選取具有4 個(gè)同義密碼子的氨基酸，其中絲氨酸只取TCA、TCC、TCG、TCT，亮氨酸只取CTA、CTC、CTG、CTT、精氨酸只取CGA、CGC、CGG、CGT，以G3/(G3+C3)|4、A3/(A3+T3)|4 作橫縱坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖[21]。

1.2.3 ENc 繪圖分析

ENc 值(effective number of codons)解釋密碼子使用偏離隨機(jī)選擇的程度，ENC 值的范圍在20～61 之間，越靠近20 偏性越強(qiáng)[22]。以ENc 值和GC3值為縱、橫坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，與ENc 期望值曲線{ENc期望值=2+GC3+29/(GC32+(1-GC3)2)}進(jìn)行比較[21]。當(dāng)突變壓力對(duì)密碼子使用模式起重要作用時(shí)，ENc 值位于期望曲線上或圍繞期望曲線。當(dāng)自然選擇和其他因素的影響密碼子偏性時(shí)，ENc 值遠(yuǎn)低于預(yù)期曲線[23]。

1.2.4 對(duì)應(yīng)性分析

對(duì)應(yīng)性分析用來描述對(duì)密碼子偏性的潛在影響[24]。分析時(shí)排除無密碼子偏性的ATG、TGG 和終止密碼子。基于各基因密碼子的RSCU 值(59 個(gè))進(jìn)行分析。將第1 軸(axis1)和第2 軸(axis2)作為橫、縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖，并將第1 軸與密碼子第3 位堿基(GC3)、密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)、氨基酸總量(L_aa)等數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析。

1.2.5 RSCU 分析

RSCU(相對(duì)同義密碼子使用度)是該密碼子的實(shí)際觀察值與理論觀察值之間的比值，如果RSCU=1，表示密碼子使用無偏差，RSCU 值＞1 時(shí)，密碼子使用存在正偏差，使用頻率高于其他密碼子。相反，RSCU值＜1 顯示負(fù)偏差，使用頻率低于其他密碼子[25]。參照薛慶中[26]與尚明照[21]等的研究方法，以ENC 為偏性標(biāo)準(zhǔn)，兩極各選10%的基因，分別建成高低偏性庫，取兩庫△RSCU＞0.08 的密碼子為高表達(dá)密碼子，同時(shí)滿足葉綠體基因組RSCU 值＞1 的為最優(yōu)密碼子。

1.2.6 基于RSCU 聚類

天料木屬植物與海南大風(fēng)子(Hydnocarpus hainanensis) ( 登 錄 號(hào)：NC_042720)、 山 桂 花(Bennettiodendron leprosipes)(登錄號(hào)：NC_045898)、短柄山桂花(Bennettiodendron brevipes)(登錄號(hào)：NC_043885)、大葉刺籬木(Flacourtia rukam)(登錄號(hào)：NC_045859)、山桐子(Idesia polycarpa)(登錄號(hào)：NC_032060)、山羊角樹(Carrierea calycina)(登錄號(hào)：NC_043884)進(jìn)行聚類分析。引入同為山茶亞目的坡壘(Hopea hainanensis)(登錄號(hào)：NC_044642)和青梅(Vatica mangachapoi)(登錄號(hào)：NC_041485) 作為外類群，分析時(shí)選取相同的基因，以同義密碼子RSCU值為變量，采用組間聯(lián)接法(歐式平方距離)進(jìn)行密碼子使用偏好性聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子參數(shù)

天料木屬4 種植物葉綠體基因組密碼子參數(shù)的計(jì)算結(jié)果分析(表1)，可見4 種植物葉綠體基因組的GC1、GC2、GC3 及GCa 值均小于0.5，說明均傾向于使用A/T 堿基。斯里蘭卡天料木、廣南天料木、狹葉天料木的各位點(diǎn)GC 含量及平均GC 含量更為接近，且ENc 值與CAI 值亦然。天料木的各參數(shù)較之其他3 種植物略有不同。統(tǒng)計(jì)得出，斯里蘭卡天料木的ENc 值分別在36.76～56.32 之間、廣南天料木和狹葉天料木的ENc 值均在36.04～56.32 之間，而天料木的ENc 值在37.08～55.09 之間。從ENc 值來看，天料木較其他3 種植物的葉綠體基因密碼子偏性略強(qiáng)。對(duì)竹亞科、槲蕨屬、柿屬、大戟科以及樟樹(Cinnamomum camphora)[27]、 馬 尾 松 (Pinus massoniana)[28]、北美紅杉(Sequoia sempervirens)[29]等多數(shù)文獻(xiàn)的分析結(jié)果，均表明了葉綠體基因組密碼子偏好使用A/T 堿基?？梢?，不論是單子葉植物、雙子葉植物還是裸子植物，普遍偏好使用A/T 堿基。

表1 四種天料木屬植物葉綠體基因組特征Tab.1 Genomic Features of Chloroplast Genomes of Four Homalium Plant Species

2.2 中性繪圖結(jié)果分析

中性繪圖體現(xiàn)出GC12(0.3061～0.5564)和GC3(0.1619～0.3434) 的分布范圍。4 種植物GC12 與GC3 雙尾檢驗(yàn)均呈顯著相關(guān)(p＜0.05)，Pearson 相關(guān)系數(shù)分別為0.3270、0.3300、0.3460、0.3380。GC1與GC2 均表現(xiàn)極顯著正相關(guān)性(p＜0.01),系數(shù)分別為0.4710、0.4280、0.4540、0.4660。GC2 與GC3 均呈顯著正相關(guān) (p ＜0.05)，系數(shù)分別為0.3010、0.2880、0.3230、0.3120。GC1 與GC3 均無顯著相關(guān)性(p＞0.05)。曲線斜率顯示，4 種植物葉綠體基因組密碼子影響因素中，自然選擇等因素占53.36%～56.11%，突變壓力占43.89%～46.64%。大戟科、竹亞科、槲蕨屬、柿屬、陸地棉(Gossypium hirsutum)、樟樹、馬尾松、灰毛漿果楝(Cipadessa cinerascens)等植物的研究結(jié)果：GC12 與GC3 均不顯著相關(guān)，說明天料木屬4 種植物葉綠體基因組密碼子第3 位堿基組成與第1 位堿基、第2 位堿基較之其他植物更為近似，在密碼子偏性影響因素中，突變壓力的作用相對(duì)于其他物種來說影響更大。

圖1 四種天料木屬植物中性繪圖Fig.1 Neutrality Plot of Chloroplast Genomes Four Homalium Plant Species

2.3 ENc 繪圖結(jié)果分析

實(shí)際ENc 值與ENc 期望值曲線相比較，繪制ENc 分析圖(圖2)，4 種天料木屬植物葉綠體基因組的ENc 分布極為相似。運(yùn)用(ENc 期望-ENc 實(shí)際)/ENC 期望的公式，統(tǒng)計(jì)基因ENc 的分布組數(shù)(表2)。4 種植物均有超過60%的基因ENc 實(shí)際值位于在曲線上或圍繞在曲線附近，表明突變壓力在多數(shù)基因密碼子使用模式的形成中起重要作用。該結(jié)果與槲蕨屬、陸地棉等植物研究結(jié)果基本一致，與大戟科、樟樹、馬尾松、灰毛漿果楝等植物有較大差異。說明不同物種間葉綠體基因組密碼子偏性存在差異。

圖2 四種天料木屬植物ENc 繪圖Fig.2 Enc Plot of Chloroplast Genomes Four Homalium Plant Species

表2 ENC 比值頻率分布Tab.2 Distribution of Enc Frequency Ratio

2.4 PR2 繪圖結(jié)果分析

PR2 繪圖分析可解釋葉綠體基因組同義密碼子第3 位堿基的使用情況(圖3)。天料木屬4 種植物葉綠體基因組的多數(shù)基因分布在T/C 區(qū)域，嘧啶的使用高于嘌呤，密碼子偏性除了突變壓力因素外，更主要還是受自然選擇等因素的影響。貓眼草(Euphorbia esula)[5]、陸地棉、美麗梧桐(Firmiana pulcherrima)和云南梧桐(Firmiana major)[31]等植物的結(jié)果一致，而同為大戟科的橡膠樹(Hevea brasiliensis)、麻風(fēng)樹(Jatropha curcas)、木薯(Manihot esculenta)[5]等以及灰毛漿果楝[30]等植物則為密碼子第3 位存在T/G 偏倚，再次說明葉綠體基因組密碼子偏性在不同物種間甚至親緣關(guān)系較近的物種間仍然可能存在較大差異。

圖3 四種天料木屬植物PR2 圖Fig.3 PR2-plot of Chloroplast Genomes Four Homalium Plant Species

2.5 對(duì)應(yīng)性結(jié)果分析

基于RSCU 對(duì)4 種天料木屬植物進(jìn)行對(duì)應(yīng)性分析，前4 軸分別表現(xiàn)出35.57%、36.52%、35.76%、35.48%的差異。第1 軸的差異分別為：10.20%、10.20%、9.98%、10.07%，其余各因子軸的差異依次遞減。第1 軸與CAI、L_aa、GC3、ENc 相關(guān)分析結(jié)果表明(表3)，第1 軸與ENc、GC3、L_aa 均不顯著相關(guān)(p＞0.05)，斯里蘭卡天料木第1 軸與CAI 值呈顯著負(fù)相關(guān)(p＜0.05)。而天料木、廣南天料木、狹葉天料木中第1 軸與CAI 值均呈極顯著正相關(guān)(p＜0.01)。推測基因表達(dá)水平相關(guān)因素，對(duì)天料木屬4 種植物葉綠體基因組密碼子偏性影響較大。對(duì)應(yīng)性分析作圖表明(圖4)，多數(shù)基因圍繞原點(diǎn)分布，說明多數(shù)基因偏性較低。光合系統(tǒng)基因、遺傳結(jié)構(gòu)基因分布相對(duì)集中，該部分基因的密碼子使用模式相對(duì)一致。盡管天料木屬4 種植物有著大體相似的密碼子使用模式，但種間基因仍有各自特殊的密碼子使用特征。

圖4 四種天料木屬植物對(duì)應(yīng)性分析Fig.4 Corresponding Analysis of Chloroplast Genomes Four Homalium Plant Species

表3 四種天料木屬第1 軸與密碼子參數(shù)相關(guān)分析Tab.3 Correlation Analysis of Axis1 and Codon Usage Index of Chloroplast Genomes Four Homalium Plant Species

2.6 RSCU 結(jié)果分析

排除無密碼子偏性的ATG、TGG 和終止密碼子后，對(duì)葉綠體基因組RSCU 和高低表達(dá)庫RSCU 差值ΔRSCU 分析得到(表4)，4 種天料木屬植物RSCU＞1具有29 個(gè)相同的密碼子，其中以A/T 結(jié)尾有28 個(gè)密碼子，RSCU＜1 的有30 個(gè)相同的密碼子，其中以G/C 結(jié)尾有28 個(gè)。說明以A/T 結(jié)尾的密碼子存在較強(qiáng)正偏差，使用頻率較高。對(duì)ΔRSCU 值分析可知，4種植物均有13 個(gè)相同的最優(yōu)密碼子：UUU、UUA、UUG、AUU、GUA、CCU、ACU、GCU、CAA、AAA、GAA、UGU、GGU，但天料木多具有4 個(gè)最優(yōu)密碼子：GUU、UCU、CCA、AGU。其中12 個(gè)共同的最優(yōu)密碼子以A/T 結(jié)尾。

表4 四種天料木屬植物葉綠體基因組氨基酸相對(duì)同義密碼子使用度Tab.4 The RSCU of Chloroplast Genomes Four Homalium Plant Species

密碼子 狹葉天料木斯里蘭卡天料木廣南天料木天料木RSCU ΔRSCU RSCU ΔRSCU RSCU ΔRSCU RSCU ΔRSCU AUU AUC AUA GUU GUC GUA GUG UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG UAU UAC CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG UGU UGC CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG 1.52 0.54 0.94 1.46 0.50 1.48 0.56 1.68 0.95 1.22 0.51 1.60 0.76 1.14 0.51 1.60 0.75 1.27 0.38 1.81 0.62 1.12 0.46 1.65 0.35 1.50 0.50 1.56 0.44 1.55 0.45 1.53 0.47 1.57 0.43 1.52 0.48 1.42 0.58 1.35 0.44 1.35 0.36 1.27 0.37 1.85 0.64 1.28 0.47 1.56 0.69 0.53-0.20-0.32-0.27 0.03 0.91-0.67 0.00-0.19-0.30-0.39 0.63-0.38-0.08-0.17 0.87-0.15-0.46-0.26 0.56-0.24-0.40 0.09-0.22 0.22-0.28 0.28 0.36-0.36-0.27 0.27 0.34-0.34 0.00 0.00 0.28-0.28 0.71-0.71 1.89-0.29-0.18-0.29 0.77 0.09-0.57-0.57 0.84 0.07-0.27-0.64 1.52 0.54 0.94 1.46 0.50 1.49 0.55 1.67 0.96 1.22 0.51 1.60 0.77 1.13 0.51 1.60 0.74 1.28 0.38 1.80 0.62 1.11 0.47 1.65 0.35 1.50 0.50 1.57 0.43 1.56 0.44 1.54 0.46 1.57 0.43 1.52 0.48 1.42 0.58 1.36 0.45 1.33 0.36 1.27 0.37 1.87 0.63 1.28 0.48 1.55 0.68 0.52-0.22-0.3-0.21-0.03 0.91-0.67-0.03-0.10-0.30-0.40 0.50-0.35-0.02-0.14 0.79-0.09-0.44-0.27 0.59-0.30-0.39 0.09-0.18 0.18-0.29 0.29 0.34-0.34-0.27 0.27 0.34-0.34-0.02 0.02 0.28-0.28 0.67-0.67 1.89-0.32-0.17-0.29 0.76 0.08-0.56-0.56 0.79 0.06-0.25-0.60 1.52 0.54 0.94 1.46 0.50 1.49 0.56 1.68 0.95 1.22 0.51 1.59 0.77 1.13 0.51 1.60 0.74 1.28 0.38 1.81 0.62 1.11 0.47 1.65 0.35 1.50 0.50 1.57 0.43 1.56 0.44 1.54 0.46 1.57 0.43 1.52 0.48 1.42 0.58 1.35 0.45 1.35 0.36 1.27 0.37 1.86 0.63 1.28 0.48 1.55 0.69 0.57-0.25-0.32-0.27-0.03 0.97-0.67-0.03-0.10-0.30-0.40 0.54-0.33-0.07-0.13 0.79-0.09-0.44-0.27 0.59-0.30-0.39 0.09-0.18 0.18-0.29 0.29 0.34-0.34-0.27 0.27 0.34-0.34-0.02 0.02 0.28-0.28 0.67-0.67 1.89-0.32-0.17-0.29 0.76 0.08-0.56-0.56 0.79 0.06-0.25-0.60 1.50 0.54 0.96 1.47 0.49 1.47 0.57 1.71 0.95 1.22 0.50 1.59 0.74 1.16 0.52 1.60 0.75 1.30 0.35 1.80 0.63 1.12 0.44 1.66 0.34 1.51 0.49 1.57 0.43 1.56 0.44 1.52 0.48 1.57 0.43 1.54 0.46 1.41 0.59 1.31 0.44 1.38 0.37 1.27 0.35 1.86 0.64 1.27 0.46 1.60 0.67 0.47-0.17-0.29 0.12-0.27 0.78-0.65 0.36-0.18-0.11-0.52 0.42-0.46 0.12-0.08 0.72-0.02-0.24-0.46 0.34-0.21-0.08-0.05-0.24 0.24-0.14 0.14 0.39-0.39-0.17 0.17 0.37-0.37-0.01 0.01 0.25-0.25 0.71-0.71 1.17-0.04-0.10-0.36 0.22 0.23-0.15-0.52 0.86-0.08-0.18-0.61

2.7 基于RSCU 聚類分析

比較葉綠體基因組序列可以揭示近緣物種類群之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，同時(shí)闡明植物的進(jìn)化模式[32]?；谔炝夏緦? 種植物、大風(fēng)子科其他6 種植物以及2 種外類群植物RSCU 值的聚類結(jié)果顯示(圖5)，斯里蘭卡天料木、廣南天料木和狹葉天料木距離最近，天料木與其他天料木屬植物距離較遠(yuǎn)。天料木屬植物、山桐子等4 種植物和大葉刺籬木聚為亞類，海南大風(fēng)子與天料木等9 種植物聚為大類，坡壘、青梅組成另一大類。該聚類分析結(jié)果同植物親緣關(guān)系基本一致。小麥等11 種植物psbA 基因[33]的分析得出，基于RSCU 的聚類并不能反映出植物之間的親緣關(guān)系。但樟樹、馬尾松、小麥等7 種植物[34]以及水稻等9 種植物waxy 基因聚類分析[35]等結(jié)果與該研究一致。這可能是因?yàn)檠芯繉?duì)象及統(tǒng)計(jì)方法的差異造成，但基于RSCU 的聚類仍能反映多數(shù)參考植物的親緣關(guān)系?？梢酝茢啵估锾m卡天料木、廣南天料木和狹葉天料木葉綠體基因組具有極為相似的密碼子偏性模式，而天料木略有不同。其他植物隨聚類距離增大，而密碼子偏性差異也隨之增大。

圖5 四種天料木屬植物基于RSCU 的聚類分析Fig.5 Cluster Tree Based on the Rscu of Chloroplast Genomes Four Homalium Plant Species

3 結(jié)論

天料木屬4 種植物葉綠體基因組各密碼子參數(shù)基本一致，且都偏好使用A/T 堿基，但天料木葉綠體基因組密碼子偏性略強(qiáng)于其他3 種植物。結(jié)合上述分析結(jié)果，突變壓力對(duì)天料木屬4 種植物葉綠體基因組密碼子偏性的影響較之其他參考物種影響更大，但自然選擇等因素對(duì)其仍發(fā)揮著主要作用。天料木屬4 種植物葉綠體基因組密碼子第3 位堿基偏好使用嘧啶(T/C)。對(duì)應(yīng)性分析得出，基因表達(dá)水平在天料木屬4 種植物葉綠體基因組密碼子偏性中影響較大，再一次證明自然選擇在密碼子偏性形成中起主要作用。光合系統(tǒng)基因和遺傳結(jié)構(gòu)基因的密碼子使用模式相對(duì)一致。通過RSCU 分析，天料木屬4 種植物葉綠體基因組以A/T 結(jié)尾的密碼子使用頻率較高。同時(shí)，確定了天料木屬4 種植物13 個(gè)相同的 最 優(yōu) 密 碼 子：UUU、UUA、UUG、AUU、GUA、CCU、ACU、GCU、CAA、AAA、GAA、UGU、GGU，天料木多具有的4 個(gè)最優(yōu)密碼子GUU、UCU、CCA、AGU。最優(yōu)密碼子多以A/T結(jié)尾?；赗SCU 值的聚類結(jié)果表明，斯里蘭卡天料木、廣南天料木和狹葉天料木葉綠體基因組密碼子偏性特征極為相似，而天料木與它們略有不同。該研究揭示了天料木屬4 種植物葉綠體基因組密碼子偏性特征、影響因素之間的比重以及與大風(fēng)子科其他植物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，增加了植物葉綠體基因組密碼子使用模式的了解，為其他大風(fēng)子科植物系統(tǒng)發(fā)育分析提供了補(bǔ)充。