彭志堅(jiān) 陳正濤 鄧 斌 魏山寅 范治力 宋銀枝△

糖尿病心肌損傷(Diabetic heart injury,DMI)是糖尿病主要并發(fā)癥之一，有研究表明在排除了冠心病或風(fēng)濕性心臟病病史后，糖尿病患者的心衰風(fēng)險(xiǎn)仍增加4～5倍，DMI已經(jīng)成為糖尿病患者致死的重要原因之一[1]?！侗窘?jīng)逢原》認(rèn)為：“蘇子性能下氣，故胸膈不利者宜之”，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)紫蘇子提取物能增加糖尿病小鼠的胰島素敏感性和減少氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]，但紫蘇子在治療DMI的保護(hù)作用機(jī)制研究較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)目前被廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)單味中藥或復(fù)方作用機(jī)制，其通過構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-基因-疾病”的分子網(wǎng)絡(luò)闡述中藥生物學(xué)功能和作用機(jī)制的方法與中藥及其復(fù)方的多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)相吻合。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接的方法對(duì)紫蘇子治療DMI的潛在機(jī)制及作用網(wǎng)絡(luò)展開了研究。

1 材料與方法

1.1 紫蘇子主要化學(xué)成分和靶點(diǎn)篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18作為ADME篩選條件收集紫蘇子主要化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)[3，4]，再經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為基因名。

1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選將“Diabetic heart injury”及“Diabetes cardiomyopathy”作為關(guān)鍵詞，從GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索獲得DMI相關(guān)的疾病靶點(diǎn)并刪除重復(fù)基因。

1.3 活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及交集靶點(diǎn)靶蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建紫蘇子和DMI相關(guān)靶點(diǎn)運(yùn)用Venny 2.1.0獲得交集靶點(diǎn)，利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，借助STRING 11.0平臺(tái)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，限定物種為“Homo sapiens”，置信度為中置信度0.4，其余參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置，得到下載tsv格式文件，將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2作圖。應(yīng)用軟件中的cytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行篩選，篩選出Degree值前9個(gè)的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 GO與KEGG通路富集分析將交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)，設(shè)置P<0.01，分析紫蘇子主要的生物學(xué)過程與代謝通路并進(jìn)行富集分析，將數(shù)據(jù)運(yùn)用微生信平臺(tái)進(jìn)行可視化處理。

1.5 分子對(duì)接將紫蘇子核心成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的9個(gè)核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載紫蘇子核心成分的MOL2格式文件，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得9個(gè)核心蛋白的3D結(jié)構(gòu)。利用AutoDockTools 1.5.6和PyMOL 2.3.4軟件關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白質(zhì)進(jìn)行：去除水分子，分離配體和受體，加入極性氫，計(jì)算Gasteiger電荷，分配AD4類型，將小分子配體柔性鍵設(shè)置為可旋轉(zhuǎn)等操作。對(duì)接過程使用AutoDock Vina 1.1.2執(zhí)行，得到結(jié)合能數(shù)據(jù)，最后運(yùn)用PyMOL 2.3.2軟件展示結(jié)合活性最高的模型。

2 結(jié)果

2.1 紫蘇子有效成分和靶點(diǎn)篩選根據(jù)1.1篩選條件共篩選出16個(gè)化合物，剔除預(yù)測(cè)不到靶點(diǎn)的化合物共得到14個(gè)有效成分?？紤]到紫蘇子主要成分為亞麻酸及亞油酸，其中亞麻酸含量高達(dá)50%～62%[5]，故將此二者也納入，最終共篩選出有效成分16個(gè)。見表1。其主要活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因ID名稱，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后共得到139個(gè)有效作用靶點(diǎn)。

表1 紫蘇子活性成分表

2.2 與DMI相關(guān)疾病靶點(diǎn)篩選通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得與DMI相關(guān)的疾病靶點(diǎn)并刪除重復(fù)基因，共得7345個(gè)靶點(diǎn)，取兩倍中位數(shù)后獲得靶點(diǎn)2150個(gè)；通過OMIM數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)584個(gè)。合并上述獲得的疾病靶點(diǎn)，并再次剔除重復(fù)靶點(diǎn)，最終獲得相關(guān)疾病靶點(diǎn)2579個(gè)。

2.3 活性成分交集靶點(diǎn)成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將與DMI相關(guān)的疾病靶點(diǎn)與紫蘇子預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)取交集繪制韋恩圖,得交集靶點(diǎn)105個(gè)(見圖1)。利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(見圖2)，超過14個(gè)靶點(diǎn)的活性成分有木犀草素(Luteolin)、花生四烯酸(Arachidonic acid)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、亞麻酸(Linolenic acid)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-胡蘿卜素(Beta-carotene)，這些成分可能是治療糖尿病心肌損傷的主要有效成分。

圖1 紫蘇子-DMI交集靶點(diǎn)

圖2 活性成分交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建根據(jù)1.3所述方法構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，共有105個(gè)節(jié)點(diǎn)，1500條邊，應(yīng)用軟件中的cytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行篩選，篩選出Degree值大于60的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)9個(gè)。見表2。

表2 紫蘇子治療DMI的核心靶點(diǎn)及degree值

2.5 交集靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析將交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析(見圖3、圖4)。結(jié)果顯示，生物過程主要涉及細(xì)胞氮化合物反應(yīng)、有毒物質(zhì)反應(yīng)、無機(jī)物反應(yīng)、細(xì)胞成分運(yùn)動(dòng)的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)等，細(xì)胞組成中主要影響膜筏、細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域、突觸后膜、受體復(fù)合物、胞質(zhì)泡膜等，分子功能主要包括蛋白質(zhì)域特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚活性、脂質(zhì)結(jié)合、激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面。參與調(diào)控多個(gè)KEGG信號(hào)通路，主要有癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路(見圖5)、前列腺癌、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等。

圖3 交集靶點(diǎn)GO富集分析條形圖交集靶點(diǎn)GO富集分析條形圖

圖4 交集靶點(diǎn)KEGG富集分析氣泡圖

圖5 PI3K-AKT信號(hào)通路圖

2.6 分子對(duì)接將核心成分木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亞麻酸、豆甾醇與核心靶點(diǎn)ALB、AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、CASP3、EGFR進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算核心化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的結(jié)合能以預(yù)測(cè)它們的親和力，結(jié)合能低于0表明2個(gè)分子能夠自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能負(fù)值越高提示構(gòu)象越穩(wěn)定。分子對(duì)接結(jié)果(見表3)核心化合物與靶蛋白的最低結(jié)合能都小于0，說明紫蘇子核心成分能夠很好地與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合，這也一定程度表明了紫蘇子治療DMI的科學(xué)性。綜合分析木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亞麻酸、豆甾醇可能是紫蘇子治療DMI的關(guān)鍵成分，可作為未來紫蘇子單體成分提取用于治療糖尿病心肌病的研究對(duì)象。

表3 紫蘇子活性成分與DMI潛在作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

對(duì)紫蘇子治療DMI的作用網(wǎng)絡(luò)與潛在機(jī)制的研究表明：紫蘇子治療DMI的關(guān)鍵成分可能是木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亞麻酸、豆甾醇。木犀草素能改善DMI，主要是通過逆轉(zhuǎn)心肌組織中AR、NOS及Na+-K+-ATPase活性減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]，及抑制RhoA/ROCK2信號(hào)通路減少糖尿病小鼠心肌細(xì)胞凋亡[7]。β-谷甾醇具有抗炎作用，其機(jī)制是增強(qiáng)機(jī)體氧自由基清除能力[8]，減少NO的合成，抑制巨噬細(xì)胞IL-6活性，減少IL-1、TNF-α等炎性因子的分泌[9]。花生四烯酸能通過調(diào)節(jié)自由基生成、一氧化氮生成、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等調(diào)節(jié)糖尿病的發(fā)病[10]。飲食中亞麻酸具有降壓、調(diào)脂等作用，從而保護(hù)心血管[11，12]。豆甾醇具有GLUT4葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體靶向作用，通過增加GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)改善2型糖尿病[13]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亞麻酸、豆甾醇具有改善DMI的作用，亦有文獻(xiàn)證實(shí)上述5個(gè)單體成分具有改善糖尿病或者具有心血管保護(hù)作用，但目前針對(duì)DMI的相關(guān)研究相對(duì)較少，值得進(jìn)一步研究。

從PPI網(wǎng)絡(luò)圖可發(fā)現(xiàn)ALB、AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、CASP3、EGFR等靶點(diǎn)可能為紫蘇子治療DMI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究表明炎癥反應(yīng)是DCM發(fā)病機(jī)制之一，炎癥小體可能是治療DCM的關(guān)鍵靶點(diǎn)，促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL6等)的上調(diào)會(huì)影響有助于心臟病理性重塑和氧化應(yīng)激的細(xì)胞群，包括心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[14]。EGFR可加速糖尿病性心肌病大鼠心肌纖維化[15]。Akt1能促進(jìn)生理性心肌肥大而抑制病理性心肌肥大[16]。CASP3屬于促凋亡因子，在細(xì)胞凋亡信號(hào)的刺激下參與糖尿病胰島β細(xì)胞的凋亡[17]。VEGFA能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管新生，預(yù)防VEGFA的下調(diào)可維持毛細(xì)血管密度，從而改善糖尿病對(duì)小鼠心臟的損傷[18]。有文獻(xiàn)指出，抑制p53能阻止早期細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老、減少糖酵解和抑制血管生成，進(jìn)而改善糖尿病性心肌病[19]。分子對(duì)接顯示，紫蘇子關(guān)鍵成分與以上關(guān)鍵靶點(diǎn)均能有良好的結(jié)合，說明紫蘇子關(guān)鍵成分和DMI關(guān)鍵靶點(diǎn)有結(jié)合活性。

GO分析顯示紫蘇子治療DMI主要通過細(xì)胞氮化合物反應(yīng)、有毒物質(zhì)反應(yīng)、無機(jī)物反應(yīng)、細(xì)胞成分運(yùn)動(dòng)的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)等生物過程發(fā)揮作用。KEGG信號(hào)通路分析主要集中在癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、前列腺癌、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路等。有研究顯示，糖尿病患者的AGE水平與血管僵硬度、頸動(dòng)脈內(nèi)中膜層厚度成正相關(guān)[20]，AGE/RAGE系統(tǒng)的激活使得促纖維生長因子分泌增多，進(jìn)而膠原沉積導(dǎo)致組織纖維化，導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維成分增多，造成心肌纖維化、心功能障礙等[21]。PI3K/Akt通路信號(hào)通路的表達(dá)增加可以抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，增加胰島素敏感性[22]，而長期攝食亞麻酸能通過激活PI3K-Akt信號(hào)通路有效減輕糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷[23]。GLUT為PI3K/Akt信號(hào)通路的下游信號(hào)靶點(diǎn)，PI3K/Akt信號(hào)通路通過抑制GLUT-4向細(xì)胞膜異位，激活GLUT增加細(xì)胞攝取葡萄糖，降低血漿中葡萄糖的水平，從而減輕糖脂毒性[24]。豆甾醇具有GLUT4葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體靶向作用，可能是通過PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接研究紫蘇子治療DMI的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)中藥紫蘇子通過木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亞麻酸、豆甾醇等藥效成分協(xié)同作用于ALB、AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、CASP3、EGFR等多個(gè)靶點(diǎn)，參與癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、前列腺癌、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等多信號(hào)通路改善DMI，為紫蘇子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究提供方向，為進(jìn)一步系統(tǒng)地開展紫蘇子單體治療糖尿病心肌病的研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。