梁建斌 張旭輝 閆治斌 李世風 支海林 梁歌恒 李麗仙 李 悅 王 倩 夏瑞英 柴君臣

（甘肅省敦煌種業(yè)集團股份有限公司研究院，酒泉 735000）

玉米作為中國第一大糧食作物，在國民經(jīng)濟及國家糧食安全中發(fā)揮著重要的作用。隨著生產(chǎn)需求的不斷增長，玉米育種者不斷探索和改進現(xiàn)代育種技術(shù)。玉米雙單倍體（DH，Doubled haploid）技術(shù)是生物技術(shù)與常規(guī)育種方法結(jié)合產(chǎn)生的一條新的育種途徑，作為快速獲得純系的手段，可以顯著縮短育種年限，加快育種進程[1]。種質(zhì)狹窄是影響玉米產(chǎn)量提高的主要原因，也是導致我國育種進程、育種水平與發(fā)達國家差距較大的主要原因。外來種質(zhì)是玉米育種重要的種質(zhì)基礎，單倍體育種對外來種質(zhì)進行遺傳改良具有重要意義。單倍體育種是目前各大種業(yè)公司廣泛應用的現(xiàn)代育種技術(shù)，已成為現(xiàn)代玉米育種的關鍵核心技術(shù)之一[2]。

誘導系誘導獲得單倍體，是指利用誘導率較高的誘導系作父本、改良基礎群體材料作母本，誘導產(chǎn)生單倍體，是目前應用最多的實用技術(shù)[3]。其中選擇誘導系與基礎材料雜交，單倍體誘導系是一個關鍵因素，1959 年Coe[4]發(fā)現(xiàn)了第一個單倍體誘導系Stock6，誘導率僅為2%左右，誘導率低嚴重制約了該項技術(shù)的應用。前人研究表明，不同的誘導系對不同的基礎材料誘導時誘導率差異較大[5]，選擇誘導率高且穩(wěn)定的誘導系及更適應誘導的具有優(yōu)良性狀的基礎材料至關重要，我國玉米單倍體育種總體上還處于引進熟化創(chuàng)新階段，與發(fā)達國家比較還有相當大的差距。到目前為止單倍體誘導系的研究在國內(nèi)外學者的共同努力下已經(jīng)有了重大進步，已經(jīng)選育出非常有價值的高油性誘導系列CAUHOI、農(nóng)大高誘號系列、吉高誘系3 號和單倍體誘導系H01～H05、WS14、Zarodyshevy Marker Saratovsky、Korichnevv Marker Saratovsky、Moldovian Haploid Inducer 等[6-13]。目前國內(nèi)誘導系的遺傳背景普遍較為單一，所以不僅要組配更具有雜種優(yōu)勢的雜交誘導系，還需要拓寬國內(nèi)種質(zhì)資源的遺傳背景。前人已有廣泛的研究來提高單倍體誘導率和單倍體誘導系的農(nóng)藝性狀，除了提高誘導系的誘導率外，研究誘導材料對單倍體誘導系的影響也很重要[14]。本研究用不同的誘導系誘導不同的基礎群體材料，分析誘導率和雜株率差異，探討誘導系的選用策略，篩選標記明顯、誘導率穩(wěn)定且高、雜株率少的誘導系和基礎群體材料。本研究結(jié)果可充實單倍體的規(guī)?；a(chǎn)和提高育種效率相關的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試的4 個單倍體誘導系材料（表1）均具有籽粒Navajo 標記，均引自中國農(nóng)業(yè)大學國家玉米改良中心。供試的12 個基礎材料類型見表2。

表1 供試單倍體誘導系材料

表2 供試基礎材料類型

通過雜交誘導所得籽粒主要有以下3 種類型（圖1）。擬單倍體籽粒：籽粒胚乳上有紫色，胚部無色；雜合二倍體籽粒：籽粒胚部和胚乳上均有紫色；雜合二倍體黃粒：籽粒胚乳黃色，胚部無色。

圖1 雜交誘導籽粒類型

1.2 試驗設計試驗于2020 年冬天在甘肅省敦煌種業(yè)海南玉米育種基地進行。為了保證誘導系與基礎群體材料的花期能夠相遇，先播種全部基礎群體材料與第1 期誘導系，第2 期、第3 期誘導系分別間隔5d、10d 播種?；ㄆ诓捎萌斯とバ鄄⑻状诜鄣姆绞?，分別取4 個誘導系（高誘3 號、高誘5 號、紫色5 號和CS3）的花粉授予12 個基礎群體材料。收獲后依據(jù)籽粒的Navajo 標記進行籽粒挑選，胚乳上有誘導標記、胚部無誘導標記的籽粒被認定為擬單倍體籽粒，并統(tǒng)計擬單倍體籽粒、有誘導標記的二倍體籽粒數(shù)量。2021 年在敦煌種業(yè)西北育種基地（酒泉）對擬單倍體籽粒進行催芽、加倍和田間單株移栽。待植株散粉前對植株進一步鑒定，植株高大粗壯或帶紫色標記的為二倍體植株，植株矮小，葉片短小、皺縮、上沖的為單倍體植株，并統(tǒng)計單倍體植株數(shù)。

1.3 項目統(tǒng)計統(tǒng)計誘導總粒數(shù)、擬單倍體籽粒數(shù)和田間鑒定單倍體株數(shù)，按以下公式計算誘導率和雜株率，雜株包含非單倍體和發(fā)育不正常的籽粒。

誘導率（%）=田間鑒定單倍體株數(shù)/總粒數(shù)×100

雜株率（%）=（擬單倍體籽粒數(shù)-田間鑒定單倍體株數(shù)）/擬單倍體籽粒數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導系誘導率和雜株率統(tǒng)計如表3 所示，本研究中雜交誘導后籽粒的數(shù)量較大，總共有845354 粒，各基礎材料都在5269～52060 粒之間，平均17612 粒，統(tǒng)計所得誘導率和雜株率具有代表性。

表3 不同誘導系誘導率和雜株率統(tǒng)計

2.2 不同誘導系誘導不同基礎群體材料的誘導率由表4 可知，4 個誘導系作父本與12 個基礎材料雜交誘導后，不同基礎群體材料之間的誘導率存在差異，基礎材料D3 和D4 平均誘導率較高，分別為7.44%和7.45%，其中高誘5 號對D3 和D4 基礎群體的誘導率分別達11.36%和11.60%?；A群體D1、D2 和HN3 的平均誘導率較低，分別為1.11%、0.87%和1.85%。4 種誘導系對HB4 基礎群體的誘導率差異較大，變異系數(shù)達112.03%，其中CS3 對HB4 基礎群體的誘導率達11.90%。

表4 不同誘導系誘導不同基礎群體誘導率分析

同一誘導系誘導不同的基礎材料后平均誘導率大小依次為CS3>高誘5號>高誘3號>紫色5號，分別為5.66%、4.47%、3.17%和3.00%；高誘3 號和CS3 分別對12 個基礎材料的平均誘導率差異相對較小，高誘5 號對12 個基礎材料的平均誘導率差異較大，變異系數(shù)達81.00%。

2.3 不同誘導系誘導不同基礎群體材料的雜株率

如表5 所示，不同誘導系和不同基礎材料雜交誘導的雜株率差異較大。不同基礎群體材料之間，D2基礎群體平均雜株率最大，達46.28%；HB4 基礎群體最小，為10.93%；HN1 的變異系數(shù)最大，說明1種誘導系誘導HN1 時雜株率差異較大，其中CS3 誘導HN1 基礎群體時的雜株率為8.62%，而高誘3 號誘導HN1 基礎群體時的雜株率為70.93%；D2 的變異系數(shù)最小，說明4 種誘導系誘導D2 基礎群體時雜株率差異較小。同一誘導系對不同基礎材料誘導時平均雜株率大小依次為高誘3 號>紫色5 號>高誘5 號>CS3，其雜株率分別為39.61%、30.46%、18.11%和16.96%，其中CS3 誘導HB4 時雜株率僅為0.81%。

表5 不同誘導系誘導不同基礎群體雜株率分析

3 討論與結(jié)論

誘導系的選擇首先注重于提高誘導率，從而產(chǎn)生大量單倍體，提高配子體選擇效率，篩選聚集更多有利基因的目標植株。目前，基于Navajo 標記的單倍體籽粒篩選主要依靠人工目測，遺傳標記在不同種質(zhì)資源中的表達水平差異很大，影響誘導系的利用效率和育種成本。因此，選擇和誘導在注重提高誘導率的同時，還需要加大篩選標記表達的力度。

不同群體材料之間的誘導率存在差異，研究誘導率高的誘導材料對提高誘導效率具有重要意義[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，同一基礎材料與不同的誘導系進行雜交誘導后所得到的單倍體誘導率存在顯著差異，12 份基礎材料誘導后，D3 和D4 的平均誘導率顯著高于其他基礎材料，雜株率也較低；D3 和D4材料與誘導系高誘5 號進行組合后其誘導率分別達到11.36%和11.60%，這一最佳組合顯著提高了其誘導率，其可能原因是D3 和D4 的遺傳基礎更為復雜，優(yōu)良的血緣使得其適應性更強、育性恢復能力強，使得誘導率偏高，但具體原因還需進一步研究，以期將此材料廣泛應用于單倍體誘導的基礎材料來滿足商業(yè)育種的需求。不同誘導系對同一基礎材料進行雜交誘導所得單倍體誘導率存在顯著的差異，本研究發(fā)現(xiàn)4 個誘導系單倍體平均誘導率在3.00%～5.66%之間，這一研究結(jié)果與李高科等[16]研究結(jié)果相一致。其中CS3 的誘導能力最強，變異系數(shù)也小于高誘5 號和紫色5 號，說明其誘導系的穩(wěn)定性較高，平均雜株率也低于其他誘導系，表明在玉米單倍體誘導育種中，可繼續(xù)加大對CS3 的利用。本研究結(jié)果表明，基礎材料和誘導系都會對玉米單倍體誘導率和雜株率產(chǎn)生一定影響，因此誘導系的誘導能力不僅受自身遺傳背景的影響，也受其誘導的基礎材料遺傳背景的影響，但由于本研究所用的基礎材料有限，還需進一步針對玉米單倍體進行專用型誘導系的選育以及基礎材料的篩選，這是本課題組下一階段的研究重點。

目前，雖然單倍體技術(shù)已廣泛應用于商業(yè)化育種，但仍有以下4 個方面有待改進。首先，應選擇具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的高頻單倍體誘導系。其次，在新的誘導系中整合多個有效標記，提高單倍體鑒定的有效性和準確性。第三，結(jié)合倍率相關的QTL 定位和基因編輯技術(shù)，建立高效的倍增體系。最后，利用組織培養(yǎng)和選擇標記縮短DH 系生產(chǎn)所需的時間。今后，解決上述方面的技術(shù)難題，將促進單倍體誘導技術(shù)在現(xiàn)代玉米育種中得到更廣泛的應用。