王五權(quán)，范東升，李昊熙，孔菲，桑維鈞，彭麗娟，盧燕回，楊茂發(fā)

（1.中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司 南寧市 530022；2．貴州大學(xué)煙草學(xué)院 貴陽市 550025）

烤煙是我國重要的經(jīng)濟作物，其創(chuàng)造的巨大經(jīng)濟效益是各級地方財政和煙農(nóng)增收的重要來源，在鄉(xiāng)村振興過程中具有重要作用。廣西壯族自治區(qū)位于珠江上游的華南亞熱帶山地丘陵地帶，氣候溫暖，光照充足，非常適合烤煙的生產(chǎn)，東北部的賀州市、北部的河池市和西部的百色市是廣西主要的烤煙生產(chǎn)區(qū)，長期為工業(yè)企業(yè)提供大量優(yōu)質(zhì)的煙葉產(chǎn)品。但是，普通花葉病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）是當?shù)乜緹熒a(chǎn)的主要威脅之一，不僅嚴重制約廣西烤煙產(chǎn)量，還直接影響了后續(xù)的烘烤調(diào)制過程，降低了煙葉產(chǎn)品的質(zhì)量和分級，使企業(yè)和煙農(nóng)蒙受了巨大經(jīng)濟損失[1]。

普通花葉病毒是一種正義單鏈核糖核酸（+ss-RNA）植物病毒，能夠通過機械傳播的途徑侵染烤煙和其他多種農(nóng)作物[2]。在上世紀90年代初廣西煙區(qū)開展的普查工作中，賀州市和百色市煙區(qū)就發(fā)現(xiàn)TMV嚴重發(fā)生[3]，但在當時還不是廣西烤煙的主要病毒病害[4]。到了本世紀初，TMV已經(jīng)成為廣西煙區(qū)分布最廣、危害最大的病毒病害[5]。經(jīng)過分子生物學(xué)和血清學(xué)的檢測，TMV是廣西煙區(qū)賀州市、百色市和河池市危害烤煙生產(chǎn)的優(yōu)勢病毒[6]。在后續(xù)賀州市開展的病毒病檢測工作中，富川瑤族自治縣和鐘山縣等烤煙產(chǎn)區(qū)利用血清學(xué)抗體，得到了TMV超過50%的檢出率[7]。所以，掌握廣西烤煙TMV的發(fā)生規(guī)律，對于綠色防控措施的開展有著重要的指導(dǎo)作用。

外殼蛋白是TMV病毒粒子同外界寄主植物和環(huán)境條件接觸的關(guān)鍵成分，編碼外殼蛋白的基因也是TMV基因組的重要區(qū)域[8]。外殼蛋白基因序列的多樣性在很大程度上體現(xiàn)了病毒的多樣性，也在一定程度上解釋了病毒的傳播規(guī)律。通過分析外殼蛋白基因完整序列的多樣性，發(fā)現(xiàn)貴州畢節(jié)煙區(qū)5個地點采集到的TMV具有較高的親緣關(guān)系，并且與煙田周邊同屬茄科的馬鈴薯上采集的TMV存在聯(lián)系[9]；借助小RNA文庫建設(shè)進行的外殼蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明湖南煙區(qū)的TMV具有較高的多樣性，可以劃分為多個類群，并且分別同國內(nèi)外不同地區(qū)的參考序列存在親緣關(guān)系[10]；而關(guān)于廣西煙區(qū)TMV的多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究仍比較缺乏。本研究針對廣西煙區(qū)賀州市、百色市和河池市的烤煙種植區(qū)，以外殼蛋白的完全序列為靶標，借助其他地區(qū)的TMV序列為參考，分析廣西煙區(qū)TMV的多樣性，解釋TMV的發(fā)生規(guī)律，為該種病害的防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 感病毒煙葉樣品

2021年3月上旬至6月下旬，在廣西壯族自治區(qū)的烤煙生長季節(jié)，多次赴賀州市、百色市和河池市的烤煙種植區(qū)開展病毒病等病害的調(diào)查。其中，在煙葉病毒病發(fā)生嚴重的5月和6月的兩次病害調(diào)查中，從富川瑤族自治縣、鐘山縣、靖西市和南丹縣的煙田采集到具有明顯花葉病癥狀的煙葉樣品若干，用自封袋分別保存并做好標記。在鄰近煙田的煙葉站的檢測室，用Agdia?免疫試紙條（北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司）進行煙葉病毒的血清學(xué)檢測，得到感染TMV的煙葉樣品17個，樣品信息如表1所示。將樣品帶回實驗室，以備后續(xù)操作處理。

表1 廣西煙區(qū)17個感染TMV的煙葉樣品編號及采集信息

1.1.2 主要試劑

0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液，日本BBI公司產(chǎn)品；RNeasy? Plant Mini Kit試劑盒，德國Qiagen公司產(chǎn)品；4S Green Plus無毒核酸染料，上海生工生物產(chǎn)品；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；2X SanTaq PCR Master酶，上海生工生物產(chǎn)品；DNA分子量標準（100-1 000 bp），上海生工生物產(chǎn)品。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 總RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄

撕取感染TMV煙葉的葉肉組織一片（重量約為100 mg），在0.1%的DEPC溶液處理過的研缽中用液氮充分碾磨后，迅速將煙葉組織粉末加入處理過的1.5 mL離心管中，用Plant Mini Kit試劑盒進行樣品總RNA的提取。最終RNA產(chǎn)物用試劑盒配套的30μL去RNA酶水溶解。提取過程的操作均在通風櫥中的冰盒上進行，移液器、槍頭和離心機等相關(guān)儀器設(shè)備均用0.1%的DEPC溶液提前處理過。每一個樣品使用不同套的研缽和研杵，避免樣品RNA的交叉污染。取5μL的總RNA樣品在1%的瓊脂糖凝膠（含1/10 000核酸染料）中進行電泳30 min，電泳電壓110V，電泳后的瓊脂糖凝膠在成像儀中觀察所提取RNA的質(zhì)量與降解程度。

使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。每個樣品提取2μL總RNA作為模板，采用25μL反應(yīng)體系，試劑配方為：1μL的Ribo Lock RNase Inhibitor(20 U/μL)，1μL的RevertAid MMuLV RT(200 U/μL)，1μL的Random Hexamerprimer，2μL的dNTP mix(10 mM)與4μL的5×Reaction Buffer。整個反應(yīng)體系在42°C下反應(yīng)60 min合成DNA鏈，然后在70°C下反應(yīng)5 min終止反應(yīng)。反應(yīng)得到的各個樣品的cDNA供后續(xù)反應(yīng)使用。

1.2.2 TMV外殼蛋白位點的選擇與PCR設(shè)計

GenBank中TMV的標準基因組為1982年測序，登錄號為NC_001367，長度為6 395 bp，編碼6個基因[11]。其中，編碼外殼蛋白基因的區(qū)域是第5712至6191位核苷酸，共480個堿基。針對這一區(qū)域，利用NCBI平臺的Primer-BLAST工具（www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）設(shè)計包含完整外殼蛋白基因的特異性引物一對：TMV5590F（5’-CGGTCAGTGCCGAACAAGAA-3’）和TMV6282R（5’-ATTTAAGTGGAGGGAAAAACACT-3’），由上海生工生物合成。

1.2.3 外殼蛋白序列的擴增與測序

利用設(shè)計的引物擴增廣西煙區(qū)17個TMV樣品的cDNA中的外殼蛋白片段。PCR反應(yīng)體系（25μL）包括：各個樣品的cDNA模板1μL，上下游引物（濃度10 mM）各1μL，Taq酶（2X SanTaq PCR Master）13μL。反應(yīng)程序為：95°C退火5 min，然后進行30次擴增循環(huán)，每個循環(huán)包括95°C退火30 s、55°C退火30 s與72°C延伸30 s三個反應(yīng)步驟，最后72°C延伸5 min。PCR反應(yīng)在PCR儀（Biometra Tone 96G）中進行。取用PCR產(chǎn)物5μL在1%的瓊脂糖凝膠（含1/10 000核酸染料）中進行電泳40 min，電泳電壓110V，電泳后的瓊脂糖凝膠在成像儀中觀察反應(yīng)結(jié)果。PCR產(chǎn)物使用引物TMV5590F和TMV6282R進行雙向Sanger測序，每個TMV的雙向序列在軟件DnaSP 6（Universitat de Barcelona）中整合為一致序列。

1.2.4 TMV的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了進一步理清我國各個烤煙種植區(qū)TMV系統(tǒng)關(guān)系，在GenBank中選擇1條鄰國韓國烤煙的TMV外殼蛋白區(qū)域完整序列為外群，從GenBank中下載我國黑龍江、山東、湖南、貴州和云南等其他省份烤煙的TMV外殼蛋白區(qū)域完整序列8條作為參考，來源地區(qū)和登錄號詳細信息見表2。利用MEGA 7軟件[12]的MUSCLE模型[13]將廣西煙區(qū)的17條與其他地區(qū)的9條TMV外殼蛋白完整序列進行核苷酸的序列比對，之后利用Tamura-Nei模型[14]重建26條序列之間的極大似然（Maximum-Likelihood,ML）系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，重建過程Bootstrap檢驗值設(shè)置為1 000。

表2 9條TMV外殼蛋白參考序列來源地區(qū)和GenBank登錄號信息

2 結(jié)果與分析

2.1 TMV感病樣品的cDNA

將從廣西煙區(qū)賀州、百色和河池采集到的17個僅感染TMV的烤煙葉片樣品存放于-20°C冰柜中。從樣品中提取出的含TMV核酸的總RNA亮度大、含量高，降解不明顯。將其逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA樣品，完成標記后，存放于-20°C冰箱中。

2.2 外殼蛋白片段的序列

利用本研究設(shè)計的引物TMV5590F和TMV6282R與相對應(yīng)的PCR程序，從廣西煙區(qū)17個TMV樣品的cDNA中擴增出長度約為700 bp的條帶，如圖1所示。經(jīng)過PCR產(chǎn)物雙向Sanger測序及雙向序列的一致性整合，并以TMV的標準基因組序列（NC_001367）為參考，獲取廣西煙區(qū)17個TMV樣品480個堿基的外殼蛋白區(qū)域完整序列（NCBI的序列號為OK481731-OK481747）。

圖1 廣西煙區(qū)17個TMV樣品的含外殼蛋白區(qū)域的片段條帶凝膠成像圖

2.3 廣西煙區(qū)TMV系統(tǒng)發(fā)育分析

基于外殼蛋白區(qū)域完整序列的廣西煙區(qū)17個TMV樣品的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖2所示，外群韓國的TMV外殼蛋白與我國樣品的核苷酸序列相似度小于76%，氨基酸序列相似度小于85%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上也明顯分歧開。我國的TMV樣品，核苷酸序列相似度大于96%，氨基酸序列相似度小于98%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上也聚集在一起。對于廣西煙區(qū)的樣品，賀 州 市的4個TMV樣 品FFY-1、FFY-2和ZGA-1、ZGA-3具有完全相同的外殼蛋白核苷酸序列，它們同該市的另一個樣品FSJ-2核苷酸僅有1個同義突變的堿基差異，在系統(tǒng)發(fā)育樹上也呈現(xiàn)聚集。河池市的2個TMV樣品NLZ-1和NLZ-3在系統(tǒng)發(fā)育樹上也相鄰，它們的核苷酸序列有98%的相似度，其中只有2個位點是非同義突變。百色市的樣品在系統(tǒng)發(fā)育樹上的聚集關(guān)系不明顯。其中4個樣品JDG-1、JHD-2、JHD-4和JHD-6同上述賀州市的5個TMV樣品、河池市的2個樣品以及貴州銅仁GZ-TR和黔西南GZ-XN的2個參考序列的核苷酸序列相似度大于98%，非同義突變只有1個，也在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚集在一起，體現(xiàn)了較近的親緣關(guān)系。百色市另外2個來自同一地點但采樣時間不同的樣品JHD-1和JHD-5具有完全相同的外殼蛋白核苷酸序列，并且與云南紅河煙區(qū)（YN-HH）的參考序列的核苷酸僅具有3個同義突變位點。2個采樣時間相同但分別來自同德和地州的樣品JTD-5與JDP-1具有1個同義突變的堿基差異，它們分別與來自相同地點的同德JTD-2和地州JDG-1存在大于1%的核苷酸序列差異和至少1個非同義突變位點。除此之外，賀州富川的FSJ-2、百色靖西的JHD-6與河池南丹NLZ-1具有完全相同的外殼蛋白核苷酸序列，這個序列同其他地區(qū)的參考序列均存在差異。

圖2 廣西煙區(qū)17個TMV樣品（標記有“#”號）的外殼蛋白區(qū)域核苷酸序列與其他地區(qū)的9條序列的極大似然（Maximum-Likelihood,ML）系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

3 小結(jié)與討論

經(jīng)過對外殼蛋白基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，廣西煙區(qū)的TMV樣品中，賀州市的FFY-1、FFY-2、FSJ-2、ZGA-1和ZGA-3共5個樣品，河池市的NLZ-1和NLZ-3共2個樣品與百色市的JDG-1、JHD-2、JHD-4和JHD-6共4個樣品聚集在一起，這部分廣西的TMV樣品貴州銅仁GZ-TR和黔西南GZ-XN的2個參考序列有一些親緣關(guān)系，但是同黑龍江、山東、湖南、云南和貴州畢節(jié)的參考序列均具有差異。其中，賀州富川的FSJ-2、百色靖西的JHD-6與河池南丹的NLZ-1具有相同的外殼蛋白序列。這反映了廣西煙區(qū)TMV的獨特性。而在廣西的不同地區(qū)之間，賀州的TMV親緣關(guān)系很近，同貴州畢節(jié)煙區(qū)的TMV具有類似的情況[9]。賀州富川富陽的FFY-1和FFY-2與鐘山公安的ZGA-1和ZGA-3外殼蛋白序列完全一樣，同富川石家的FSJ-2存在僅有1個同義突變的堿基差異，它們也應(yīng)該來自一個相同的傳染源。這些親緣關(guān)系接近的TMV在較大范圍內(nèi)的傳播，據(jù)推測可能是通過打頂抹芽等人為操作引起[3]，必須在今后的栽培中加強管理。河池的TMV親緣關(guān)系較近，南丹六寨的NLZ-1和NLZ-3存在較高親緣關(guān)系，其中NLZ-3同相鄰的貴州黔西南的參考序列完全一樣，與貴州銅仁的參考序列存在較小差異，在一定程度上反應(yīng)了TMV傳播在地域上的接近性。而百色市的TMV則具有很高的多樣性，而且同樣品的采集來源地點的對應(yīng)性不大，這些結(jié)果與湖南煙區(qū)TMV的研究結(jié)果相似[10]。靖西化峒的2個樣品JHD-1和JHD-5盡管采樣時間不同，但是具有相同的外殼蛋白基因序列，它們同云南紅河的參考序列也比較接近，但是同化峒的其他3個樣品JHD-2、JHD-4和JHD-6就存在比較大的差異。靖西同德的1個樣品和地州的1個樣品具有一定的親緣關(guān)系，它們采樣的時間相同，但是又分別與同樣來自同德和地州的其他樣品存在比較大的差異。這些均表明百色市TMV具有多個不同的傳播來源，可能存在不同的傳播途徑。綜上所述，廣西煙區(qū)的TMV存在著不同于其他地區(qū)的獨特類群，而在不同地區(qū)之間存在著不同程度的多樣性，體現(xiàn)了TMV傳播途徑的差異。