國(guó)家東南區(qū)鮮食糯玉米品質(zhì)及農(nóng)藝性狀與SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析

仇律雯， 楊 揚(yáng)， 范亞明， 田紅麗， 易紅梅， 王 璐， 任 潔， 葛建镕， 王鳳格， 陸大雷

(1.江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省作物栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心/玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097)

糯玉米別稱黏玉米、蠟質(zhì)玉米，籽粒中支鏈淀粉含量接近100%，可在乳熟期收獲果穗用于鮮食，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿薮?，是近年來我?guó)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、貫徹落實(shí)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略、拉動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的首選作物。我國(guó)作為世界上糯玉米種植面積最大的國(guó)家，對(duì)糯玉米的規(guī)劃和發(fā)展尤為重視，主要表現(xiàn)在以下方面：2000年，糯玉米作為鮮食玉米納入國(guó)家品種管理，其選育品種開始參加國(guó)家級(jí)鮮食玉米區(qū)域試驗(yàn)；2008年，全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心品種管理處對(duì)鮮食玉米品種區(qū)域試驗(yàn)進(jìn)行了改革完善，將我國(guó)糯玉米種植區(qū)域劃分為東南、西南、東華北、黃淮海4個(gè)大區(qū)。東南區(qū)由于氣候適宜、經(jīng)濟(jì)較為發(fā)達(dá)、當(dāng)?shù)鼐用裣彩撑从衩椎仍蛞恢笔菂⒃嚻贩N數(shù)量最多的區(qū)域。隨著人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的變化，人們對(duì)于鮮食糯玉米營(yíng)養(yǎng)、口感的要求也在不斷提高，使得選育和推廣產(chǎn)量合格、品質(zhì)達(dá)標(biāo)的鮮食糯玉米新品種成為東南地區(qū)糯玉米產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。區(qū)域試驗(yàn)是新品種選育和推廣的重要環(huán)節(jié)，參試品種代表了糯玉米的育種動(dòng)向和選育水平，應(yīng)用分子標(biāo)記、形態(tài)學(xué)標(biāo)記分析東南地區(qū)鮮食糯玉米參試材料的遺傳多樣性，探索不同遺傳背景下糯玉米農(nóng)藝、品質(zhì)性狀差異對(duì)于該地區(qū)鮮食糯玉米產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀是形態(tài)學(xué)標(biāo)記的重要組成部分，其中農(nóng)藝性狀是玉米區(qū)域試驗(yàn)中衡量參試樣品是否能在相應(yīng)區(qū)域種植的主要指標(biāo)；由于鮮食特用玉米的需求，糯玉米的籽粒品質(zhì)在品種評(píng)價(jià)中同樣占有舉足輕重的地位。目前常用的分子標(biāo)記有簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)標(biāo)記，其中SSR標(biāo)記靈敏度高、重復(fù)性強(qiáng)，能夠在品種間穩(wěn)定遺傳，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于玉米、水稻、小麥等作物的遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建。基于SSR標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析，同時(shí)結(jié)合具有代表性的優(yōu)良品種能夠準(zhǔn)確劃分組群，了解樣品的遺傳背景，反映樣品間的遺傳差異。糯玉米屬于異花授粉作物，是雜種優(yōu)勢(shì)利用的典型，其雜交種的遺傳背景主要取決于雜優(yōu)模式中親本的遺傳組成。雜優(yōu)模式不同使得親本間的遺傳差異較大，使得選育出的品種表現(xiàn)出不同的遺傳背景。胡俏強(qiáng)等利用玉米50 K芯片將90份鮮食玉米資源劃分為4個(gè)不同遺傳背景的類群，并依此分析了溫-熱帶雜優(yōu)模式的農(nóng)藝、品質(zhì)和抗性特點(diǎn)，為鮮食玉米品種選育提供了新方向。在雜交種方面，韓晴等基于SSR標(biāo)記將50個(gè)糯玉米品種劃分為3個(gè)主要類群，并分析了每個(gè)類群的品質(zhì)、農(nóng)藝性狀的變異程度，為糯玉米新品種的改良提供了基礎(chǔ)。目前針對(duì)糯玉米品質(zhì)及農(nóng)藝性狀與SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析多以某一省份為分析單元，同時(shí)對(duì)多個(gè)省份糯玉米材料進(jìn)行多樣性研究的報(bào)道甚少，對(duì)東南區(qū)鮮食糯玉米參試品種的雜優(yōu)模式和相關(guān)農(nóng)藝、品質(zhì)性狀的研究尚未見報(bào)道。

本研究以2018年、2019年國(guó)家東南區(qū)糯玉米參試品種為材料，通過形態(tài)學(xué)標(biāo)記、分子標(biāo)記探究東南區(qū)糯玉米品種在不同遺傳背景下品質(zhì)、農(nóng)藝性狀的差異，以期為今后全面了解東南區(qū)糯玉米不同雜優(yōu)模式所育成品種的農(nóng)藝、品質(zhì)性狀特點(diǎn)提供參考，對(duì)相應(yīng)地區(qū)糯玉米新品種改良及資源高效利用具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的41份材料為2018年、2019年參加國(guó)家東南區(qū)鮮食玉米區(qū)域試驗(yàn)的糯玉米區(qū)試品種，其中形態(tài)學(xué)標(biāo)記對(duì)照為蘇玉糯5號(hào)，分子標(biāo)記定標(biāo)品種為當(dāng)前具有廣泛代表性的對(duì)照品種或大面積推廣的品種，分別為蘇玉糯5號(hào)、京科糯2000、渝糯7號(hào)和鄭黃糯2號(hào)。

1.2 農(nóng)藝與品質(zhì)性狀及其測(cè)定

農(nóng)藝性狀包括株高、穗長(zhǎng)、穗行數(shù)、千粒鮮質(zhì)量、出籽率、產(chǎn)量等6個(gè)參數(shù)，相關(guān)數(shù)據(jù)均來自國(guó)家東南區(qū)鮮食玉米區(qū)域試驗(yàn)江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)點(diǎn)區(qū)試報(bào)告。

品質(zhì)性狀包括籽粒淀粉含量、直鏈淀粉含量、皮渣率、含水率、蛋白質(zhì)含量和淀粉糊化溫度。其中淀粉含量按照GB 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉測(cè)定法》用蒽酮比色法測(cè)定，直鏈淀粉含量參照GB 7648—1987《水稻、玉米、谷子籽粒直鏈淀粉測(cè)定法》測(cè)定。皮渣率參考農(nóng)業(yè)農(nóng)村部試行方法進(jìn)行測(cè)定。含水率=(百粒鮮質(zhì)量-百粒干質(zhì)量)/百粒鮮質(zhì)量×100%。利用凱氏定氮法測(cè)定籽粒氮含量(蛋白質(zhì)含量=氮含量×6.25)。糊化溫度相關(guān)測(cè)定方法見文獻(xiàn)[18]。

1.3 SSR標(biāo)記的選擇及其試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA的提取 采用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取供試材料的基因組DNA，用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的質(zhì)量和濃度，并根據(jù)測(cè)量值將工作液濃度調(diào)至200 ng/μL。

1.3.2 SSR標(biāo)記的選擇 本研究選用的40個(gè)SSR標(biāo)記為中國(guó)玉米審定品種標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋庫(kù)建庫(kù)標(biāo)記，引物名稱、參數(shù)等具體信息見文獻(xiàn)[19]。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及熒光毛細(xì)管電泳 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中包括2 μL DNA模板、0.25 μL引物、10 μL 2×Plus Master Mix和7.75 μL ddHO。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存。

采用10重PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)的方法，將10對(duì)PCR產(chǎn)物混合后取2 μL于96孔電泳板中，加入 10 μL 去離子甲酰胺、0.2 μL GS3730-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)，置于PCR儀器中于95 ℃變性5 min，將變性后所得產(chǎn)物離心(2 000 r/min，30 s)后置于ABI3730XL DNA分析儀上進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳，預(yù)電泳時(shí)間為2 min，電壓為15 kV，電泳時(shí)間為 20 min，電壓為15 kV。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016統(tǒng)計(jì)分析12個(gè)農(nóng)藝及品質(zhì)性狀數(shù)據(jù)的最大值、最小值、平均值、變異系數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)。Simpson多樣性指數(shù)計(jì)算公式見文獻(xiàn)[20]。在SPSS 25中采用非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)聚類各組農(nóng)藝及品質(zhì)性狀進(jìn)行差異性分析。用ABI3730XL DNA分析儀上自帶的Date Collection V1.0軟件收集電泳后的原始數(shù)據(jù)并形成FSA文件，用SSR Analyser V1.2.4指紋分析器對(duì)FSA文件進(jìn)行基因分型分析。使用PowerMarker V3.25軟件統(tǒng)計(jì)41份糯玉米材料的等位變異數(shù)、基因型數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)等信息，同時(shí)計(jì)算材料間的Rogers 1972遺傳距離，得到非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)聚類結(jié)果，并用EvolView V 2.0軟件對(duì)聚類結(jié)果進(jìn)行修飾，得到UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料的遺傳多樣性分析

2.1.1 品質(zhì)及農(nóng)藝性狀多樣性分析 對(duì)41份糯玉米材料的12個(gè)農(nóng)藝及品質(zhì)性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由表1可知，不同糯玉米材料的形態(tài)學(xué)標(biāo)記存在差異，12個(gè)性狀的變異系數(shù)在1.72%～36.10%間變化，平均值為14.06%。6個(gè)農(nóng)藝性狀中千粒鮮質(zhì)量的變異系數(shù)最大，為12.01%；出籽率的變異系數(shù)最低，為5.28%。6個(gè)籽粒品質(zhì)性狀中直鏈淀粉的變異系數(shù)最高，為36.10%；糊化溫度的變異系數(shù)最低，為1.72%。12個(gè)性狀的Simpson指數(shù)在0.69～0.83之間，平均值為0.78，其中含水率和產(chǎn)量的Simpson指數(shù)最高，為0.83。由描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，41份供試材料的表型性狀多樣性較高。

表1 41份糯玉米材料的農(nóng)藝、品質(zhì)性狀描述

2.1.2 SSR標(biāo)記基因多樣性和多態(tài)性分析 41份糯玉米材料在40個(gè)SSR標(biāo)記上共檢測(cè)出321個(gè)等位基因，平均每個(gè)SSR標(biāo)記檢測(cè)出8.025個(gè)等位基因。由表2可以看出，40個(gè)SSR標(biāo)記的基因多樣性在0.186～0.877之間，平均值為0.687；PIC值在0.179～0.866之間，平均值為0.658。引物P18擴(kuò)增產(chǎn)物的基因多樣性和PIC值均最低，引物P40擴(kuò)增產(chǎn)物的基因多樣性、PIC值均最高。在40個(gè)SSR標(biāo)記中，PIC值>0.5的高多態(tài)性標(biāo)記達(dá)36個(gè)，占全部標(biāo)記數(shù)的90%，表明本研究所選標(biāo)記能夠有效反映供試材料的遺傳多樣性信息。

表2 40個(gè)SSR標(biāo)記的多態(tài)性信息

2.2 參試材料的遺傳背景分析

由圖1可知，基于Rogers1972遺傳距離矩陣將45份供試材料分為4個(gè)大組，在系統(tǒng)發(fā)生樹上用不同顏色的線條標(biāo)志4個(gè)聚類分組，以京科糯2000為代表的第Ⅰ組材料數(shù)量最多，共有20份，占供試材料總數(shù)的44.4%；第Ⅱ組以蘇玉糯5號(hào)為代表，共有12份材料；以鄭黃糯2號(hào)為代表的第Ⅲ組材料數(shù)量最少，只有6份；有7份材料被分在第Ⅳ組，組內(nèi)代表品種為彩甜糯6號(hào)。

2.3 不同遺傳背景下糯玉米的農(nóng)藝及品質(zhì)性狀分析

分析各個(gè)聚類分組的形態(tài)學(xué)標(biāo)記特點(diǎn)可知，在產(chǎn)量性狀方面，聚類Ⅰ組的產(chǎn)量、千粒鮮質(zhì)量分別為14 354.19 kg/hm、433.39 g，其均值高于另外3個(gè)組別。在籽粒品質(zhì)方面，4個(gè)聚類分組的含水率均值為59.56%～63.79%，直鏈淀粉含量的均值為2.28%～3.04%，皮渣率的均值變化幅度較小，其中聚類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的皮渣率均在10%左右。為了探究不同遺傳背景下糯玉米材料在農(nóng)藝、 品質(zhì)性狀上是否存在顯著差異，對(duì)聚類各組的形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。表3結(jié)果表明，12個(gè)農(nóng)藝、品質(zhì)性狀中有3項(xiàng)指標(biāo)在組間存在顯著差異，分別為株高、千粒鮮質(zhì)量和含水率。聚類Ⅰ組的千粒鮮質(zhì)量、含水率高于其他組，株高較低；聚類Ⅱ組的含水率、株高較低，千粒鮮質(zhì)量較高；聚類Ⅲ組的千粒鮮質(zhì)量低于其他組，含水率、株高表現(xiàn)為平均水平；聚類Ⅳ組的株高較高，含水率在4個(gè)組中較為居中，千粒鮮質(zhì)量較低。將組間存在顯著性差異的3項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后標(biāo)注在系統(tǒng)發(fā)生樹末端，以圓形面積代表指標(biāo)的數(shù)值，面積越大表示數(shù)值越高，詳見圖1，并觀察面積差異最大的2組，發(fā)現(xiàn)各項(xiàng)指標(biāo)的標(biāo)注結(jié)果與非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果一致。

表3 4個(gè)聚類分組的農(nóng)藝、品質(zhì)性狀非參數(shù)秩和檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性作為生物多樣性的最重要來源，是物種多樣性的基礎(chǔ)。形態(tài)學(xué)標(biāo)記、分子標(biāo)記是研究物種遺傳多樣性的2個(gè)主要標(biāo)記，利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記來檢測(cè)作物的表型變異簡(jiǎn)單易行，可以直觀地展示品種特點(diǎn)。與形態(tài)學(xué)標(biāo)記相比，分子標(biāo)記排除了環(huán)境和人為因素影響，同時(shí)在品種間穩(wěn)定遺傳，能夠準(zhǔn)確反映樣品間的遺傳差異。本研究利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記研究國(guó)家東南區(qū)鮮食糯玉米區(qū)試材料的遺傳多樣性特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其有豐富的農(nóng)藝、品質(zhì)性狀變異和SSR標(biāo)記基因多樣性。與陸大雷等于2002—2014年關(guān)于東南區(qū)參試材料的研究結(jié)果相比，本研究所選材料在產(chǎn)量、出籽率和千粒鮮質(zhì)量3個(gè)指標(biāo)上有所提升。與王鳳格等在2004—2009年進(jìn)行的鮮食玉米區(qū)試結(jié)果相比，本研究所選材料的等位基因數(shù)目、PIC值均有所提高。由此可見，隨著育種技術(shù)的發(fā)展和雜優(yōu)模式的創(chuàng)新，糯玉米的部分農(nóng)藝指標(biāo)在逐漸提優(yōu)，在分子層面上也表現(xiàn)出越來越豐富的遺傳變異。與楊揚(yáng)等在2012—2019年進(jìn)行的東南區(qū)糯玉米審定試驗(yàn)結(jié)果相比，本研究所選區(qū)試材料的PIC值、基因多樣性無較大變化，兩者的地理來源、育成年份高度相關(guān)，從側(cè)面驗(yàn)證了本研究SSR標(biāo)記結(jié)果的可靠性。

聚類分析結(jié)合代表性品種能夠明晰供試材料的遺傳背景，判斷材料間的親緣遠(yuǎn)近。劉少榮等利用5個(gè)國(guó)家級(jí)區(qū)域試驗(yàn)對(duì)照品種、2個(gè)大面積推廣品種作為代表樣品，將2002—2020年通過審定的青貯玉米劃分為5個(gè)大組。楊揚(yáng)等利用8個(gè)當(dāng)前糯玉米區(qū)試對(duì)照品種和大面積推廣品種分析了近10年來糯玉米審定品種的年份和地域特征。盧媛等在分析糯玉米自交系SSR標(biāo)記遺傳多樣性時(shí)，也加入了4份與自交系材料相關(guān)的雜交種作為內(nèi)參，用以驗(yàn)證其結(jié)果合理可靠。本研究以京科糯2000、蘇玉糯5號(hào)、彩甜糯6號(hào)和鄭黃糯2號(hào)為代表品種，對(duì)東南區(qū)41份糯玉米區(qū)試材料進(jìn)行聚類分析，將其劃分為4個(gè)遺傳背景不同的組群。根據(jù)每個(gè)組群材料數(shù)量推測(cè)，目前東南地區(qū)糯玉米雜優(yōu)模式以京科糯2000為代表的京糯6×BN2為主，該雜優(yōu)方法創(chuàng)新并建立了硬粒型×馬齒粉質(zhì)型雜交選育模式，隨著京科糯2000的推廣而逐漸被各個(gè)育種單位和育種家借鑒。其次是以蘇玉糯5號(hào)為代表的組群Ⅱ，對(duì)應(yīng)的通系5類群×衡白522類群雜優(yōu)模式在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)都是東南區(qū)江蘇省糯玉米的主要雜優(yōu)模式之一。第Ⅲ組代表品種鄭黃糯2號(hào)，其母本鄭黃糯03來源于鄭白糯01×鄭58，其父本鄭黃糯04來源于(紫香玉×昌7-2)×昌 7-2， 利用回交轉(zhuǎn)育將糯質(zhì)基因?qū)雰?yōu)質(zhì)普通玉米中，從而獲得糯玉米新品種，是糯玉米早期的主要育種方式之一。第Ⅳ組材料多為甜糯玉米，其代表品種彩甜糯6號(hào)是由白糯玉米自交系T37和紫色甜糯雙隱性自交系WH818雜交選育而來。

不同于普通玉米，糯玉米獨(dú)特的鮮食用途決定了其特殊的農(nóng)藝、品質(zhì)育種目標(biāo)，在滿足產(chǎn)量指標(biāo)的同時(shí)盡可能地兼顧營(yíng)養(yǎng)與口感是育種家對(duì)于鮮食糯玉米新品種的總體要求。分析不同遺傳背景下糯玉米材料的農(nóng)藝、品質(zhì)性狀差異，能夠在為育種家和育種單位提供導(dǎo)向作用的同時(shí)有效利用育種資源，有助于優(yōu)良品種的選育。本研究通過SSR標(biāo)記明確了41份糯玉米區(qū)試材料的遺傳背景，利用非參數(shù)檢驗(yàn)分析不同遺傳背景下糯玉米的農(nóng)藝與品質(zhì)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)組間存在顯著差異的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，其中籽粒鮮質(zhì)量為主要的產(chǎn)量性狀之一，含水率則與糯玉米的品嘗口感呈顯著負(fù)相關(guān)。4個(gè)遺傳背景不同的組群在產(chǎn)量、品質(zhì)性狀上表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)：在產(chǎn)量性狀方面，聚類Ⅰ組表現(xiàn)優(yōu)異，千粒鮮質(zhì)量高于其他組別，平均產(chǎn)量也高于另外3組；其中Ⅰ組代表品種京科糯2000通過了國(guó)家和20多個(gè)省份的審定，與其他組代表品種相比，其在區(qū)域試驗(yàn)中所測(cè)千粒鮮質(zhì)量、產(chǎn)量均表現(xiàn)優(yōu)異。從品嘗口感的角度看，聚類Ⅱ組的含水率較低，且組內(nèi)品種皮渣率均值也較低，表現(xiàn)出較好的適口性。本研究基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記、分子標(biāo)記首次分析了東南地區(qū)糯玉米區(qū)試材料在不同遺傳背景下農(nóng)藝及品質(zhì)性狀表現(xiàn)，可供參考的研究報(bào)道較少，其結(jié)果可為今后全面了解該地區(qū)糯玉米不同雜優(yōu)模式所育成品種的農(nóng)藝及品質(zhì)性狀特點(diǎn)提供依據(jù)。