油橄欖果渣抗氧化部位化學(xué)成分的研究

陳根振， 王蝴蝶， 裴 棟， 黃新異， 邸多隆,3*

( 1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 蘭州 730000； 2. 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所， 中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000； 3. 青島市資源化學(xué)與新材料研究中心， 山東 青島 266000 )

油橄欖()系木犀科木犀欖屬油料植物，是人類最早認(rèn)識(shí)、馴化和種植的油料作物之一。我國自1964年以來，開始陸續(xù)引種油橄欖品種100多個(gè)(張佳等，2013)，現(xiàn)主要在甘肅隴南、云南西北部、四川廣元和達(dá)州等地種植(王著，2012)。橄欖油是“地中海膳食模式”中最重要的組成部分之一，是在常溫下通過純物理方法冷榨提取的果肉油，被譽(yù)為“飄香的軟黃金”(Guo et al., 2018)。

油橄欖果渣是在橄欖油生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其中含有黃酮類(張華玲等，2016)、萜類(Claro-Cala et al., 2020)和酚類(Css et al., 2019；Speroni et al., 2020)等多種化學(xué)成分。據(jù)報(bào)道，每噸油橄欖鮮果經(jīng)榨油后會(huì)產(chǎn)生350～400 kg果渣(蘇瑤等，2021)。油橄欖果渣作為一種生物廢棄物，一般的處理方式是被當(dāng)作肥料和燃料處理，或者被當(dāng)作廢棄物直接丟棄，這些處理方式不但造成了環(huán)境的污染而且忽略了該資源的潛在價(jià)值，不符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)的理念(張華玲等，2016)。如何提高油橄欖果渣的利用率是油橄欖產(chǎn)業(yè)亟須解決的關(guān)鍵性問題。為此，本文以油橄欖果渣為研究對(duì)象，通過DPPH·法評(píng)價(jià)了油橄欖果渣不同提取部位的抗氧化能力，并利用多種柱色譜技術(shù)對(duì)其主要的抗氧化部位的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，分離得到17個(gè)化合物，其中，化合物沒食子酸()、香草酸()、咖啡酸()、丁香酸()和蘆丁()為首次從油橄欖果渣中分離得到，為油橄欖果渣抗氧化活性產(chǎn)品的開發(fā)供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

Agilent 1260制備高效液相色譜儀(G1311A 二元泵，G1315D DAD 檢測器，ChemStation 色譜工作站，美國 Agilent 公司)；中壓制備液相色譜系統(tǒng)(NP7010C 二元泵， NU3000C 檢測器，Easy Chrom-1000色譜工作站，江蘇漢邦科技有限公司)； LC-MS 8050三重四極桿質(zhì)譜儀(日本島津公司)；ULTRA SHIELD 400 plus 核磁共振波譜儀(德國布魯克公司)；高速多功能粉碎機(jī)(SS-1022型，武義海鈉電器有限公司)； UV756紫外-可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限責(zé)任公司)。

Sephadex LH-20填料(美國GE Healthcare公司)；ODS 色譜柱(SinoChrom ODS-BP，4.6 mm × 250 mm，5 μm)；柱色譜用硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；薄層色譜用硅膠板(GF，青島海洋化工廠)；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)(上海麥克林生化科技有限公司)；維生素C(天津市登峰化學(xué)試劑廠)；制備液相所用試劑均為色譜純；提取分離所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

實(shí)驗(yàn)用油橄欖果渣經(jīng)西北師范大學(xué)孫坤教授鑒定為木犀科木犀欖屬油橄欖 ()的果實(shí)經(jīng)冷榨提取果肉油后得到的廢棄物，來自隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司。

1.2 提取和分離

稱取干燥的油橄欖果渣3.85 kg，粉碎，75%乙醇(料液比1∶10)回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得橄欖果渣混懸液。加入適量去離子水后，依次用3倍體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑，分別得到石油醚部位(164.76 g，標(biāo)記為部位A)、乙酸乙酯部位(77.61 g，標(biāo)記為部位B)、正丁醇部位(50.00 g，標(biāo)記為部位C)和水部位(121.20 g，標(biāo)記為部位D)，各部位萃取物分別占干燥油橄欖果渣總重量的4.28%、2.02%、1.30%和3.15%。

1.3 抗氧化活性部位篩選

參考李春愛等(2022)的方法略作調(diào)整，通過DPPH·的清除能力來確定油橄欖果渣不同提取部位的抗氧化活性。步驟如下。(1)0.2 mmol·LDPPH·乙醇溶液的配制：精密稱取 0.039 5 g DPPH·，加入95%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，即得1 mmol·LDPPH·乙醇母液，用時(shí)取10 mL定容至50 mL，即得0.2 mmol·LDPPH·乙醇溶液。(2)樣品溶液的配制：精密稱取油橄欖果渣不同提取部位浸膏0.010 0 g，加入甲醇定容至10 mL，得到1 mg·mL的樣品溶液，并用甲醇稀釋得到5個(gè)質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液，其質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、250 μg·mL。(3)DPPH·清除能力的測定：將2 mL樣品溶液添加到2 mL含0.2 mmol·LDPPH·乙醇溶液中，混合均勻，室溫放置30 min，在517 nm處測定吸光度。

DPPH·清除率 = [1-(-)/] × 100%。

式中：為樣品的吸光度；為參比的吸光度；為空白的吸光度。

表 1 DPPH·清除率的實(shí)驗(yàn)方法Table 1 Experimental methods of DPPH· scavenging rate

1.4 化學(xué)成分分離

取乙酸乙酯部位萃取物(77.61 g)，用少量甲醇溶解，與硅膠拌樣(1∶3)，采用硅膠柱色譜分離。以二氯甲烷-甲醇(比例分別為50∶1、25∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、1∶1)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，使用薄層色譜合并相同的組分，共得到7個(gè)部位，編號(hào)為Fr.1～Fr.7。其中Fr.2(3.1 g)中析出了大量的白色粉末，重結(jié)晶后得到化合物(0.5 g)，F(xiàn)r.2的剩余部分(2.3 g)采用硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(10∶1)溶劑系統(tǒng)洗脫，分別得到化合物(75.1 mg)、(8.4 mg)、(15.3 mg)、(22.7 mg)。Fr.3(1.8 g)經(jīng)制備液相色譜(流動(dòng)相為甲醇和水，0～10 min，甲醇17%；10～20 min，甲醇17%～20%；20～25 min，甲醇20%～30%；25～45 min，甲醇30%～40%；45～60 min，甲醇40%)梯度洗脫，分離得到化合物(8.7 mg)、(10.3 mg)、(9.8 mg)、(23.5 mg)、(7.5 mg)。Fr.4(0.9 g)經(jīng)制備液相色譜(流動(dòng)相為甲醇和水，0～10 min，甲醇20%；10～20 min，甲醇20%～30%；20～30 min，甲醇30%)梯度洗脫，并采用Sephadex LH-20柱色譜(流動(dòng)相為甲醇和水，比例為30∶70)分別純化后得到化合物(9.8 mg)、(10.4 mg)、(7.2 mg)、(9.1 mg)、(10.6 mg)、(6.8 mg)、(8.3 mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性部位篩選結(jié)果

以維生素C(Vc)為陽性對(duì)照，測定油橄欖果渣不同提取部位的DPPH·清除率。結(jié)果如圖1所示，建立的Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線為=1.243 3+0.491 2(=0.995 1)，經(jīng)計(jì)算得Vc的半數(shù)抑制濃度(IC)為12.96 μg·mL。如圖2所示，在測定的樣品質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著樣品質(zhì)量濃度不斷增加，不同提取部位的DPPH·清除率均不斷增加，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。結(jié)果表明，在所測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，油橄欖果渣不同提取部位對(duì)DPPH·均有一定的清除能力，油橄欖果渣的石油醚部位(A)、乙酸乙酯部位(B)、正丁醇部位(C)和水部位(D)對(duì)DPPH·的IC值分別為3 751.45、119.11、415.00、873.07 μg·mL，即各組DPPH·清除率的大小順序?yàn)橐宜嵋阴ゲ课?B)>正丁醇部位(C)>水部位(D)>石油醚部位(A)，故乙酸乙酯部位的抗氧化活性較好。

圖 1 維生素C的DPPH·清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of DPPH· scavenging rate of vitamin C

Vc. 維生素C; A. 石油醚部位; B. 乙酸乙酯部位; C. 正丁醇部位; D. 水部位。Vc. Vitamin C; A. Petroleum ether extract; B. Ethyl acetate extract; C. n-Butanol extract; D. Water extract. 圖 2 油橄欖果渣不同提取部位的DPPH·清除率Fig. 2 DPPH· scavenging rates of different extracts of Olea europaea pomace

2.2 化學(xué)成分結(jié)構(gòu)鑒定

3 討論與結(jié)論

油橄欖果渣是橄欖油加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，其化學(xué)成分以黃酮類、三萜類和苯丙素類化合物居多，具有抗氧化、抗炎、抗菌和降血糖等藥理作用。本文測定了油橄欖果渣中不同提取部位清除DPPH·的能力，結(jié)果表明乙酸乙酯部位具有顯著的抗氧化活性，其DPPH·清除能力的IC值為119.11 μg·mL。在此基礎(chǔ)上，利用多種柱色譜技術(shù)從油橄欖果渣的乙酸乙酯部位中分離得到17個(gè)化合物，并運(yùn)用核磁共振波譜等方法鑒定了化合物的結(jié)構(gòu)。17個(gè)化合物中，黃酮類化合物有5個(gè)、萜類化合物有3個(gè)、苯丙素類化合物有3個(gè)，其含量分別占乙酸乙酯部位的0.09%、0.79%和0.03%。其中，沒食子酸()、香草酸()、咖啡酸()、丁香酸()和蘆丁()為首次從油橄欖果渣中分離得到的化合物。沒食子酸()、咖啡酸()和丁香酸()均具有明顯的抗氧化、抗炎和抗腫瘤等藥理活性(楊九凌等，2013；鄭雪花等，2017； Kahkeshani et al., 2019；dos Santos et al., 2020)。香草酸()不僅具有抗氧化和抗炎的作用，還能抑制血小板聚集(孔令雷等，2020)，尤其對(duì)二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid, AA)和凝血酶(thrombin, THR)誘導(dǎo)引起的血小板聚集具有顯著抑制作用。蘆丁()為一種重要的黃酮類化合物，能夠顯著減弱1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP)誘導(dǎo)的細(xì)胞活力喪失，減輕活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，并抑制抗氧化酶活性的破壞，此外，蘆丁也降低了用 MPP處理的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)中 γH2AX 和COX-2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(Enogieru et al., 2021)。

化合物的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)中羥基的數(shù)量有關(guān)(原姣姣，2016)，如羥基酪醇()的抗氧化活性高于酪醇()。當(dāng)化合物有多個(gè)酚羥基時(shí)，其相對(duì)位置決定了抗氧化活性的強(qiáng)弱，即鄰位 >對(duì)位>間位。苯環(huán)上4位鍵合碳碳雙鍵或其他供電子基團(tuán)，可能通過π-π或p-π共軛體系使化合物結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定從而提高抗氧化活性(Xie et al., 2015)，如咖啡酸()的抗氧化活性高于原兒茶酸()和香草醛()。而黃酮類化合物B環(huán)上3′位和4′位的鄰二酚羥基能顯著提高其抗氧化活性(Zuo et al., 2018)，本文中化合物、、、的結(jié)構(gòu)符合這個(gè)特征。橄欖苦苷()僅存在于木犀科植物中，由三個(gè)結(jié)構(gòu)亞基羥基酪醇、亞麻酸和葡萄糖分子組成，因其具有羥基酪醇的結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的抗氧化活性。綜上，可初步推測油橄欖果渣的抗氧化活性與其中的黃酮類和裂環(huán)烯醚萜類化合物有關(guān)(Liu et al., 2014)。此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Joaquín et al., 2018；Jiménez-Herrera et al., 2019；袁靜等，2021；Tian et al., 2021)，乙酸乙酯部位分離得到的17個(gè)化合物均表現(xiàn)出不同程度的抗氧化能力，證實(shí)了油橄欖果渣具有良好的抗氧化活性。

生物機(jī)體內(nèi)每天不斷產(chǎn)生自由基，過量的自由基造成的氧化損傷對(duì)機(jī)體形成不可避免的傷害，因此，尋找天然的抗氧化劑就顯得至關(guān)重要。油橄欖果渣作為一種生物廢棄物，具有良好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑的原料，如何高效、宏量富集所分離得到的這些化合物，以及如何將其開發(fā)成商品化的天然抗氧化劑，有待于進(jìn)一步系統(tǒng)和深入的研究。此外，本文為今后油橄欖果渣的高值化利用及天然抗氧化劑的開發(fā)提供了一定的參考依據(jù)。