精子頂體酶活性與ART受精率的相關(guān)性研究

黃玲,楊帆,江利,杜丹（湖南省郴州市第一人民醫(yī)院,湖南 郴州 423000）

目前，全世界已婚夫妻中不育癥患者約占15%[1]。隨著不育癥的發(fā)病率逐年遞增，使得輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）廣泛應(yīng)用于臨床。由于不育癥的病因既有女性因素也有男性因素，既往學(xué)者對女性不育的病因已經(jīng)做了大量的研究，目前男性因素也在慢慢探索中。精液常規(guī)檢測作為男性生育力評估的基本方法，由于受男性生理狀態(tài)、檢測儀器及檢測人員等條件的不同，使得其檢查結(jié)果可能存在較大的偏差，有時并不能反映男性生育力的真實(shí)狀態(tài)，在ART治療及受精方式的選擇上可能存在一定的局限性。精子頂體酶是一種胰蛋白酶[2-3]，主要存在于精子頂體中，能夠以酶原的形式生成并儲存在精子頂體部位，當(dāng)機(jī)體頂體反應(yīng)發(fā)生時，就會激活并釋放頂體酶原。頂體酶是非常重要的一種蛋白水解酶，能夠?yàn)槭芫训慕Y(jié)合創(chuàng)造條件。其能夠溶解卵子表面的透明帶，讓精子順利進(jìn)入卵細(xì)胞中，精子頂體酶活性是精子質(zhì)量的重要評價指標(biāo)之一。相關(guān)研究顯示，精子頂體酶活性與精液常規(guī)參數(shù)有一定相關(guān)性，可以作為評估精子質(zhì)量的一個客觀定量指標(biāo)[4]，但對于IVF結(jié)局的預(yù)測價值較低，對ART治療及受精方式選擇的指導(dǎo)意義不明，且其對ART受精結(jié)局的影響及機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步的研究去闡明。因此，本研究的目的在于探討精子頂體酶活性對男性生育力評估、ART治療方案的選擇及受精率的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年1月-2020年12月在我院就診的852例女子獲卵數(shù)≥3枚因原發(fā)不育來行ART治療的夫婦作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①男方年齡范圍22歲-49歲；②同居或婚后未避孕一年以上而未孕者，且為原發(fā)性不孕；③男性生殖器官及性功能正常；④半年內(nèi)未服用對檢驗(yàn)結(jié)果有影響的藥物；⑤女方獲卵子數(shù)≥3枚。排除標(biāo)準(zhǔn)：①男女雙方合并有心臟、肝臟、腎臟等嚴(yán)重的原發(fā)性疾病者；②生殖器官有腫瘤或者發(fā)育不良者；③有生殖道感染者；④服用嚴(yán)重阻礙生精功能或影響精子活力的抗腫瘤藥物者；⑤嚴(yán)重少精子癥者。所有研究對象均告知并簽署知情同意書，該研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器設(shè)備及檢測試劑 精子頂體酶活性定量檢查試劑盒購自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程公司，CX33型普通光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。HR801型酶標(biāo)儀購置于深圳華科瑞科有限公司，Eppenddorf AG 5424高速離心機(jī)購置于Eppenddorf公司。

1.3 精液樣本采集及常規(guī)檢測分析 納入對象禁欲3-7天，院內(nèi)自慰取精，樣本采集完成后置于37℃溫箱內(nèi)液化，參照《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》（第5版）對精液量、精子濃度、活力和精子形態(tài)進(jìn)行分析[5]。同時留取7.5除以精液濃度乘1000μl新鮮精液量用作精子頂體酶活性檢測。

1.4 精子頂體酶活性檢測用改良Kennedy法按照試劑盒說明書檢測精子頂體酶活性。用酶標(biāo)儀檢測精子頂體酶活性的OD值，用公式計(jì)算精子頂體酶活性：體酶活性（μIU/106精子）=（測定管OD值-空白管OD值）/（247.5×7.5）×106。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。定性資料分析采用卡方檢驗(yàn)，用率（%）表示。定量資料結(jié)果符合正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)，用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。非正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）分析，用秩和檢驗(yàn)作組間對比。用Pearson相關(guān)性分析各參數(shù)與精子受精率的相關(guān)性。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵子受精率相關(guān)因素分析 對納入研究的對象基本信息及精液常規(guī)參數(shù)與卵子受精率展開相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其與男方年齡、女方年齡、精子頂體酶活性及卵子成熟度相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r分別是0.090、0.124、0.096及0.491。與禁欲天數(shù)、精液量、精子濃度、精子前向運(yùn)動（PR）、精子非前向運(yùn)動（NP）、正常形態(tài)率、精子DNA碎片率（DFI）及精子的抗精子抗體（MAR）不相關(guān)（P＞0.5），詳見表1。

表1 卵子受精率與研究對象基本信息及精液參數(shù)的相關(guān)性

2.2 不同精子頂體酶活性定量結(jié)果為參考值時受精率的對比分析 由于本研究中納入對象精子頂體酶活性定量結(jié)果為非正態(tài)分布，試劑盒提供的參考值為48.2μIU/106精子。因此對精子頂體酶活性定量結(jié)果按單位為μIU/106值分別是35.0、42.2、48.2、51.2、51.7、53.8，并按此參考值分組，低于該值者為異常組，高于該值者為正常組。精子頂體酶活性定量結(jié)果按單位為μIU/106值分別是35.0、42.2、48.2、51.2μIU/106時，正常組卵子受精率高于異常組，P值分別是0.018、0.029、0.041、0.048，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精子頂體酶活性定量結(jié)果按單位為μIU/106精子值分別是51.7、53.8μIU/106時，正常組與異常組間受精率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.5）。詳見表2。

表2 不同頂體酶活性參考值頂體酶正常與異常組間受精率的對比分析

2.3 女方年齡大于40歲時，精液基本信息與精子頂體酶活性的相關(guān)性 由于女性年齡40歲是女性生育重要的年齡節(jié)點(diǎn)。本研究中將納入對象女方年齡大于40歲的99對夫妻，按頂體酶活性51.2μIU/106分組，大于51.2μIU/106者為精子頂體酶活性正常組，小于等于者為異常組。對于兩組間精液的量、精子濃度、前向運(yùn)行精子比率（PR）、非前向運(yùn)動精子比率（NP）、不動精子比率（IM）、抗精子抗體比率（MAR法）、精子DNA碎片率（DFI）、精子畸形率、男女雙方年齡等相關(guān)指標(biāo)在精子頂體酶活性正常組與異常組間受精率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.5）。詳見表3。

表3 女方年齡＞40歲頂體酶分組統(tǒng)計(jì)相關(guān)性

3 討論

近年來，隨著社會壓力及競爭力的不斷增加，就業(yè)壓力加大及自然環(huán)境的不斷惡化，不孕不育的發(fā)病率逐年上升。世界衛(wèi)生組織就將不孕不育、腫瘤及心腦血管疾病共同列為21世紀(jì)三大疾病[6]。不孕不育帶給社會和家庭的負(fù)擔(dān)是難以想象的，不僅加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還會給患者帶來很大的心理壓力。目前，不孕不育由單方因素或男女雙方因素造成。根據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示，在不孕不育夫婦中，約有40%-50%為女方因素，25%-40%是男方因素，雙方因素占20%-30%，剩余10%為不明原因[7]。隨著男性不育的患者數(shù)量不斷增加，男性不育因素也受到了社會多方面的廣泛重視。不孕不育的治療除常規(guī)藥物和手術(shù)外，近些年來輔助生殖技術(shù)在臨床上的應(yīng)用，從很大程度上緩解了不孕不育夫婦的痛苦。輔助生殖技術(shù)體外授精方式的選擇要結(jié)合精子濃度、精子形態(tài)和精子活力等多種因素[8]。對于不育癥患者使用精液常規(guī)分析選擇授精方式，常規(guī)IVF治療方案中仍有可能出現(xiàn)低受精或完全不受精的情況。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在常規(guī)IVF中，發(fā)生低受精（包括完全不受精）的比率為3%-5%[9-10]。對此，采取有效方式預(yù)防或避免受精失敗及提高受精率提升IVF的成功率是臨床的重點(diǎn)問題。

在輔助生殖技術(shù)的早期研究[11-12]中發(fā)現(xiàn)精子參數(shù)與受精結(jié)果有較強(qiáng)相關(guān)性，臨床妊娠結(jié)局不受精子常規(guī)參數(shù)的影響，卻與女性配偶的生育狀態(tài)和年齡的相關(guān)性更強(qiáng)。所以本研究排除影響女性懷孕的干擾因素后大大減少入組病例數(shù)，這樣能更好地做好質(zhì)控控制和單因素的分析，將研究重點(diǎn)關(guān)注在精子參數(shù)、頂體酶與受精能力的相關(guān)性上。在此條件下，在本研究中，對納入研究的對象基本信息及精液常規(guī)參數(shù)與卵子受精率進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其與男方年齡、女方年齡、精子頂體酶活性及卵子成熟度相關(guān)。這說明頂體酶是影響受精率的相關(guān)因素。這與趙淑芹[13]的研究亦證明了精子頂體酶活性與IVF受精率呈正相關(guān)性的結(jié)論一致。Henkel[14]等人對114名行IVF治療的男性的精子頂體酶活性與IVF受精率的相關(guān)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)精子的受精潛力與精子頂體酶活性相關(guān)，另外有一些學(xué)者也得出了同樣的結(jié)論[15]。由此可見，精子頂體酶活性在受精過程中起著非常重要的作用。

在本研究中，納入對象精子頂體酶活性定量結(jié)果為非正態(tài)分布，試劑盒提供的參考值為48.2μIU/106。不同實(shí)驗(yàn)室由于儀器設(shè)備及檢驗(yàn)人員的不同，其結(jié)果可能有所偏差。對此，對納入對象的精子頂體酶活性定量結(jié)果進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，由于小于參考值的納入對象為101名，對其按組間間距分3組，其對應(yīng)精子頂體酶活性定量結(jié)果按單位為μIU/106值分別是35.0、42.2、48.2。低于該值者為異常組，高于該值者為正常組。正常組卵子受精率高于異常組，P值分別是0.018、0.029、0.041，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣精子頂體酶活性為51.2μIU/106時，正常組受精率高于異常組（P=0.048）。精子頂體酶活性定量結(jié)果按單位為μIU/106值分別是51.7、53.8μIU/106時，正常組與異常組間受精率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.5）。提示精子頂體酶活性定量結(jié)果51.2μIU/106可能是本實(shí)驗(yàn)室的參考值，這與王金保[16]等人的研究結(jié)果頂體酶正常組受精率高于異常組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但對于頂體酶異常組進(jìn)一步組間間距分組發(fā)現(xiàn)頂體酶小于25μIU/106受精率明顯均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與各實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備及操作人員不同相關(guān)。同時，本研究數(shù)據(jù)樣本量不大，還需進(jìn)一步深入研究。

對于女性年齡大于40歲的夫妻中，筆者發(fā)現(xiàn)在頂體酶正常組與異常組中，在男女雙方年齡、精液常規(guī)參數(shù)、精子DFI、精子形態(tài)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的條件下，兩組間的受精率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這可能與女性年齡是影響生育力及妊娠結(jié)局的獨(dú)立危險因素相關(guān)[17]。這也說明當(dāng)女性年齡大于40歲時，男方的基本精液參數(shù)對于女性受精率的影響參考意義不大。

因此，在輔助生殖助孕的過程中，需要考慮夫妻雙方的情況合理地選擇受精方式，在女性年齡小于40歲時，頂體酶是影響受精率指標(biāo)之一；當(dāng)頂體酶活性＜51.2μIU/106時，可以考慮選擇ICSI的受精方式來助孕。