王開喜，楊耀國(guó)，王永新，馬 春，張亞慧

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，山西 太谷 030801）

達(dá)烏里胡枝子是豆科多年生灌木，營(yíng)養(yǎng)成分高，可制作青干草和優(yōu)質(zhì)青貯飼草料，是良好的水土保持植物和固沙植物[1]。達(dá)烏里胡枝子廣泛分布在我國(guó)的華北、東北和西北等地區(qū)，但這些地區(qū)往往是一些土壤鹽漬化地區(qū)[2]，因此，達(dá)烏里胡枝子生長(zhǎng)時(shí)往往會(huì)遭受到鹽分等逆境脅迫。有研究表明，達(dá)烏里胡枝子在種子萌發(fā)和苗木早期生長(zhǎng)發(fā)育階段均對(duì)鹽分脅迫敏感[3]，在高鹽脅迫下，達(dá)烏里胡枝子種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)、種子強(qiáng)度和發(fā)芽指數(shù)都有明顯的下降；胚芽和胚根的高度和長(zhǎng)度普遍變短[4]。所以，在鹽分脅迫下，胡枝子種子能否正常發(fā)芽是判斷植株在鹽堿環(huán)境能否正常生長(zhǎng)的重要前提條件[5]。為了增加種子的抗逆性，人們通常對(duì)種子進(jìn)行預(yù)處理[6]。所以，通過(guò)研究鹽脅迫條件下增高達(dá)烏里胡枝子種子活力的適宜浸種劑及其適宜的濃度，對(duì)達(dá)烏里胡枝子生產(chǎn)具有重要的實(shí)踐意義。

硫化氫（H2S）是近年來(lái)在野生動(dòng)植物體中發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信息分子，它不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝的調(diào)節(jié)，還可以提高植株對(duì)鹽脅迫[7-8]、干旱脅迫[9]等各種逆境的抵抗[10]。有研究表明，NaHS浸種預(yù)處理能顯著緩解NaCl脅迫（100 mmol/L）對(duì)苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，并且可以提高根部K+/Na+的值，從而增強(qiáng)苜蓿對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)能力[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)，硫氫化鈉能夠有效緩解鹽脅迫造成的水稻生長(zhǎng)抑制，包括能緩解鹽脅迫對(duì)水稻根長(zhǎng)、株高的抑制影響以及鹽脅迫下水稻生物量的減少，并且對(duì)水稻根系的形態(tài)建成有一定影響[12]。劉銳鋒等[13]研究表明，經(jīng)H2S加工過(guò)的麥類種子，在萌芽早期促使細(xì)胞分裂，可以有效促進(jìn)種子的萌發(fā)。李東波等[14]研究表明，經(jīng)0～40 μmol/L濃度的NaHS水溶液浸種過(guò)的豌豆種子進(jìn)行播種，能夠提高其胚根的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)根尖邊緣細(xì)胞的存活率也明顯提高。王燕琴[15]研究表明，利用H2S促使內(nèi)源一氧化氮（NO）的生成來(lái)減緩鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用。鮑敬等[16]研究表明，相當(dāng)含量的外源H2S可以減少NaCl脅迫對(duì)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的控制。對(duì)于外源H2S緩解鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子種子萌發(fā)的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以達(dá)烏里胡枝子為供試材料，通過(guò)直接用NaCl模擬鹽分脅迫抑制種子萌發(fā)，深入探究各種H2S濃度處理對(duì)鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，旨在為研究外源H2S在達(dá)烏里胡枝子耐逆培育中的合理使用提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為晉農(nóng)1號(hào)達(dá)烏里胡枝子，現(xiàn)儲(chǔ)存在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院的種質(zhì)資源庫(kù)中。H2S的供體是硫氫化鈉。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2021年6月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)牧站草學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.2.1 鹽分脅迫的半致死濃度 選取籽粒飽滿、圓潤(rùn)均一且整齊健壯的達(dá)烏里胡枝子種子，用1%的次氯酸鈉消毒滅菌10 min，蒸餾水清洗3遍后干燥備用。以NaCl水溶液模擬鹽分的脅迫，把種子擺放在墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，分別加0、25、50、75、100、125、150、175、200 mmol/L NaCl溶 液4 mL（分別標(biāo)記為Y0、Y25、Y50、Y75、Y100、Y125、Y150、Y175和Y200）。將培養(yǎng)皿放置于人工氣候箱（RCL-P1000）中，發(fā)芽溫度要求（25±2）℃，光/暗（16 h/8 h）交替培育，并且每天定量補(bǔ)充水分，保持培養(yǎng)皿中鹽含量的相對(duì)穩(wěn)定。每個(gè)處理50粒種子，每個(gè)處理4次重復(fù)。

1.2.2 NaHS處理達(dá)烏里胡枝子種子 種子的萌發(fā)試驗(yàn)采用紙上發(fā)芽法完成。胡枝子種子消毒滅菌10 min，蒸餾水沖洗3遍，干燥后備用。設(shè)7個(gè)NaHS處理即0、25、50、100、200、400、800 μmol/L NaHS溶液（分別記為CKP（進(jìn)行鹽脅迫）、T25、T50、T100、T200、T400和T800），在常溫及黑暗條件下浸種18 h，對(duì)照組（CKT，不進(jìn)行鹽脅迫）用蒸餾水浸種18 h。分別選籽粒飽滿、圓潤(rùn)均一且用不同濃度NaHS溶液浸種過(guò)的達(dá)烏里胡枝子種子50粒，擺入150 mmol/L NaCl溶液完全浸透的墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱溫度（25±2）℃，光/暗（16 h/8 h）交替培育，進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)10 d，每天定量補(bǔ)充水分。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

發(fā)芽期間每天記錄種子的萌發(fā)數(shù)量，以胚根突破2 mm為標(biāo)準(zhǔn)；試驗(yàn)進(jìn)行第5天開始計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，第10天統(tǒng)計(jì)并計(jì)算發(fā)芽率，共記錄10 d[17]。第10天完成發(fā)芽試驗(yàn)后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取有代表性幼苗10株，用游標(biāo)卡尺測(cè)量根長(zhǎng)和苗高，然后分別算平均高度；再?gòu)拿總€(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取代表性幼苗10株，用電子天平稱量新鮮質(zhì)量，然后完全浸入蒸餾水中6 h，稱量飽和鮮質(zhì)量，后在電熱恒溫干燥箱中105℃殺青30 min，在65℃下烘干至恒質(zhì)量，用電子天平稱量干質(zhì)量。

式中，Dn為發(fā)芽天數(shù)；n為每天新發(fā)芽的相應(yīng)數(shù)量。

相對(duì)含水量=（鮮質(zhì)量—干質(zhì)量）/飽和鮮質(zhì)

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007應(yīng)用軟件開展大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 22.0應(yīng)用軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），用Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 達(dá)烏里胡枝子種子鹽脅迫的半致死濃度分析

由圖1可知，由于NaCl含量的增加，達(dá)烏里胡枝子種子的發(fā)芽率呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)NaCl濃度上升到25 mmol/L時(shí)，相比于Y0，有上升的態(tài)勢(shì)，表明了在0～25 mmol/L NaCl濃度處理下，能促進(jìn)達(dá)烏里胡枝子種子的萌發(fā)。當(dāng)NaCl濃度超過(guò)25 mmol/L時(shí)，種子萌發(fā)速率呈減少趨勢(shì)。150 mmol/L NaCl處理下的達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽率約為Y0的1/2。因此，鹽脅迫半致死濃度150 mmol/L NaCl作為達(dá)烏里胡枝子種子萌發(fā)的鹽脅迫濃度。

圖1 鹽脅迫對(duì)達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of salt stress on germination percentage of seeds of Lespedeza davurica

2.2 外源NaHS浸種對(duì)鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

不同濃度NaHS浸種預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子種子的萌發(fā)具有不同程度的影響。從圖2可以看出，用NaHS浸種后達(dá)烏里胡枝子種子的發(fā)芽率相對(duì)于CKP均有所提高。在150 mmol/L NaCl脅迫下，50 μmol/L的NaHS可使達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽率達(dá)到最高，為78.87%；而高濃度（800 μmol/L）NaHS的處理效果最差，發(fā)芽率僅為46.43%，略高于CKP，且差別不明顯。與CKP相比，同等施用濃度的NaHS處理均能提高種子的發(fā)芽率，大部分處理組合的發(fā)芽率顯著升高（P＜0.05），以50 μmol/L NaHS處理效果最佳。

圖2 外源H2S對(duì)鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響Fig.2 Effect of exogenous H2S on germination potential and germination percentage of seeds of Lespedeza davurica under salt stress

在150 mmol/L NaCl脅迫下達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽勢(shì)顯著降低，是沒有鹽脅迫CKT處理的50.23%（P＜0.05）。不同濃度NaHS處理減緩了鹽脅迫對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)的影響；且隨NaHS濃度的增加，達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽勢(shì)呈先升高后降低的趨勢(shì)。50 μmol/L NaHS處理的種子發(fā)芽勢(shì)最高，和CKT最為相近。25、50、100、200、400 μmol/L NaHS處理都顯著緩解了鹽脅迫對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)的影響，都與CKP之 間 差 異 顯 著（P＜0.05），800 μmol/L NaHS處理的發(fā)芽勢(shì)最低，且與CKP相比沒有顯著差異（P＞0.05）。可以看出，50 μmol/L NaHS處理顯著緩解了鹽脅迫對(duì)達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽勢(shì)的影響（P＜0.05），較CKP增加了34.07%。

2.3 外源NaHS浸種對(duì)鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時(shí)間的影響

由圖3可知，經(jīng)適宜濃度NaHS浸種后的達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽指數(shù)均顯著高于對(duì)照組CKP（P＜0.05）。在脅迫條件下，50 μmol/L NaHS處理的種子發(fā)芽指數(shù)達(dá)到最高，比對(duì)照組CKP提高了37.54%；當(dāng)NaHS濃度為400～800 μmol/L時(shí)，各處理間發(fā)芽指數(shù)與CKT相比差異不顯著。在強(qiáng)脅迫條件下，隨著NaHS濃度增加，種子發(fā)芽指數(shù)呈前升高后降低的趨勢(shì)，且均超過(guò)了對(duì)照組CKP，當(dāng)NaHS濃度為50 μmol/L時(shí)，其發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照組CKP差異最突出（P＜0.05），當(dāng)NaHS濃度為25、100、200 μmol/L時(shí)，其發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照CKP差別顯著（P＜0.05）。400、800 μmol/L NaHS處理的發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照CKP差異不顯著。說(shuō)明25、50、100、200 μmol/L NaHS均能不同程度地增高種子的發(fā)芽指數(shù)，且50 μmol/L NaHS處理效果最好。

圖3 外源H2S對(duì)鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時(shí)間的影響Fig.3 Effects of exogenous H2S on germination index and average germination time of seeds of Lespedeza davurica under salt stress

在鹽脅迫條件下，經(jīng)不同濃度NaHS處理后，達(dá)烏里胡枝子種子平均發(fā)芽時(shí)間與對(duì)照組CKP相比均縮短，與CKP差異顯著（P＜0.05），在25～800 μmol/L NaHS處理下，T25～T800處理間差異不顯著，說(shuō)明在不同濃度NaHS處理下達(dá)烏里胡枝子的發(fā)芽時(shí)間基本一致；與CKP相比，NaHS處理的濃度范圍內(nèi)均縮短了發(fā)芽時(shí)間。

2.4 外源NaHS浸種對(duì)鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗相對(duì)含水量的影響

鹽分脅迫下，添加NaHS可提高達(dá)烏里胡枝子幼苗的相對(duì)含水量。從圖4可以看出，在150 mmol/L鹽脅迫下50 μmol/L NaHS處理下的相對(duì)含水量最高，為78.56%，與對(duì)照組（CKP）差異顯著（P＜0.05），800 μmol/L NaHS處理下效果最差。不同濃度NaHS處理下，其相對(duì)含水量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)；T25和T100～T400處理下與對(duì)照組CKP相比差異顯著（P＜0.05）；T800處理與對(duì)照組CKP間差異不顯著，說(shuō)明在25～400 μmol/L NaHS濃度內(nèi)都顯著提高了達(dá)烏里胡枝子相對(duì)含水量，且以50 μmol/L NaHS處理效果最好。

圖4 外源H2S對(duì)鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗相對(duì)含水量的影響Fig.4 Effects of exogenous H2S on relative water content of Lespedeza davurica seedlings under salt stress

2.5 外源NaHS浸種對(duì)鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗苗高和根長(zhǎng)的影響

由圖5可知，一定濃度NaHS可以提高達(dá)烏里胡枝子在鹽脅迫下的苗高和根長(zhǎng)。在鹽脅迫條件下，經(jīng)25、50、100 μmol/L NaHS處理后，達(dá)烏里胡枝子幼苗高度和根長(zhǎng)與對(duì)照組CKP相比均差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)NaHS濃度為25～100 μmol/L，幼苗高度比對(duì)照組CKP分別提高了15.24%、23.16%和16.37%（P＜0.05），幼苗根長(zhǎng)比對(duì)照組CKP分別提高了11.64%、15.80%和13.17%；當(dāng)NaHS濃度為200～800 μmol/L時(shí)，幼苗高度和根長(zhǎng)與對(duì)照組CKP差異不顯著。因此，200～800 μmol/L NaHS浸種效果不佳；25～100 μmol/L NaHS浸種效果較明顯，且50 μmol/L NaHS效果最明顯。

圖5 外源H2S對(duì)鹽脅迫下達(dá)烏里胡枝子幼苗苗高和根長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of exogenous H2S on seedling height and root length of Lespedeza davurica seedlings under salt stress

3 結(jié)論與討論

鹽分脅迫會(huì)不斷轉(zhuǎn)變?yōu)闈B透脅迫，影響活性氧代謝的同時(shí)也不斷使植株體內(nèi)離子失衡，使植株機(jī)體內(nèi)部的水分不能正常的保持，細(xì)胞膜透性的功能與結(jié)構(gòu)不斷遭到破壞，阻止植株的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，最終導(dǎo)致死亡[18]。在本試驗(yàn)中，針對(duì)不同濃度NaCl處理對(duì)達(dá)烏里胡枝子種子產(chǎn)生相應(yīng)的萌發(fā)機(jī)制可知，150 mmol/L NaCl脅迫的發(fā)芽率約為Y0的1/2（半致死濃度），因此，本試驗(yàn)選擇了150 mmol/L作為本試驗(yàn)的脅迫濃度。

有研究表明，外源H2S可以有效減緩鹽脅迫，它是一種氣體信號(hào)分子，可以提高植物對(duì)環(huán)境的耐受能力[19]。本試驗(yàn)通過(guò)外源NaHS濃度倍增的方式來(lái)減緩達(dá)烏里胡枝子種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)在鹽脅迫下的危害。發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)反映出了種子萌發(fā)的同步程度和均勻程度[20]。本研究表明，不同濃度外源H2S處理在鹽脅迫下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)存在差異，與CKT相比，鹽脅迫后的達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)差異顯著并明顯下降；將種子經(jīng)過(guò)NaHS浸種預(yù)處理之后，達(dá)烏里胡枝子種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均有不同程度的提高，25～400 μmol/L NaHS處理組的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均顯著高于鹽脅迫下沒有經(jīng)H2S的處理組，說(shuō)明低濃度的外源硫化氫對(duì)達(dá)烏里胡枝子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)有促進(jìn)作用，而高濃度800 μmol/L NaHS處理促進(jìn)作用不明顯，其中以50 μmol/L NaHS浸種預(yù)處理效果最好，也進(jìn)一步說(shuō)明低濃度的硫化氫可能促進(jìn)種子內(nèi)部某種酶的活性或者提高了某種物質(zhì)的含量，還需要進(jìn)一步的研究。這與外源H2S可以促進(jìn)鹽脅迫下西葫蘆發(fā)芽的事實(shí)相符合[21]。

胡枝子種子的發(fā)芽指數(shù)與平均發(fā)芽時(shí)間綜合反映出了種子的生命力與萌發(fā)速率，是種子活力的大小和耐性的體現(xiàn)[22-23]。劉建新等[10]研究指出，外源H2S可以有效減緩鹽分脅迫，從而提高裸燕麥種子的發(fā)芽指數(shù)，減少了平均發(fā)芽時(shí)間。本試驗(yàn)的研究結(jié)論也與此相符，不同外源H2S處理對(duì)種子的發(fā)芽指數(shù)影響差別明顯，與CKT相比，150 mmol/L NaCl濃度下達(dá)烏里胡枝子種子的發(fā)芽指數(shù)顯著降低，平均發(fā)芽時(shí)間延長(zhǎng)，且經(jīng)NaHS浸種處理后，與CKP相比，T25～T200處理下的達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽指數(shù)顯著提高。說(shuō)明硫化氫緩解鹽脅迫的效果不僅與硫氫化鈉濃度有關(guān)，也產(chǎn)生相應(yīng)的劑量效應(yīng)機(jī)制。T25～T800處理則大大縮短了平均發(fā)芽時(shí)間，且無(wú)差異性。這可能是由于外源硫化氫在沒有濃度劑量效應(yīng)的前提下，與鹽脅迫抗衡，觸發(fā)某種機(jī)制，縮短了平均發(fā)芽時(shí)間，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)論證。

胡枝子幼苗的相對(duì)含水量反映了植株體內(nèi)水分的多少，會(huì)因鹽脅迫的抑制而減少[24]，從而引起滲透脅迫。本研究表明，與CKT相比，鹽脅迫下未經(jīng)H2S處理的達(dá)烏里胡枝子幼苗相對(duì)含水量顯著下降（CKP），而用不同H2S處理后，T25～T200 H2S處理組均高于CKP且差異顯著，并且不同程度地提高了達(dá)烏里胡枝子幼苗的相對(duì)含水量，T50處理最佳。這與符姿[25]研究外源H2S和NO可以提高鹽脅迫下葦狀羊茅幼苗的相對(duì)含水量研究結(jié)論相同，說(shuō)明經(jīng)過(guò)一定濃度H2S處理后，達(dá)烏里胡枝子幼苗可以維持相當(dāng)?shù)乃?，減緩鹽脅迫的抑制并促進(jìn)達(dá)烏里胡枝子幼苗正常的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖。

苗高和根長(zhǎng)在種子萌發(fā)過(guò)程中扮演著極其重要的角色，它們是反映幼苗生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖情況的重要衡量標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)表明，150 mmol/L NaCl處理后的種子幼苗苗高和根長(zhǎng)都顯著下降，25、50、100 μmol/L NaHS處理可顯著緩解鹽脅迫對(duì)苗高和根長(zhǎng)的傷害。李東波等[14]研究表明，經(jīng)0～40 μmol/L NaHS溶液浸種后，可以促進(jìn)豌豆胚根的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，根尖細(xì)胞存活率也顯著提高；劉銳鋒等[13]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)50 μmol/L NaHS處理過(guò)的小麥種子，在萌發(fā)早期促進(jìn)細(xì)胞分裂，可以有效促進(jìn)種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果與之相似，以50 μmol/L NaHS處理效果最佳。說(shuō)明鹽脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)具有抑制作用，表現(xiàn)為一系列代謝生理活動(dòng)的變化最終形成外部形態(tài)的變化。但一系列的代謝生理活動(dòng)需要后續(xù)的研究來(lái)支撐外部形態(tài)建成的變化。本試驗(yàn)也進(jìn)一步說(shuō)明硫化氫緩解鹽脅迫的效果不僅與硫氫化鈉濃度有關(guān)，也產(chǎn)生相應(yīng)的劑量效應(yīng)機(jī)制。

本研究表明，在25～100 μmol/L NaHS浸種中均可以不同程度地減緩由150 mmol/L NaCl引起的達(dá)烏里胡枝子種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時(shí)間、相對(duì)含水量、根長(zhǎng)和苗高產(chǎn)生的抑制作用，其中，50 μmol/L NaHS浸種預(yù)處理效果最佳。