同時測定肉制品中多種核苷酸的HPLC方法研究

李慧，張應(yīng)杰，母運龍，錢琴，彭海川，張鵬程，張崟

(成都大學(xué)肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106)

5′-單核苷酸廣泛存在于蘑菇、水產(chǎn)品及畜禽肉中，目前發(fā)現(xiàn)的5′-單核苷酸主要有6種，包括肌苷-5′-單磷酸(5′-IMP)、鳥苷-5′-單磷酸(5′-GMP)、胞苷-5′-單磷酸(5′-CMP)、腺苷-5′-單磷酸(5′-AMP)、尿苷-5′-單磷酸(5′-UMP)、黃苷-5′-單磷酸(5′-XMP)。其中，5′-IMP、5′-GMP、5′-AMP、5′-XMP是增味核苷酸，具有良好的協(xié)同增鮮作用，將其與鮮味氨基酸按照一定比例混合可極大提升產(chǎn)品的鮮味，從而達(dá)到改善食品風(fēng)味和調(diào)節(jié)食欲的效果。核苷酸對人體代謝具有積極意義，在配方奶粉中常添加多種核苷酸促進(jìn)嬰兒生長發(fā)育。肉品中含有豐富的呈味核苷酸，不僅對增加肉品風(fēng)味感知的厚度和復(fù)雜性具有重要貢獻(xiàn)，還可以評價肉制品品質(zhì)及新鮮度。因此，測定肉類食品中5′-單核苷酸種類和含量對指導(dǎo)食品加工過程中的精準(zhǔn)調(diào)控具有重要意義。

目前，國內(nèi)外對核苷酸的測定方法主要有紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳法、親水色譜法、離子色譜法和液相色譜法等。其中，以液相色譜法最為常見。目前已有用液相色譜法測定肉中核苷酸含量的相關(guān)研究，但主要是檢測原料肉中的5′-IMP、5′-GMP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量。王衛(wèi)等用HPLC法建立了5′-IMP含量的測定方法，并通過不同選育豬肉對該方法進(jìn)行了驗證；吳韜等運用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜檢測了牦牛肉中5′-IMP和5′-GMP的含量；唐修君等通過HPLC探討了冷藏和冷凍期間雞肉中5′-IMP、肌苷和次黃嘌呤含量變化，為解釋雞肉的風(fēng)味損失提供了依據(jù)。但目前可同時檢測肉制品中多種5′-單核苷酸的研究較少，而且檢測成本高，為肉制品品質(zhì)評價和控制帶來諸多不便。因此，本文擬建立可同時測定肉制品中多種5′-單核苷酸的測定方法，以期為快速高效地檢測肉制品中的核苷酸含量提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

冷鮮調(diào)理豬后腿(瘦肉)、調(diào)理豬里脊、風(fēng)干牦牛肉、四川臘肉：均購于沃爾瑪超市。

1.2 主要試劑

核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品：5′-GMP、5′-CMP、5′-UMP、5′-IMP、5′-AMP、5′-XMP，均為色譜純，購于美國Sigma公司。

甲醇：色譜純，賽默飛世爾科技有限公司。

氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、三氯乙酸：均為分析純，購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 儀器

Aglient 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Hypersil ODS2-C(4.6 mm×250 mm，5.0 μm) 大連依利特分析儀器有限公司；TGL-1650高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司；萬能粉碎機 IKA公司；pH計 上海儀天儀器股份有限公司；溶劑過濾器 天津津騰實驗設(shè)備有限公司；KQ3200DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確稱取6種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品各50.0 mg，用純水溶解后定容至50 mL，分別配制濃度為1 mg/mL的母液，分別量取不同體積的母液混合并稀釋成系列濃度，5′-IMP濃度范圍為4～200 μg/mL，5′-XMP濃度范圍為1.6～128 μg/mL，其他4種核苷酸濃度范圍為0.64～32 μg/mL。分別取不同濃度的混合核苷酸標(biāo)準(zhǔn)液10 μL上機測定，根據(jù)保留時間，以峰面積與所對應(yīng)的核苷酸濃度作圖，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 樣品的制備

以冷鮮調(diào)理豬后腿肉為原料，均勻取肉眼50 g，剁碎后置于液氮中冷凍10 min，利用超微粉碎機將其粉碎成粉，準(zhǔn)確稱取20.00 g肉粉，置于50 mL塑料離心管中，加入TCA溶液，混勻，于4 ℃冰箱中放置2 h，取出后以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入100 mL燒杯中，用3 mol/L的KOH溶液調(diào)pH至6.5，用定性濾紙過濾至50 mL容量瓶中，超純水定容搖勻，樣液過0.45 μm濾膜，用HPLC進(jìn)樣分析，外標(biāo)法定量，平行測定3次。

1.6 結(jié)果計算

樣品中核苷酸的計算公式如下：

式中：X表示樣品中核苷酸的含量，mg/g；C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的樣品測定液中相當(dāng)于某種核苷酸的濃度，μg/mL；V表示樣品提取液的體積，mL；m表示樣品的質(zhì)量，g。

1.7 色譜條件

采用Elite C色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動相A為純甲醇，流動相B為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，對樣品進(jìn)行梯度洗脫(洗脫程序見表1)，柱溫：30 ℃，流速：0.8 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件的基礎(chǔ)上，對其他色譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選。

表1 核苷酸測定梯度洗脫程序

1.8 滋味活性值(taste active value，TAV)

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

在核苷酸提取方法上，常用高氯酸作為核苷酸的提取劑，但是核苷酸在強酸性條件下不穩(wěn)定。為優(yōu)化核苷酸的提取方法，本文采用三氯乙酸(TCA)作為核苷酸的提取劑。TCA是食品檢測中常用的蛋白質(zhì)沉淀劑，本實驗考察了不同濃度的TCA溶液(5%、10%、15%)沉淀肉中蛋白質(zhì)的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種濃度的TCA處理的樣品無明顯差異，溶液均出現(xiàn)分層，下層為白色沉淀，上清液近乎無色透明，無明顯絮狀懸浮物，靜置后穩(wěn)定性好。

由于樣品中的核苷酸含量已經(jīng)確定，而TCA溶液的主要作用是除雜和促進(jìn)蛋白質(zhì)沉淀，所以基于完全去除樣品中蛋白質(zhì)的目的和檢測成本控制，選擇5%的TCA溶液作為蛋白質(zhì)沉淀劑?；?%的TCA溶液，本實驗還考察了添加不同體積的提取液對5′-單核苷酸測定的影響。由于豬肉中除5′-IMP和5′-XMP含量較高外，其他核苷酸含量均較低，過多的提取劑不利于檢測出所有核苷酸，因此最終確定5% TCA的添加量為40 mL。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 紫外檢測波長的優(yōu)選

紫外吸收波長的選擇直接決定待測組分能否被儀器檢出，不同物質(zhì)的紫外最大吸收波長不同，在最大吸收波長處測定可以盡量避免其他物質(zhì)的干擾，因此合適的波長可直接衡量檢測方法的準(zhǔn)確度和可靠性。通過紫外分光光譜掃描，得出6種核苷酸的特征光譜，見圖1。

圖1 6種5′-單核苷酸的掃描光譜圖

由圖1可知，5′-IMP、5′-GMP、5′-CMP、5′-AMP、5′-XMP、5′-UMP的最大吸收波長在248～260 nm之間。在該波長范圍內(nèi)同時測定6種核苷酸，6種核苷酸均有紫外吸收，但每種核苷酸的吸收強度不同。通過比較不同波長下混合核苷酸的出峰情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測波長為250 nm時，6種核苷酸的信號值較大，各峰之間能很好分離，且峰形對稱。

2.2.2 流動相洗脫方法的優(yōu)選

基于6種核苷酸之間的性質(zhì)差異，本實驗分別使用了甲醇-磷酸二氫鉀溶液等度洗脫和梯度洗脫方法，結(jié)果表明，等度洗脫(甲醇濃度分別為5%、10%、15%、20%、50%)時，部分核苷酸色譜峰出現(xiàn)不同程度的拖尾和拓寬，相鄰的色譜峰之間交叉掩蓋，色譜峰分離度差。按表1進(jìn)行梯度洗脫時，由圖2可知，在最佳紫外波長250 nm條件下，系統(tǒng)平衡快，基線穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中6種核苷酸均能完全分離，樣品中待測組分與其他雜質(zhì)峰分開，降低了雜質(zhì)峰的干擾，分析時間短，峰形對稱。6種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品出峰順序和保留時間分別為5′-CMP: 4.992 min，5′-UMP: 5.793 min, 5′-GMP:7.945 min, 5′-IMP:8.423 min, 5′-XMP:9.148 min, 5′-AMP:14.287 min。調(diào)理豬肉樣品中核苷酸出峰順序和保留時間為5′-CMP:4.990 min，5′-UMP:5.843 min,5′-GMP:8.063 min, 5′-IMP:8.526 min, 5′-XMP:9.309 min, 5′-AMP:14.423 min，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中待測組分保留時間基本相同。

圖2 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(a)和樣品(b)分離色譜圖(調(diào)理豬后腿制品)

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在1.7的液相色譜條件下，以不同濃度的混合核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，回歸方程、相關(guān)系數(shù)、濃度范圍、樣品檢測限見表2。結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，6種核苷酸濃度和色譜峰面積之間相關(guān)性良好。

圖3 6種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 各核苷酸回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.3.2 精密度

取同一調(diào)理豬后腿肉樣品，在1.7條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果見表3。

表3 精密度實驗

由表3可知，樣品中5′-CMP、5′-UMP、5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP和5′-AMP多次重復(fù)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.08%、0.36%、3.35%、0.29%、1.78%和0.38%，表明該方法測定調(diào)理豬肉中的核苷酸具有較高的精密度。

2.3.3 重現(xiàn)性

取同一調(diào)理豬后腿肉樣品6份，按1.5操作制備供試樣液，再在1.7色譜條件下測定呈味核苷酸含量，結(jié)果見表4。6種核苷酸變異系數(shù)在0.40%～4.37%范圍內(nèi)，表明該方法測定調(diào)理豬肉中的核苷酸具有較高的重復(fù)性(n=6)。

表4 重復(fù)性實驗

2.3.4 樣品穩(wěn)定性

取同一調(diào)理豬后腿肉樣品，分別在放置1，3，6，10，13 h后測定6種核苷酸含量，結(jié)果見表5。實驗表明，樣品溶液在10 h內(nèi)5′-CMP、5′-UMP、5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP、5′-AMP的RSD分別為4.42%、0.80%、6.35%、0.84%、2.99%、0.82%(n=3)，穩(wěn)定性良好，因此，樣品制備后最好在10 h內(nèi)完成測定。

表5 樣品穩(wěn)定性實驗

2.3.5 加標(biāo)回收率

在調(diào)理豬后腿肉樣品中分別準(zhǔn)確加入不同含量的核苷酸標(biāo)準(zhǔn)混合液，各測定3次，計算回收率和變異系數(shù)，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，5′-CMP、5′-UMP、5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP、5′-AMP的回收率在89%～126%范圍內(nèi)，變異系數(shù)在0.04%～2.21%之間，表明該方法測定調(diào)理豬肉中的核苷酸具有較高的精準(zhǔn)度，可應(yīng)用于肉制品中核苷酸的分析檢測。

表6 6種核苷酸加標(biāo)回收率實驗

2.4 不同肉制品中核苷酸的種類及含量測定

通過本研究建立的方法，在3種肉制品中均檢測出6種5′-單核苷酸。由表7可知，調(diào)理豬里脊中5′-IMP含量最高，其他5種核苷酸含量均較低，5′-IMP對調(diào)理豬里脊滋味貢獻(xiàn)最大，這與趙艷等的研究結(jié)果相同。風(fēng)干牦牛肉相比于其他兩種肉制品5′-IMP、5′-GMP、5′-AMP含量均較高，這可能是形成風(fēng)干牦牛肉特殊滋味的重要原因。5′-UMP在風(fēng)干牦牛肉和四川臘肉中含量均最高，這可能與其特殊的加工工藝有關(guān)，5′-UMP本身無增味的功效，但具有維持免疫系統(tǒng)功能、促進(jìn)腸道成熟等作用。

表7 不同肉制品中核苷酸的測定

2.5 鮮味評價

水溶性成分造就了肉制品復(fù)雜的滋味，通常用呈味強度值(taste activity value,TAV)考察物質(zhì)對滋味的貢獻(xiàn)大小。當(dāng)TAV大于1時，表明該物質(zhì)對肉制品的整體滋味有重要貢獻(xiàn)，值越大貢獻(xiàn)越大，反之則影響不大。5′-GMP、5′-IMP、5′-AMP是典型的增味核苷酸，其閾值及TAV見表8。

表8 不同肉制品中滋味活性物質(zhì)的呈味強度

由表8可知，3種肉制品中，調(diào)理豬里脊和風(fēng)干牦牛肉中5′-IMP的TAV>1，5′-GMP和5′-AMP的TAV<1，說明5′-IMP對調(diào)理豬里脊和風(fēng)干牦牛肉的滋味具有重要貢獻(xiàn)，而5′-GMP和5′-AMP對滋味的貢獻(xiàn)較??；呈味核苷酸對四川臘肉滋味的貢獻(xiàn)不明顯，其風(fēng)味主要來源于揮發(fā)性成分、粗蛋白、脂肪酸及氨基酸等物質(zhì)。

3 結(jié)論

本實驗建立了可同時測定6種5′-單核苷酸的HPLC方法，具體色譜條件：C色譜柱，以甲醇(2%～15%)和0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(98%～85%)為流動相進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測波長250 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。在該檢測條件下，6種5′-單核苷酸均能較好分離，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。通過將該方法用于冷鮮調(diào)理豬肉進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)其中的6種5′-單核苷酸均能一次性檢出，每種5′-單核苷酸的加標(biāo)回收率在89%～126%之間，RSD值在0.04%～2.21%之間。方法學(xué)驗證結(jié)果表明，該方法操作便捷，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，能用于肉制品中核苷酸含量的測定。