乳酸菌降解發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的研究現(xiàn)狀

龔福明，何彩梅，吳桂容，郭繼毅

(1.賀州學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899；2.德宏職業(yè)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 芒市 678400)

發(fā)酵蔬菜歷史悠久，是一類以新鮮蔬菜為原料，加入一定量食鹽后，在原料本身附著的有益微生物的作用下，通過控制其益生性微生物生長(zhǎng)條件對(duì)蔬菜進(jìn)行加工而成的風(fēng)味獨(dú)特，具有抗衰老、減脂、抗氧化、甚至抗COVID-19等功效的發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品。不同的發(fā)酵原料及發(fā)酵工藝可得到泡菜、酸菜、醬菜等多種形式的發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品，現(xiàn)階段的代表性產(chǎn)品包括四川泡菜、涪陵榨菜、東北酸菜、貴州辣椒醬以及以甘肅蘭州和陜西陜南的漿水菜為代表的傳統(tǒng)腌制蔬菜；營養(yǎng)豐富、保健功效良好、酸鮮可口、開胃下飯等特性使傳統(tǒng)腌制的發(fā)酵蔬菜逐漸成為人們不可或缺的日常小菜，并逐漸形成一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模。然而在粗放的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝條件下，蔬菜中富積的硝酸鹽在長(zhǎng)期發(fā)酵腌制過程中容易被硝酸還原菌等微生物還原為亞硝酸鹽并大量積聚，導(dǎo)致發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽超標(biāo)，影響發(fā)酵蔬菜品質(zhì)與食用。相關(guān)報(bào)道表明，過量攝入含亞硝酸鹽的食物會(huì)導(dǎo)致中毒性高鐵血紅蛋白癥，甚至死亡；同時(shí)亞硝酸鹽還能與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物胺類反應(yīng)生成具有極強(qiáng)致畸、致癌特性的亞硝胺等N-亞硝基化合物引發(fā)癌癥及胎兒畸形。因而篩選高效降解亞硝酸鹽的優(yōu)良菌株，設(shè)法降低亞硝酸鹽及其前體化合物硝酸鹽的攝入成為提高發(fā)酵蔬菜品質(zhì)、實(shí)現(xiàn)發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)規(guī)?；c標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展亟需解決的核心技術(shù)。

乳酸菌是國際公認(rèn)的食品安全級(jí)(generally recognized as safe, GRAS)微生物，被廣泛運(yùn)用于食品加工等產(chǎn)業(yè)。相關(guān)報(bào)道表明，蔬菜中分布著大量的乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌及少量的其他菌群，其中乳酸菌是蔬菜發(fā)酵的主要作用微生物，在發(fā)酵過程中除具有降低發(fā)酵液pH值，發(fā)揮抑制有害菌生長(zhǎng)的防腐作用及加強(qiáng)營養(yǎng)，賦予產(chǎn)品芳香的風(fēng)味、良好口感與優(yōu)良保健功效外，還具備顯著降低發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量的活性。隨著人們認(rèn)識(shí)的深入及健康生活理念的興起，發(fā)酵蔬菜日益受到消費(fèi)者的關(guān)注，通過乳酸菌作用有效降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量，提升產(chǎn)品質(zhì)量與口感成為制備綠色發(fā)酵蔬菜的關(guān)鍵。本文將對(duì)蔬菜發(fā)酵過程中降解亞硝酸鹽的主要作用乳酸菌及其亞硝酸鹽降解機(jī)制與影響因素等進(jìn)行綜述，為乳酸菌發(fā)酵制備綠色低亞硝酸鹽發(fā)酵蔬菜提供了理論依據(jù)與參考。

1 發(fā)酵蔬菜中降解亞硝酸鹽的乳酸菌

發(fā)酵蔬菜是歷史悠久的世界性發(fā)酵食品，傳統(tǒng)的固態(tài)高鹽發(fā)酵會(huì)因蔬菜發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量亞硝酸鹽而影響發(fā)酵蔬菜的品質(zhì)與安全性。相關(guān)研究報(bào)道表明，微生物降解亞硝酸鹽是生物降解亞硝酸鹽的主要方式，而蔬菜發(fā)酵過程中分屬于乳桿菌屬()、明串珠菌屬()、腸桿菌屬()、乳球菌屬()、腸球菌屬()、片球菌屬()及魏斯氏菌屬()7個(gè)屬20余個(gè)種的乳酸菌，因其普遍具有降解亞硝酸鹽、安全且高效的特性而成為發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)過程中降解亞硝酸鹽的優(yōu)勢(shì)候選微生物。張興吉等分離得到的275株乳酸菌均具有降解亞硝酸鹽的能力，半數(shù)以上乳酸菌菌株的亞硝酸鹽降解率>90%，優(yōu)勢(shì)菌中發(fā)酵乳桿菌()的降解率最差且不穩(wěn)定，降解率最低，僅為4.8%；植物乳桿菌()的降解率最強(qiáng)且穩(wěn)定，其亞硝酸鹽降解率>96.7%，最高可達(dá)99.6%；其中植物乳桿菌()與短乳桿菌()是當(dāng)前降解亞硝酸鹽能力極強(qiáng)且報(bào)道比較多的乳酸菌菌種。

蔬菜發(fā)酵乳酸菌菌種及發(fā)酵工藝的差異導(dǎo)致不同菌種甚至是同一菌種不同菌株之間在降解亞硝酸鹽能力方面存在顯著差異。相關(guān)研究報(bào)道證實(shí)，乳酸菌除具有防腐，加強(qiáng)營養(yǎng)，賦予產(chǎn)品芳香風(fēng)味及良好口感與優(yōu)良的保健功效外，還具備降低亞硝酸鹽等有害代謝產(chǎn)物，提升品質(zhì)與安全的特性，其發(fā)酵制備的泡菜等發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品也更符合大眾消費(fèi)口味。張雪梅等在蘿卜發(fā)酵過程中證實(shí)，人工接種乳酸菌發(fā)酵的蘿卜泡菜中亞硝酸鹽含量明顯低于自然發(fā)酵泡菜，3種乳酸菌降解亞硝酸鹽能力的排序?yàn)槎倘闂U菌>腸膜乳桿菌>植物乳桿菌；且多菌種混合發(fā)酵降解亞硝酸鹽的能力強(qiáng)于單菌種發(fā)酵，當(dāng)腸膜明串珠菌和短乳桿菌混合發(fā)酵，且比例為1∶3時(shí)，蘿卜泡菜的發(fā)酵效果最佳，降解亞硝酸鹽的能力也最強(qiáng)。

2 乳酸菌降解發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的機(jī)理

乳酸菌是蔬菜發(fā)酵過程中的主要作用菌群，同時(shí)也具備極強(qiáng)的亞硝酸鹽降解能力，菌株自身直接降解亞硝酸鹽的途徑主要是酶解途徑和酸降解途徑，蔬菜發(fā)酵過程中兩種機(jī)制共同發(fā)揮作用，但在作用時(shí)間上存在差異。遲乃玉等研究發(fā)現(xiàn)，萊氏乳桿菌()、植物乳桿菌()、乳脂鏈球菌()等多種乳酸菌降解亞硝酸鹽的活性會(huì)隨發(fā)酵產(chǎn)酸后溶液pH值變化而被分為兩個(gè)階段：當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)液pH>4.5時(shí)即發(fā)酵前期以酶降解為主；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)液pH<4.0時(shí)即發(fā)酵后期以酸降解為主。微生物酶解亞硝酸鹽的途徑有反硝化路徑和銨形成途徑(硝酸鹽異化還原成銨,DNRA)，Liu等在干酪乳桿菌鼠李糖亞種(subsp.)6013(LCR 6013)亞硝酸鹽降解的研究中證實(shí)，LCR 6013等乳酸菌能通過反硝化路徑實(shí)現(xiàn)亞硝酸鹽的酶解，而不是銨形成途徑。在酶解途徑中反硝化路徑的關(guān)鍵酶是亞硝酸鹽還原酶，在該酶及一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶的作用下對(duì)NO→NO→NO進(jìn)行依次降解，最終將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)為氮?dú)庖酝瓿擅附膺^程。酸降解途徑是乳酸菌代謝過程中產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸釋放的H能與發(fā)酵液中NO結(jié)合生成亞硝酸，進(jìn)而發(fā)生非酶歧化反應(yīng)最終將亞硝酸鹽降解生成NO，進(jìn)而有效降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量。相關(guān)研究證實(shí)，類似5-7-3等菌株的非酶歧化化學(xué)反應(yīng)降低亞硝酸鹽的能力與環(huán)境酸度成正比關(guān)系，與pH值成反比，即總酸度越高(pH越低)，菌株降低亞硝酸鹽的非酶歧化反應(yīng)能力越強(qiáng)，反之越弱。

另外，發(fā)酵蔬菜中的乳酸菌還存在降解亞硝酸鹽的間接途徑，即通過其代謝產(chǎn)物的抑菌作用發(fā)揮降解亞硝酸鹽的功效。有研究報(bào)道證實(shí)，乳酸及細(xì)菌素等乳酸菌代謝產(chǎn)物能通過抑制大腸桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌、熒光假單胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌等硝酸還原菌生長(zhǎng)的機(jī)制降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的生成與積累。此外，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的V等微生物代謝產(chǎn)物也在一定程度上存在降低亞硝酸鹽產(chǎn)生和積累的作用，具體機(jī)制還有待于深入研究。

3 乳酸菌降解發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的影響因素

乳酸菌是蔬菜發(fā)酵過程中的主要作用微生物，其自身蛋白分解能力弱，氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)合成能力弱，代謝產(chǎn)物的自身抑制作用及營養(yǎng)要求較高，生長(zhǎng)易受溫度、pH值及滲透壓的影響，以及亞硝酸鹽還原酶在催化反應(yīng)時(shí)需要適宜溫度、pH值、一定金屬離子等條件，使發(fā)酵蔬菜原料、發(fā)酵pH值、發(fā)酵溫度、NaCl添加量與發(fā)酵乳酸菌菌種及接種量等外界因素與條件成為影響乳酸菌發(fā)酵降解發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的關(guān)鍵。

3.1 發(fā)酵原料

可用于制備發(fā)酵蔬菜的原料繁多，常見的有芥菜、黃瓜、甘藍(lán)、辣椒、蘿卜、大白菜、雪菜、豇豆、豆角等原料，并可制備成泡菜、酸菜、醬菜三大類發(fā)酵蔬菜制品。一般來說，各類蔬菜的硝酸鹽平均積累量排序?yàn)楦祟?葉菜類>莖菜類>果菜類>花菜類，而硝酸鹽積累量越高，蔬菜在發(fā)酵過程中也越容易累積亞硝酸鹽。閆亞梅等以大白菜為主料，加入豇豆、白蘿卜、胡蘿卜與黃瓜等蔬菜進(jìn)行組合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)“亞硝峰”峰值僅為13 mg/kg，比單一發(fā)酵時(shí)低得多，說明原料也是影響泡菜發(fā)酵的關(guān)鍵因素。另外，發(fā)酵蔬菜自身原料決定了發(fā)酵工藝的差異，導(dǎo)致原料處理、添加姜、糖、蒜、蔥、辣椒、八角等香辛料及NaCl與有機(jī)酸等成分和含量也存在差異，而熱漂燙和低溫貯藏及類似于姜等香辛料含有的生姜精油、姜辣素等活性物質(zhì)及高濃度鹽和酸在一定程度上能通過物理作用、抗氧化、抑制硝酸鹽還原菌生長(zhǎng)等特性降低或減少發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的積累。

3.2 發(fā)酵條件

3.2.1 pH值

乳酸菌及其產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶在作用時(shí)對(duì)pH值都有一定要求，乳酸菌生長(zhǎng)發(fā)酵最適pH值介于5.5～6.5之間，亞硝酸鹽還原酶最適pH值為5.0。同時(shí)亞硝酸鹽在酸性條件下極不穩(wěn)定，可發(fā)生一定程度的自然降解，加速亞硝酸鹽的降解進(jìn)而降低其含量。有報(bào)道表明，乳酸菌降解亞硝酸鹽的酶解和酸降解機(jī)制共同作用，pH值是乳酸菌降解亞硝酸鹽的主要決定因素且與亞硝酸鹽降解率成反比關(guān)系。另外，發(fā)酵環(huán)境pH值高于或低于細(xì)胞正常pH值(5.5～6.5)時(shí)，亞硝酸鹽還原酶活性降低，亞硝酸鹽還原速率也隨之迅速下降；發(fā)酵后期乳酸等酸性物質(zhì)大量積累導(dǎo)致pH值降低，當(dāng)pH值<4.0時(shí)亞硝酸鹽還原酶降解作用不明顯，乳酸菌主要以酸降解途徑來降解亞硝酸鹽。遲雪梅等在三段式(即發(fā)酵初期為自然發(fā)酵,發(fā)酵中期接種高產(chǎn)亞硝酸還原酶的乳酸菌,發(fā)酵后期接種產(chǎn)酸的乳酸菌)發(fā)酵甘藍(lán)的研究中證實(shí)pH值確實(shí)是影響乳酸菌降解亞硝酸鹽的主要因素，其發(fā)酵過程中接種乳酸菌的差異導(dǎo)致pH值變化能決定發(fā)酵甘藍(lán)中乳酸菌降解亞硝酸鹽的方式并能有效將發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽含量降至最低。

3.2.2 溫度

乳酸菌生長(zhǎng)的溫度介于30～40 ℃之間，所產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶的作用溫度也介于30～40 ℃之間，一旦超過此范圍，溫度過高或過低均會(huì)影響乳酸菌生長(zhǎng)及其所產(chǎn)生亞硝酸還原酶的活性與乳酸等有機(jī)酸和細(xì)菌素等活性物質(zhì)的含量，最終使乳酸菌降解亞硝酸鹽的途徑受到影響或阻斷。隋明等在甘藍(lán)泡菜發(fā)酵制備中發(fā)現(xiàn)，30 ℃是最有利于泡菜制備和添加乳酸菌制劑發(fā)酵的溫度，此溫度條件下發(fā)酵基質(zhì)的pH值最低，降解亞硝酸鹽的能力最強(qiáng)，亞硝酸鹽殘留量最低，泡菜感官評(píng)分最高。另外，發(fā)酵乳酸菌菌株不同會(huì)導(dǎo)致最適溫度有所差異，蘇肖晶用戊糖乳桿菌 B1、植物乳桿菌 C1和植物乳桿菌D等23種乳酸菌進(jìn)行組合發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)，最適發(fā)酵溫度為35 ℃，在相應(yīng)生長(zhǎng)及作用溫度范圍內(nèi)發(fā)酵體系溫度越高，亞硝酸鹽降解率越高。與此同時(shí)，有報(bào)道表明提高溫度能縮短乳酸菌發(fā)酵蔬菜的周期，使“亞硝峰”較早出現(xiàn)，同時(shí)最終的“亞硝峰”峰值也會(huì)最低且一直低于其他溫度值。然而溫度過高會(huì)導(dǎo)致丁酸梭菌()等雜菌生長(zhǎng)，因而結(jié)合泡菜多采用常溫發(fā)酵的實(shí)際，篩選嗜冷且安全性高的乳酸菌作為發(fā)酵起子成為發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品未來的發(fā)展趨勢(shì)。Kim等在韓國泡菜(kimchi)的溫控實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，-1 ℃條件下發(fā)酵7 d，清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌和短乳桿菌的亞硝鹽降解率依次為87.9%、66.0%、57.1%，但溫度提高到15 ℃時(shí)，3種乳酸菌的亞硝酸鹽降解率幾乎為100%。

3.2.3 NaCl濃度

NaCl是蔬菜發(fā)酵過程中不可或缺的添加劑，一方面有著調(diào)節(jié)泡菜風(fēng)味、防腐抑菌的作用，另一方面也可作為乳酸菌等發(fā)酵作用微生物生長(zhǎng)繁殖的營養(yǎng)條件，并通過鹽濃度讓蔬菜中可溶性營養(yǎng)成分進(jìn)入發(fā)酵液，供發(fā)酵微生物吸收利用。相關(guān)報(bào)道表明，發(fā)酵蔬菜由來的乳酸菌都具有一定耐鹽性，能在NaCl含量1%～10%的發(fā)酵蔬菜中生長(zhǎng)并表現(xiàn)出降解亞硝酸鹽的特性。因耐鹽性，低濃度NaCl對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)及其亞硝酸鹽降解能力影響不大甚至有促進(jìn)作用，但不能完全抑制腐敗菌生長(zhǎng)；隨著NaCl濃度增加至一定值后，乳酸菌等發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而影響了乳酸菌的亞硝酸鹽降解能力。熊濤等在NaCl添加量對(duì)自然發(fā)酵圓白菜影響的研究中證實(shí)，不同NaCl含量對(duì)泡菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的能力有明顯影響，低濃度(NaCl濃度為2%)時(shí)乳酸菌繁殖最快，產(chǎn)酸最多，pH值最低；食鹽濃度為2%時(shí)有害微生物得到有效抑制，快速降解了泡菜中的亞硝酸鹽，僅發(fā)酵0.5 d后就快速出現(xiàn)了“亞硝峰”，高濃度(NaCl濃度為8%)時(shí)泡菜中乳酸菌生長(zhǎng)受到了抑制，泡菜成熟期也相應(yīng)的延長(zhǎng)。

3.2.4 乳酸菌接種量

傳統(tǒng)泡菜發(fā)酵中以乳桿菌屬()、明串珠菌屬()、片球菌屬()等乳酸菌為主要發(fā)酵菌群的階段是決定泡菜風(fēng)味、品質(zhì)及其亞硝酸鹽等代謝產(chǎn)物分解轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。因此，改善風(fēng)味與口感，降低亞硝酸鹽含量，提升品質(zhì)，篩選發(fā)酵速度快、風(fēng)味優(yōu)且亞硝酸鹽降解能力強(qiáng)的功能性乳酸菌進(jìn)行純種發(fā)酵或混合發(fā)酵成為現(xiàn)代泡菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。報(bào)道表明，接種乳酸菌降解亞硝酸鹽有一個(gè)最適接種量，低于最適接種量之前，乳酸菌接種量與亞硝酸鹽降解量成正比，大于最適接種量后則成反比，因此接種量過多或過少均不利于泡菜發(fā)酵及代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽等物質(zhì)的降解與轉(zhuǎn)化。趙慧娟等在乳桿菌Lyoflora V3接種量對(duì)亞硝酸鹽降解的研究中證實(shí)菌株Lyoflora V3的最佳接種量為5%，低于或高于此接種量，乳桿菌Lyoflora V3的亞硝酸鹽降解效果均較差。隨著研究深入，混合發(fā)酵逐漸成為泡菜等發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)，姜雪晶等在副干酪乳桿菌()、布氏乳桿菌()和凝結(jié)芽孢桿菌()3種乳酸菌混合發(fā)酵酸菜的研究中發(fā)現(xiàn)，混合菌群發(fā)酵酸菜的亞硝酸鹽濃度(1.593 mg/kg)明顯低于自然發(fā)酵酸菜(3.641 mg/kg)，且其感官品質(zhì)、風(fēng)味及氨基酸、Vc與有機(jī)酸L-乳酸等營養(yǎng)物質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)含量均優(yōu)于自然發(fā)酵酸菜。

3.3 其他影響因素

乳酸菌降解亞硝酸鹽的特性與乳酸菌及其產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶直接相關(guān)，而降解亞硝酸鹽特性除受上述發(fā)酵原料與主要發(fā)酵條件影響外，還受到接種乳酸菌種類、抗氧化物質(zhì)(黃酮類、維生素A、維生素C、維生素E)、益生元、亞硒酸鈉等添加劑及酶激活劑(EDTA 與金屬離子Zn、K、Fe、Fe、Cu)等因素的影響，具體作用機(jī)理還有待深入研究。

4 結(jié)論

綜上所述，當(dāng)發(fā)酵條件適合時(shí)，發(fā)酵蔬菜中的主要作用微生物乳酸菌確實(shí)能通過酶解途徑與酸解途徑及代謝產(chǎn)物抑制硝酸還原菌與腐敗菌生長(zhǎng)等直接與間接機(jī)制降解發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽；加之乳酸菌能增強(qiáng)發(fā)酵蔬菜的營養(yǎng)，改善其風(fēng)味與口感，提升相應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全的特性，乳酸菌是良好的蔬菜發(fā)酵起子。但乳酸菌降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽，改善品質(zhì)，提升口感的研究大多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，對(duì)其安全性評(píng)價(jià)與控制體系及運(yùn)用工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)酵蔬菜實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)的研究還有一定差距。但隨著人們認(rèn)識(shí)的深入及健康生活理念的興起，憑借降解亞硝酸鹽分子機(jī)理與基因組學(xué)研究及乳酸菌與發(fā)酵食品體系相互作用機(jī)制的闡明，乳酸菌發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品將成為備受人們關(guān)注與喜愛的綠色發(fā)酵產(chǎn)品。